河南省猪圆环病毒病流行病学调查及病原鉴定

22 中目兽医杂志2007年(锥43卷)第9期 Chinese』oIlrtialofVeterinaryMedicine 河南省猪圆环病毒病流行病学调查及病原鉴定 王江辉，任广志，陈 陆，任向阳，刘 矿，董加才，王川庆 (河南农业人学牧医I’程学院疫病检测中心，河南郑州450002) 中图分类号：$858．285．3 文献标识码：H 文章编号：05296005(2007)09—002202 猪围环病毒Ⅱ型(Porcineeireovirustype2， PCV2)是近年来新发现的猪的一种敛病病原．主要 引起断奶猪多系统衰竭综合缸(Postweaning muhisystemicwastingsyndrome，PMWS)E1J。自 1991年在加拿大首次报道“o以来，世界上许多国家 和地区相继报道此病的发生和流行。“，我国在2001 年报道了-此病的发生o。，并做了分离鉴定。为了r解 河南省的流行情况，本研究室应用ELISA法进行了 血清学检测，并用PCR法做r病原分离鉴定。 1材料与方法 1．1 主要材料①待检血清：来自{可南省10个地区 21个貉场的6j1份血清；诊断试剂：猪圆环病毒酶联 免疫诊断试剂盒(购自华中农业大学动物医学院动物 病毒室，批号为20050315)；②主要酶及试剂：十二烷 基磺酸纳(SDS)、饱和酚，三氯甲烷、异戊醇、TaqDNA 聚合酶、MgCl。、dNTP、i0×Buffer、引物合成、EcoR I酶、DNA凝胶回收试剂盒和蛋白酶K等。 1．2方法 1．2．1发病情况调查20,7)5年]月至2006年1月， 对郑州、焦作、丌封、洛阳、驻马店、甫阳、新乡、周口、 漯河、许昌10个地区发生感染PCV2的18个规模化 猪场，进行临床发病情况调查。 1．2．2血清学调查采取的651份血清按照猪圆 环病毒EI。ISA诊断试剂盒说明书进行检测。 1．2．3DNA模板的制备剖检疑似Pcv2感染的 病猪，取其淋巴结、脾脏、肺脏等组织，按文献[6]的 方法抽提DNA，然后取10儿用作PCR模板。 1．2．4PCR引物根据已发的PCV2基因 组全序列(AY691679)，利用计算机辅助软件 Primer6，0设计了l对PcV2型特异性的PCR引物。 扩增的DNA片段预期长度为457bp，并含有1个型 特有的EcoRI酶切位点，上游gf物P1：55一TTG CACATAGATGGTTA(：AC一37(1077～1096 nt)；下游引物P2：5'-GCGGTGGACATGATG AGA，l，fC一3J(1513～1533ilt)。 1．2．5PCV2型特异性的PCR扩增引物浓度 为20pmol／／lI，，dNTPs每种浓度为2．5mM，MgCl2 浓度为25mM，rTaq酶为5U／pI。，整个PCR反应体 收稿日期：200602-22 作者简介：：EiI．辉(1981一)，男．硬士．从事预防兽医学研究 通汛怍者：工川庆．电话：0371635553,10}E—mail：wchuang 系为50pL。反应成分如下：10×Buffer5tLL，dNTPs 5”L，MgCl24tH，，引物各1ftL，模板DNA10}-L， rTaq酶0．5pL．力u超纯水至50I*L，然后瞬时离心， 进行PCR扩增。94C预变性3min，随后作如下循 环：94℃变性45s，58‘C遐火45s，72℃延伸45s．共30 个循环。循环结束后72C延伸8min，对PCR产物经 1％琼脂糖凝胶电泳榆查PCR扩增产物并拍照。 1．2．6PCR产物的酶切鉴定将PCR产物经l％ 琼脂糖凝胶电泳，切下含有日的条带的凝胶，用 DNA快速凝胶回收试剂盒【旦|收。在20"I。反应体系 中加入回收产物12．0pL，10×HBuffe缓冲液2．0 pL，EcoR1．0pL，双蒸水5pL。在37(：酶切lh 后，经l％琼脂糖凝胶电泳检查酶切片段并拍照。 2结果与分析 2．1 临床发病情况调查结果在渊查发病的18个 规模化猪场中．除洛阳、南阳的2个猪场外，其余16个 猪场发病猪群都为s～9周龄的保育仔猪，临床表现 基本一致。多数猪群在断奶后l周赢右，出现进行性 消瘦，被毛粗乱，采食量F降，生长迟缓，有的猪出现 黄疸，个别皮肤苍白，有拉稀症状；有3个猪场的猪出 现呼吸困难，喘气，呈腹式呼吸。