0-黑曲霉酸性蛋白酶稳定性研究

第 5 J；lI(总第 l56舢) № 5fSeria1№ l56) 福 建 轻 纺 The Lighl＆ Textile Indus Lrles of Fujian 2OO2年 5月 M^Y．2002 恩固雷圜略宦回囤噙窟略四院 陈王芹，李素萍，黄鹭强，谢必峰 ，吴松刚 (福建师范大学 生物学院 福建 福州 350007) 摘 要：通过黑曲霉 固体发酵生产酸性蛋 白酶 ，对此酸}生蛋白酶的部分酶学稳定性 (耐热 、耐 酸性 、金属离子稳定性等)进行实验探讨。实验表明：该酸性蛋白酶制剂具有良好的热稳定性与较 强的耐酸性，还具有 良好的金属离子稳定性 ，完全适合作为饲料酶制剂。 关键词 ：黑曲霉 ；酸性蛋 白酶 ；稳定性 中国分类~-：TQ925 文献标识码 ：A 文章编号：1007—550X(2002)05—0007—03 O引 言 酸性蛋白酶由于具有能快速有效地协助动物分解饲料中的大分子物质一蛋白质，提高利用 率．改善其营养，提高养分消化率而被广泛应用于畜禽饲料中 ”。采用黑曲霉，通过固体或液体发 酵法生产酸性蛋白酶，我国在 8O年代初已开始进行研究。近年来，随着酸性蛋白酶应用范围的扩 大，尤其是作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出来的潜在功能，越来越引起人们 的关注 人们对酸性蛋 白酶的热稳定性研究较多 ，而对其在畜禽 胃肠道中的稳定性研究较少。作为 饲用酶制剂 ，它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理 、经受动物 胃肠道 胃酸的影响，而且还要受 饲料中的部分金属离子的影响，而在这些过程中，其酶活极易受损 ，从而影 响其作为饲用酶制剂的 特性 。为此，我们选育了具有优良特性的黑曲霉产生菌，通过固体发酵产生酸性蛋白酶，该酶具 有较高 的酶括单位。本文通过实验探讨 了温度、pH、金属离子对该酸性蛋 白酶活力的影响。现报导 如下。 l和 1．1酸性蛋白酶制剂的制备 采用由福建师范大学生物工程学院选育的黑曲霉产生菌，通过固体发酵．在以麸皮为主的培 养基 、28℃下发酵培养，66h后终止 。于 45～50％烘干，经粉碎过筛，即为该酸}生蛋白酶制剂 。 1．2药品及仪器 1．2．1分析试剂：福林试剂、三氯己酸、碳酸钠 、乳酸c80％ 一90％)、乳酸钠、酪素。 1．2．2主要 仪 器 ：721型 分光光度 计 、恒 温水 浴锅 、电子天平 、移液 嚣。 1．3酶活的测定方法 1．3．1酶液制备 ：取酶粉用 pH=3．5的乳酸一乳酸钠缓冲溶液浸提 30min，用滤纸过滤 ，滤液即为 酶液，供酶活力测定用。 1．3．2酶活力剐定：按 Folin显色法 测定。反应底物为 2％pH：3．5的酪蛋 白溶液。酶活单位定义 ： 在 pH3 5，4O℃条件下 ，每分钟水解酪素生成 lug酪氨酸所需酶量为一个活力单位(U／g)。 2结果与分析 收稿 13期：2002—04—09 作者楠彳r：陈玉芹{1980一)．女，福 建漳州人，福 蛳弛大学生物工程学院 98级本科生 a 维普资讯 http://www.cqvip.com 水禾 高亮 水禾 高亮 水禾 高亮 · 8- 福 建 轻 纺 -2002· 2 1酶的热 稳定性 实验 2 I_l 8O℃ 高温 对酶活 力的 影响 2．I_1 1液 体 酶 实验 将酶慢 出液 (pH=3 5)’ ’j：8O。c下计叫保温 ，不同时I j分别取样铡定其酸性蛋 白酶酶括单 位。以对照酶活为 100％。结果如图 1所示。 一 12O 100 二 8。 魉 60 藿40 20 0 1O 20 30 4C 50 60 时 间 【s J 图 1 液体状态下 80℃对酶活力的影响 从 图 l可见 ，液体酶经 8O℃处理 30s后 ，酶活降至 77．8％；40s后 ，酶活急剧 F跌 ；处理 50s后 ， 液体酶基本失活。 2 1．1．2固体 酶 实验 将酶粉置于 8O。c的温度下计时保温 ，在不同时问分别取样测定其酸性蛋白酶活力。其结果如 图 2所示 。 一 1 2O 10O 一 80 担 60 。 罂 20 0 ' 2 3 4 5 时 间 { rain ) 图 2 固体状态下 80℃对酶活力的影响 以对照酶活为 100％ ，制褥 图 2。结果表明 ，8Oq。处理 Imin时，酶话降至 76 14％ ，2min，酶活为 45．14％。表 明固体酶 8O℃处理在 lmin内是相对稳定的。从固体、液体酶实验结果 比较 ，也可看出： 在 8O℃一F固体酶更耐温，而液体酶较敏感。 2．1 2 45℃高温时酶活力的影响 2．1_2．1液体 酶 实验 将液体酶置于45 c下保温，不同时间取样测定其酶活。相对酶活结果如图3所示。 2．1_2．2固体 酶 实验 将 固体酶置于 45℃下保温 ，不同时间取样测定其酶活。相对酶活结果如图 4所示 。 一 120 100 — 80 坦 60 摇 4o 堇 如 O 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 时 间 【rain ) 图 3 液体状态下 45℃对酶活 力的影响 一 '20 1口D 一 8O !}呈 60 谣 40 矗 20 O 0 30 6O g0 12O 1印 伯O 时间 c rain 图 4 固体 状态下 45℃对酶活力的影响 维普资讯 http://www.cqvip.com 水禾 高亮 第 5期 陈玉芹，李素萍 黄鹭强 谢必峰 吴松刚：黑曲霉酸性蛋白酶稳定性研究 ·9· 从图 3中可看出，液体酶经 45~C处理后 ，在一定范围内(1h)相对稳定，而且酶活有上升现象。 