大鼠脑穹窿下器官微量注射AngⅡ对肾近球小管Na～+_K～+_ATP_ase功能

　3 基金项目 : 四川省教育厅科研基金 (2006c015) ; 南充市重点科 技项目 (N20062SF003) 收稿日期 : 2006208223 ; 修回日期 : 2007211223 作者简介 : 刘　红 (19742) , 男 , 四川巴中市人 , 硕士 , 讲师 , 主 要从事肾脏病发病机制方面的研究。△通讯作者 , E2mail : gy60211 @ yahoo1com1cn 大鼠脑穹窿下器官微量注射 Ang Ⅱ 对肾近球小管 Na + , K+2ATPase功能的影响 3 刘 　红1 , 罗 　蕾2 , 高 　原2 △ (11 川北医学院 , 四川 南充 637100 ; 21 遵义医学院珠海校区 , 广东 珠海 519041) 摘要 　目的 : 探讨大鼠穹窿下器官 (SFO)对外周肾小管钠泵的调节作用及机制。方法 : 在 SFO 分别微量注射血管 紧张素 II(AngII) ,其中氯沙坦 (losartan)组先用 AngII 的 1 型受体 (A T1)拮抗剂 losartan 预处理后再注射 AngII ; 放 免法检测血清中内源性洋地黄样物质 ( EDL S)的水平和血浆 AngII 水平 ; 微分离大鼠肾脏单根近球小管 ,液闪法测 定小管管周膜钠泵活性。结果 : ①SFO 注射 AngII 后 ,血清中 EDL S在 15 min 开始升高 ,约 60 min 达高峰 ; ②肾近 球小管钠泵活性在 SFO 注射 AngII 后 30 min 和 60 min 都显著下降 ; ③用 losartan 预处理 SFO 后 ,再注射 AngII ,血 清 EDL S水平升高和小管钠泵活性下降的效应被显著削弱。结论 : 大鼠 SFO 注射 AngII 后 ,肾近球小管钠泵活性 将下降 ,原因可能与 SFO 注射 AngII 后 ,激动 SFO 的 A T1 受体 ,直接或间接升高血清 EDL S水平有关。 关键词 : 　血管紧张素 Ⅱ; 　穹窿下器 ; 　近球小管 ; 　内源性洋地黄样物质 ; 　钠泵 ; 　大鼠 中图分类号 : Q491 文献标识码 : A 文章编号 : 100026834 (2008) 022229204 　　前脑的穹窿下器官 (subfornical organ , SFO)是环 绕第三脑室的室周器官之一。大量研究表明 ,SFO 是 整合心血管活动、调节机体水盐摄入与排出平衡的重 要中枢[1 ] 。激动 SFO 的血管紧张素 II(angiotensin II , AngII)的 1 型受体 (AT1) ,可引发动物的饮水和嗜盐 行为 ,但是 ,至今这一机制尚未阐明。 肾小管 ,特别是近球小管管周膜上的钠泵是机 体水盐调节的最终环节。因此 ,应该把肾小管钠泵 活性的改变作为激动 SFO 的 A T1 后 ,影响肾脏排钠 功能的一个重要环节来加以研究。虽然影响钠泵活 性的因素很多 ,但是内源性洋地黄样物质 (endoge2 nous digitalis2like substance , EDL S)作为钠泵的天然 配体 ,两者能发生高特异性、高亲和性的可逆结合 , 结合后抑制后者的 A TP 酶活性[2 ] 。下丘脑室旁核 和视上核是 EDL S 最主要的中枢来源 ,而 SFO 与下 丘脑室旁核和视上核又有密切的纤维联系[3 ] 。本 实验在 SFO 微量注射 AngII ,分离单根近球小管 ,液 闪法测定小管钠泵活性 ,并检测血清 EDL S 水平变 化 ,旨在进一步明确这一机制。 1 　材料与方法 111 　主要试剂及仪器 AngII与 EDL S 放免分析试剂盒 (北京北方 所) ; Losartan (美国默沙东公司馈赠) ; [γ232 P ]A TP (北京福瑞特生物工程公司 ) ; 胶原酶 , AngII , Na2A TP ,丁酸盐 , HEPES , EGTA (均为 Sigma 公 司) 。配制人工脑脊液 ( aCSF) [4 ] ; AngII 微注液 : 用 aCSF 液配制 ,终浓度为 20 ng·250 nl21 ; Losartan 微注液 : 用 aCSF 液配制 ,终浓度为 5μg·250 nl21 。 振荡 切 片 机 ( 美 国 O TS24000 ) ; 微 泵 ( 美 国 SP100iz) ; 脑立体定位仪江湾 I 型 C(第二军医大学 校产部) ; SN26100 型γ计数器与 SN26930A 型液体 闪烁计数器 (上海核所日环光电仪器有限公司) 。 112 　实验动物与分组 健康雄性 SD大鼠 ,体重 (250 ±15) g ,广东省医学 实验动物中心提供 ,SPF 级。实验大鼠随机分为三组 ( n = 36) : aCSF组 ,AngII 组 ,losartan 组 ,每组分成 6 小 组 ,每小组 6 只分别在 SFO 第二次注射完毕后 15 min、 30 min、45 min、60 min、75 min、120 min 取血液 (均在左 肾动脉灌注前从腹主动脉采血) 、肾脏和脑标本。另取 6只大鼠作 SFO 插管但不注射 ,测得的指标作为 SFO 注射前对照组(0 min 组) 。 113 　SFO 定位与微量注射及注射位点的确认 大鼠腹腔内注射 1 %戊巴比妥钠溶液 (40 mg· kg21)麻醉。将麻醉动物颅平位固定于脑立体定位 仪上 ,暴露前囟。SFO 定位按照包新民著大鼠脑立 体定位图谱 ,坐标为 : 前囟前 016 mm ,旁开 0 mm , 脑表面下 416 mm。