剖检病猪和死亡猪主 要表现全身淋巴结肿大、其中腹股沟、肠系膜淋巴结 肿大3～5倍，肺脏肿大，质地变硬；有相当一部分病猪 肺脏有出血点或斑，心肌柔软，凶继发感染引起心包 炎、胸膜炎。由以上情况可卒JJ步诊断这】6个猪场因感 染PCV2而致猪断奶后多系统衰竭综合征(PMws)。 此病发病率10％～60％，死产率20“～65％。 洛阳、南阳的2个猪场在育肥期的猪出现皮炎 症状，猪群在保育期基奉正常，在12～16周龄发病， 后期形成黑紫色n起烂斑，发病猪剖检表现全身淋 巴结肿大，肾脏肿大呈上黄色，可初步诊断为由 PcV2引起的猪皮炎与肾病综合征(PDNs)。此病发 病率5％～15％．死亡率较低。 2．2 Ef．ISA检测结果(见表1)血清样品来自10 个地区的21个猪场，共榆测血清651份，阳性血清 157份，阳性率24．1％。其中经产母猪阳性血清50 份，阳性率16．9％；后箭母猪阳性血清13份，阳性率 12．1％；断奶仔猪阳性『|iL清94份，阳性率38．7％。各 地区的阳性率高低不等，尤其是断奶仔猪阳性率最 低5．0％，最高达60．0％。 2．3病料中DNA的PCR扩增及酶切鉴定以 PCV2型特异性引物扩增3个地区发病猪场病料组 万方数据 织巾的病毒DNA，扩增结果々预期457bp卡H符(见 罔1)；用EcoRl对PCR扩增产物进行酶切浆定，结 中国兽医杂，蓦9007年(革{3卷)第9蛸23 果袁明PCR产物可被酶切成与预期相符的3,1,Ibp 和113bp两条片段(见图2)。 表l 猪圆环病毒病血清学调查 (头份) 地区 检测 总数 55 86 74 62 48 50 90 78 40 68 651 阿『性 总数 —— 19 2j 18 ii 0 1 6 1 7 l7 l： 13 l 57 郑卅l 焦作 开封 漭陌I 驻乌店 南阳 新乡 周口 漯河 许吕 合计 阳|牛半 (“) 345 213 7．7 1 8 9 320 18 9 2l8 30．0 0．I 211 经产母猜 榆测数 m性牢(％) 20 20．0 40 17．5 36 13．9 3(} 133 20 30．0 25 16．0 42 21．4 32 29．1 l6 12．5 3,／8．8 295 16．9 后备母猪 检测数 阳性率(虻) 8 25．0 14 0 12 16 7 10 10，0 8 25．0 10 30．0 1 5 0 12 0 7 143 12 【6．7 108 12．1 ——断奶堑笙 榆测数 阳性率(％) 图l PCV2特异DNA片段的PCR扩增 MMarkernI2 000；1^一0检测样品； 4：刚性对照；5：|{|了性对照 图2 PCR产物的EcoRl酶切鉴定 M：MarkerDL2OOO；l～3：PCR产物的EⅢRI酶切 4阴性对照产物的EcoRI酶切 3小结与讨论 3，1 从河南省lo个地区猪疫病的流行病学调查及 实验窜诊断来看，PCV2感染引起的猪病在河南省 已相当普遍，上要是猪断奶后多系统衰竭综合征严 重影响养猪业，已给规模化猪场造成r相当火的经 济损失。 3．2在病原PCR鉴定过程中．从l头3同龄的病猪 组织中检测到PCV2，此病毒是经胎盘传播或是产后 感染PCV2使发病R龄提前，有待进一步研究。 3．3因PCV2有严重的免疫抑制特性，影响猪的免 疫功能．使猪群对其他病原体的抵抗能力下降。在调 查的猪场巾，猪群中经常继发感染副猪嗜血杆菌、链 球菌等细菌，使发病猪群的死亡率增高，个别猪场死 亡率高达40％。这与环境卫生和猪群的日常保健有 很大的关系。 3．4在调查的猪群中，混合感染日趋严重，病原逐 渐增加，PCV2能和PRRSV、PRV、PPV等病毒混合 感染．并有一定的协同作用．使得这蝗病毒利用其破 坏性，导致更严重的免疫抑制和机体组织损伤。 3．5 和福建”、甘肃”一等省血清学凋查相比较．母 猪的阳性率均在10％～20％之问，但仔猪的阳性率 河南省高于其他省，这必须引起猪场的高度重视。并 且发现，在断奶前后猪群保健工作做得好的猪场，阳 性率明娃低于其他猪场。 参考文献： [1]GordonAthm。Sl¨enKrakowka，JohnEllis．TickingIirr,e bombJ-PigProgress．2002，18(j)：141 5 [2]TischerI，blieldsW．WolfD，etal St,idles。nepidemio[ogy andpathogenicityofp。