图4结果表明：固体酶经 45 处理在所实验 的 180rain内，酶活也相对稳定。而且在处理 90rain和 150min时，酶活反而有所上升。这可能与酶活的激活作用有关。可见 ，45℃无论是对液体酶还是固 体酶基本上没有影响 。表 明该酸性蛋 白酶对 45℃是稳定的。 2．2酶对低 pH的稳定性实验 将 固体酶用乳酸一乳酸钠缓冲液 (pH=3．5)稀释成 100倍 (此为母液)，取母液再用乳酸一乳 酸钠缓冲液(pH=2．5)稀释成 300倍，用pH计测得其最终 pH值为2．87，室温放置，分别在不同时 间取样 ，对其酶活进行测定，结果如图 5所示。 从图 5看出，该酶在 DH2．87时高度稳定 ，而且酶活还有所上升 ，也表现出一定的激活作用。 5o0。 4000 = 3500 船 3001 癌 2500 0 5 10 15 20 25 30 时 {rain 图 5 pH对酸性蛋 白酶稳定性 的影响 2．3金属离子对酶活的影响实验 称取一定量 的酶粉。用 pH：3．5的乳酸一 乳酸钠缓 冲溶液浸提后，再在 1×10 mg／L的 Mg2’、Fe“、K’和 1 X 10。mg／L c ’的溶液中4O℃保温 0．5h，然后按条件测定其酶活力。以对 照酶活为 100％ ，制得图 6。 从图 6看出 ，除 Mg 外 ，实验组的其它离子均有不同程度的抑制作用 ，其 中 K 抑制作用最强 ， 一 1 10o 05 兰 。9。5 l； CK Ca Mg” Fe” 金 屠离 子 图 6 金属离子对酶活力的影响 为 8．9％(低于 10％)。此酸性蛋 白酶对金属离子并不敏感。 3．结论 3．1本酸性蛋白酶对热表现出良好的稳定性。在 8O℃的高温，固体酶在 lmin内，仍保持近 80％的 活性。这对制粒过程具有重要意义。对 45~C表现出高度的稳定性。这对该酶制剂的烘干工艺的研 制有一定的参考意义。 3．2与其他酶制剂一样 ，该酸性蛋 白酶固体酶相对于液体酶对热更具有稳定性。 3．3该酶在 DH2．5～3．0的环境中是稳定的。可 以预计其做为饲料酶制剂 ，动物消化系统中的酸环 境 ，不会对其酶活性构成不利影响。 3．4部分金属离子对该酶活性有一定的抑制作用，但均在 10％以内，在配合饲料中，适当加以注意 即可 。 (下转第 23页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 水禾 高亮 水禾 高亮 水禾 高亮 水禾 高亮 水禾 高亮 第 5期 王锡刚：按照“三个代表“要求进一步加强和改进企业党的建设 ·23· Strengthing and perfecting enterpriseo’ Party building according to“Three Represents” W uang Xi—gang (Fujian Food Industry Ltd．Fuzhou，350001，China) Abstract：This paper illustrates that in the couTse of deepening the reform of state—ownea enterprises， it is imperative to further strengthen and perfect party building according to the“Three Represents put forvoard by Preoident Jiang zemin． Key words：state—owned enterprise；Reform；Pany building． (上接第 9页) 总之 ，本实验表明，该酸性蛋 白酶的稳定性 ，完全适用于作为饲料酶制剂 。 参考 文献 ： Ill 许尧兴，叶玲玲等 ．黑曲霉酸性蛋白酶的固态发酵法研究 I】1．工业微生物，1993，23(6)： 16— 19． 1 2】 李永泉，赵小立等 ．复合水解酶黑曲霉 H 一1固体发酵工艺研究 l川 真菌学报，1995，14 (3)：226—233． 1 3】 邬敏辰 ，李江华等 ．黑曲霉纤维素酶的特性研究 l】J．山西食品工业 ，1997，(4)：l一4，11． 『4】 武金霞，潘延云等 ．饲用复合酶制剂的发酵及应用l】1-河北大学学报，1999，3(9)：3l】一3l3． I 5I 张树政 酶制剂工业 【MI．北京 ：科学出版社 ，1984，446—447页 ． Studies on the stabilization of acid protease Chen Yu—qin 。Li Su—ping， Huang Lu—qiang， Xie Bi—feng， W u Song—gang (Bioengineering Institute，Fujian Teachers University，Fuzhou 350007，China) Abstract： The stabilitv of Acid protease produced by Aspergillus niger WaS studied ， including heat abilitv。acid stability ，metals ion stability，etc．The result shows：The Acid protease has good heat、 acid and Metals ion stability，and is suitable for usage in feeding enzyme- Key word s：Aspergillus niger；Acid protease；stability． 维普资讯 http://www.cqvip.com 水禾 高亮