颅骨钻孔后插入不锈钢导管 922 中国应用生理学杂志 ,2008 ;24 (2) (外径 014 mm ,内径 012 mm) ,导管前端定位于坐 标上方 1 mm ,待稳定 10 min 后 ,插入外径为 012 mm 的玻璃细管 ,玻璃细管尖端在导管前端下 1 mm ,玻璃细管另一端与微泵相连 ,用以微量注射。 每只大鼠 SFO 分两次注射完毕 , aCSF 组为 aCSF (250 nl) + aCSF (250 nl) ,AngII 组为 aCSF (250 nl) + AngII (250 nl) ,losartan 组为 losartan (250 nl) + AngII (250 nl) ,间隔 10 min ,用微泵于 1 min 匀速注 射 ,注射完毕后留针 5 min ,再注射 100 nl 的伊 红[5 ] 。 大鼠脑经 4 %多聚甲醛液固定好后 ,用振荡切 片机 ,按与冠状切面平行的方向 ,经前脑作连续振荡 切片 ,切片厚度为 50μm ,明胶固定于载玻片上 ,自 然干燥 ,随后做克紫染色 ,最后根据针道轨迹末端或 伊红的位置判断注射是否准确 ,不准确者数据去除。 114 　单根肾近球小管的获取及其钠泵活性测定 参照我们以前的方法获得大鼠单根近球小管并 测定单根小管钠泵活性[4 ] : 大鼠肾脏经胶原酶消化 后 ,体视镜下微分离单根小管 ,小管经低渗冻融处理 后 ,用 A TP 酶测定液与单根肾小管共同孵育 ,液闪 测定32 Pi 的 cpm 值 ,利用公式计算 Na + , K+2A TPase 的活性 ,酶活性用单位长度小管单位时间水解 A TP 释放的无机磷的数量来表示 (pmol·mm21·h21) 。 115 　统计学处理 实验数据以均数 ±差 ( …x ±s ) 表示 ,用 SPSS1010 软件进行组间 t 检验 ,二元变量相关分 析。 2 　结果 211 　SFO 注射 AngII对血浆 AngII水平的影响 与注射前 0 min 组血浆 AngII 水平比较 ,aCSF 组、AngII 组和 losartan 组在上述各时间点的血浆 AngII 水平均无显著性差异 ( P > 0105 ,表 1) 。 　 Tab11 　Effects of the plasma AngII level afterad ministration of AngII into SFO of rats(pg·ml21 , …x ±s) Group 0 min 15 min 30 min 45 min 60 min 75 min 120 min aCSF 12816 ±917 12718 ±817 12615 ±716 12915 ±914 12815 ±815 12617 ±916 12715 ±716 Ang Ⅱ 12816 ±917 12912 ±818 12719 ±916 12718 ±915 12712 ±915 12914 ±918 12719 ±819 Losartan 12816 ±917 12615 ±814 12912 ±917 12518 ±915 12812 ±817 12813 ±919 12810 ±817 212 　SFO 注射 AngII后对血清 EDLS水平的影响 与 SFO 注射前血清的 EDL S 水平比较 ,注射 aCSF 后 ,血清 EDL S 水平均无显著性差异 ( P > 0. 05) 。与 aCSF 组比较 ,AngII 组大鼠在注射后 15 min 血清 EDL S 显著增加 ,60 min 增高达到峰值 , Losartan 组血清 EDL S 水平升高的效应消失 (表 2) 。 Tab12 　Effects of the serum EDL S level after administration of AngII into SFO of rats(pg·ml21 , …x ±s) Group 0 min 15 min 30 min 45 min 60 min 75 min 120 min aCSF 4815 ±715 4712 ±712 4913 ±811 4810 ±614 4916 ±814 4911 ±616 4814 ±518 Ang Ⅱ 4815 ±715 5515 ±713 3 6516 ±917 3 7313 ±1014 3 8516 ±1216 3 6814 ±713 3 4715 ±612 Losartan 4815 ±715 4812 ±618 4618 ±613 4619 ±515 4517 ±712 4618 ±716 4818 ±818 　　3 P < 0101 vs aCSF group at the same time point 213 　SFO 注射 AngII 后对近球小管 Na + , K+2AT2 Pase 活性的影响 SFO 注入 aCSF 后 ,30 min、60 min 测得的近球 小管钠泵活性分别为 (1787 ±141) pmol·mm21·h21 和 (1850 ±157) pmol·mm21·h21 ,而注射 AngII 后 30 min 和 60 min , 近球小管的钠泵活性分别为 (1585 ±121) pmol·mm21·h21和 (1127 ±104) pmol·mm21· h21 。与注射 aCSF 比较 ,SFO 注射 AngII 后 30 min 和 60 min 近球小管钠泵活性均显著下降 ( P < 0101) 。如果 SFO 用 losartan 预处理 ,再注射 AngII 后 ,近球小管钠泵活性下降的效应消失 (图 1) 。 