rcmeclr⋯¨T1Lr-JjlArchVirol，1991，(3 4)：271276 13 MeehanBM．McNeillyF，McNairI，etal Isoh,t；or⋯ll characlerizationofporcinccircovirus2 from(。t±⋯of㈣ aborlionandpmcincdcrmadtismid¨eD}iropaihysyndlolll．c iJ ArchVir01．Z001．H6(4)835—842 ：4]MankcrtzA，DoraingoM，FoIchI，“a／．Charactcrisatioaof PCV2 isolatesfromSpain，GermanyandFrance[J：Virus Res，2000，66(1J：65 77． [5]曹胜波，陈焕春，肖少波，等猪环状病毒2型PCR检测山法的 建立和应用D]。p囝兽医科技，2002，13(2)：2527 [6]J萨姆布鲁克，Dw拉塞尔分子克隆襄验指南(第3版) [M]．北京：科学出版社．20028 [7：林琳．江斌，吴胜台，等．200,1年福建省部分地慝猪圆环病毒病 血清学调查[J]福建畜牧兽医．2005，27(3)：19 20． [8]宋建国，高生智，魏润生．等规模亿结场猪圆环病毒2型感染 的血清学调查H‘中国泞医科技，200434(12)：2628． 1 3 3 0 O 2}^7懈雨舵”0∞抖龃们；雩鹅盯弛踞盟∞¨弱弘"挖蝴 万方数据 河南省猪圆环病毒病流行病学调查及病原鉴定 作者： 王江辉， 任广志， 陈陆， 任向阳， 刘矿， 董加才， 王川庆 作者单位： 河南农业大学牧医工程学院疫病检测中心,河南,郑州,450002 刊名： 中国兽医杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)： 2007,43(9) 被引用次数： 3次 参考文献(8条) 1.M eehan B M;M cN eilly F;M cN air I Isolation and characterization of porcine circovirus 2 from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome[外文期刊] 2001(04) 2.Tischer I;Mields W;Wolf D Studies on epidemiology and pathogenicity of porcinecircovim 1991(3-4) 3.Gordon Allan;Steven Krakowka;John Ellis Ticking time bomb 2002(05) 4.宋建国;高生智;魏润生 规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查[期刊]-中国兽医科技 2004(12) 5.林琳;江斌;吴胜会 2004年福建省部分地区猪圆环病毒病血清学调查[期刊论文]-福建畜牧兽医 2005(03) 6.J 萨姆布鲁克;D W 拉塞尔;T 曼尼阿蒂斯;王嘉玺,朱厚础 分子克隆实验指南 2002 7.曹胜波;陈焕春;肖少波 猪环状病毒2型PCR检测方法的建立和应用 2002(02) 8.M ankertz A;Dom ingo M;Fo lch J Characterisation of PCV 2 isolates from Spain,Germany and France [外文期刊] 2000(01) 引证文献(3条) 1.陈金山.吴玉苹.陈俊杰.葛亚明.安志兴.李任峰.银梅.王丽荣.胡建和.张智勇 猪圆环病毒病临床表现类型及其防 治[期刊论文]-贵州农业科学 2010(9) 2.陈金山.陈俊杰.吴玉苹.安志兴.葛亚明.银梅.王丽荣.胡建和 猪圆环病毒感染组织灭活苗的临床应用效果观察 [期刊论文]-动物医学进展 2009(11) 3.王宏魁.彭志锋.孙彦婷.徐雪.刘春生.刘慧敏.王川庆 猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及应用[期刊论文]-河 南农业科学 2009(1) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsyzz200709008.aspx