Fig1 1 　Na + , K+ 2A TPase activity of proximal tubules on 30 min and 60 min after adminstration of AngII into the SFO of rats33 P < 0101 vs aCSF group at the same time point 032 Chin J Appl Physiol 2008 ;24 (2) 　 214 　大鼠血清 EDLS 水平与近球小管 Na + , K+2 ATPase 活性的相关性分析 通过对大鼠 ( n = 42) 测得的肾近球小管 Na + , K+2A TPase 活性结果与相应血清 EDL S 水平进行 直线相关分析 ,结果显示两者呈显著负相关 ,相关系 数 r = - 01938 , P < 0101 (图 2) 。 Fig1 2 　Correlation of various levels of serum EDL S with proxi2 mal tubules Na + , K+ 2A TPase activity ( r = 201938 , P < 0101) 3 　讨论 免疫组织化学的研究表明 , SFO 有大量 AngII 阳性纤维 ,也有密集的 A T1 [6 ] 。激动 SFO 的 A T1 可 促进肾脏对钠和水的排泄[7 ] 。肾小管的管周膜上 的钠泵是钠的重吸收动力蛋白 ,本研究的结果显示 , 在大鼠 SFO 注射 AngII 后 30 min 和 60 min ,近球 小管的钠泵活性显著降低。此结果揭示 ,AngII 作 用于 SFO 后 ,可以抑制近球小管的钠泵活性。用 losartan 阻断此区域的 A T1 ,可完全消除因 SFO 注 射 AngII 引起的近球小管的钠泵活性降低。因此推 断 ,脑内 AngII 抑制近球小管的钠泵活性的作用 ,是 通过 SFO 的 A T1 介导的。 由于 SFO 和其它室周器官都是血2脑屏障和血2 脑脊液屏障薄弱的部位 , 中枢和外周循环中的 AngII 都可以作用于 SFO 的 A T1 ,影响心血管活动 和水、盐平衡[8 ] 。研究的结果显示 ,在大鼠 SFO 微 量注射 AngII 后 ,血浆 AngII 水平并未发生显著性 变化。此结果提示 ,AngII 作用于 SFO 后 ,远距离 抑制近球小管的钠泵活性 ,并非是通过升高外周 AngII 水平而实现的。 关于 AngII 作用于 SFO 的 A T1 后 ,远距离抑制 肾小管的钠泵活性中间途径 , EDL S 是值得研究的 一个重要因素 ,这不仅因为 EDL S 作为内源性的天 然配基 ,可抑制钠泵活性 ,还由于下丘脑的视上核和 室旁核是释放 EDL S 的中枢部位[3 ] ,而 SFO 与视上 核和室旁核相互又有密切的纤维联系。本研究观察 到 ,大鼠 SFO 注射 AngII 后 15 min ,血清 EDL S 水 平即显著上升 ,并在注射后 60 min 达高峰 ,然后回 降 ,在注射后 120 min 才恢复到对照水平。用 losar2 tan 阻断 A T1 ,血清 EDL S 水平上升的效应消除。这 些结果提示 , AngII 激动 SFO 的 A T1 后 ,促进了 EDL S的释放。通过相关分析发现 ,大鼠的血清 EDL S 水平与近球小管的钠泵活性呈显著负相关。 总之 ,AngII 作用于 SFO 的 A T1 后 ,可以抑制 肾小管的钠泵活性 ,这种抑制作用的中间途径可能 是 EDL S 释放增加。 致谢 : 本研究得以完成 ,需要衷心感谢美国默 沙东公司免费提供氯沙坦试剂 ,广州医学院神经科 学研究所给予的宝贵技术支持和仪器的使用。 4 　参考文献 [1 ] 　Wang J M , Veerasingham S J , Tan J , et al1 Effects of high salt intake on brain A T1 receptor densities in Dahl rats[J ]1 A m J Physiol Heart Circ Physiol , 2003 , 285 (5) : H1949219551 [2 ] 　Martinka E1 Endogenous digitalis2like substance1 I1 Ba2 sic characteristics[J ]1 V nit r L ek , 1995 , 41 (9) : 6372 6431 [3 ] 　Takahashi H , Matsusawa M , Ikegaki I , et al1 Digita lis2like substance is produced in the hypothalamus but not in the adrenal gland in rats[J ]1 J Hypertens , 1988 , 6 (suppl 4) : S34523471 [4 ] 　罗 　蕾 , 刘 　红 , 高 　原 . 大鼠侧脑室注射血管紧张 素Ⅱ抑制近曲小管 Na + , K+ A TPase活性 [J ]1 遵义医 学院学报 , 2005 , 28 (3) : 23122341 [5 ] 　Budzikowski A S , Leenen F H1 AN G II 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GAO Yuan2 (11 North Sichuan Medical College , Nanchong 637100 ; 21 Zhuhai Campus of Zunyi Medical College , Zhuhai 519041 , China) ABSTRACT Aim : To investigate the effect of micro2injection Ang Ⅱinto the subfornical organ (SFO) on the proximal tubules ( PT) Na + , K+ 2A TPase activity in rats and its mechanism1 Methods : SFO in SD rats was administrated respectively with Ang II (20ng) , or losartan(5μg) and AngII (20ng) successively1 The levels of serum EDL S and plasm AngII were assessed with radioimmunoassay (RIA) 1 The PT segments were microdissected freehand and their Na+ , K+ 2A TPase activities were assessed by liquid scintillation counter (L SC) 1 Results : The serum EDL S levels increased significantly compared with aCSF group after SFO administration with AngII ; The Na + , K+ 2A TPase activities in PT segments decreased significantly at 30 min and 60 min after SFO administration with AngII1 There was a negative linear correlation between serum EDL S level and the Na+ , K+ 2A TPase activity of PT segments in rats administrated with AngII(r = 201938) 1 Conclusion : Inhibition of the Na + , K+ 2A TPase activity in PT as a result of administration of AngII in SFO is mediated by A T1 receptors1 The increase in EDL S release may play an important role in this inhibition1 KEY WORDS :　subfornical organ ; 　angiotensin II ; 　proximal tubule ; 　Na + , K+ 2A TPase ; 　endogenous digitalis2like sub2 stance ; 　rat (上接第 146 页) AH109 酵母菌中 ,通过 Trp 营养缺陷筛选表明 : 带有 Trp 营 养筛选标记的重组表达质粒已成功转染入 AH109 菌中 ; 通 过 Trp、Leu、His、Ade 四重营养缺陷平板检测无菌落生长 ,表 明 : p GB KT72TACE对基因 His、Ade 没有激活作用。若 p GB KT72TACE能激活报告基因 His、Ade ,则出现了假阳性 , 即单独的 BD 诱饵载体 ,不需要与 AD 融合蛋白结合就可以 自激活酵母双杂交系统中的 GAL4 ,从而导致报告基因 Trp、 Leu、His、Ade 都能够得以表达 ,后续的双杂交筛选检测则无 意义。在检测 BD 诱饵蛋白的毒性实验中 ,转化了 BD 诱饵 蛋白的酵母菌 AH109 能在 SD/ 2Trp/ Kan(50μg/ mL) 培养基 中大量增殖 ,证明 BD 诱饵蛋白对酵母菌 AHl09 无毒性作 用 ,因此可以得出结论 : p GB KT72TACE对 AH109 生长无毒 性 ,也无报告基因的自主激活作用。上述结果为本实验进一 步采用酵母双杂交方法从小鼠 cDNA 文库中筛选出与 TACE胞内区相互作用的蛋白分子奠定了重要的实验基础。 需要指出的是 ,酵母双杂交系统的蛋白质2蛋白质作用发生 在细胞内而非细胞膜上 ,因此 ,用于本研究仍有一定程度的 局限性 ,筛选出的蛋白可能是膜受体蛋白 ,也可能是受体蛋 白的某个功能域 ,还可能是与蛋白在细胞内复制过程中有相 互作用的一些蛋白质 ,因此增加了筛选后鉴定的难度。尽管 如此 ,在目前还没有更好的系统或方法之前 ,酵母双杂交系 统用于蛋白质相互作用的研究仍然值得一用。 4 　参考文献 [1 ] 　Schlondorff J , Becherer J D ,Blobel C P , et a11 Intra2 cellular maturation and localization of the tumour necro2 sis factor alpha convertase ( TACE) [ J ] . 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