富马酸二甲酯对微生物生长和呼吸的抑制作用

{； ， ， — s 《食品与发酵工业》 富马酸二甲酯对微生物生长和呼吸的抑制作用 L／ 汪海洪 包杰 中 宁正祥 邝荣泽 一 — — — — 一 — — — — — — 一 (华南理工大学 食品工程系) 摘 要：用分光光度法和氧电极法分别对细菌的生长和酵母菌的呼吸作用进行了灏l定．以探讨富马 酸二甲酯(DMF)的抑菌效果、影响固素和抑菌机理。结果表明，DMF对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均 有显著的抑制作用 。微生物在生长迟滞期对 DMF极为敏感 ，而在对教期和稳定期则敏感性下降。对微生 物呼吸代谢动力学的研究结 果表明，DMF主要是通过抑制镘生物的三羧酸循环而发挥抗菌作用。对烷烯 基酲酯类的抗苗效果的比较研究表明，n，R一不饱和结构是这类物质表现抗菌活性 的重要结构特征。 关键词 ：富马酸二甲酯 ，抑菌作用，食品防腐剂 细菌、酵母菌和霉菌等微生物的侵袭 导致食品腐败变质，使人类蒙受重大经济 损失。食品防腐剂作为保藏食品的一种有 效的辅助手段 ，在今后一段相当长的时期 内，还将继续广泛地发挥作用。目前使用的 食品防腐剂主要有山梨酸及其盐类、苯 甲 酸及其盐类和苯甲酸酯类等，但由于它们 的种种局限 ，还不尽人意，安 全、广谱有效 的食品防腐荆仍是当前探求的目标。早在 1940年 ，Seade和 Tisda|e就发现富马酸二 甲酯(DMF)有抗菌作用 ]。1984年北京营 养源研究所对 DMF的防腐效果进行了研 究，发现它对霉菌有特殊抑制效果，并具有 低毒、广谱抗菌的特点0 1987年美国农业 部的研 究发现 DMF对 肉毒梭状芽孢杆菌 也有很好的抑菌效果 ]。但到 目前为止，关 于该防腐剂的抑菌机理还很不清楚 因此 ， 对 DMF的抑菌作用进行探讨 不仅具有理 论意义，而且还可 为新型食 品防腐剂的研 制和开发提供有关参数和实践依据。 本文报道了 DMF对微生物的生长和 呼吸动力学的作 用，对一些 防腐剂的抑苗 效果进行了比较 ，初步探讨了 DMF的抑菌 机理及其影响因素。 材 料 与 方 法 一 、供试菌种 大肠杆菌 (船 础 )、金 黄色葡 萄球菌(一 印 a~ceus)办本系微生物 实验室保存菌种 。酿造酵母 (s ^ )为市售即发干酵母。 二、培养基 1．肉汤培养基：牛肉膏 0．5 ，蛋 白胨 1 ，葡萄糖 1 ，氯化钠 0．5 ，pH7．6～ 8 2．酵母培养基：蛋 白胨 2％，酵母浸汁 l ，葡萄糖 2 ，pH5．5～5．8。 三 生长抑制实验 细菌生长量用 721型分 光光 度计测 定 ]。将适量细菌培养液加入无菌培养基 中．使所得菌体悬浮滚在 560rim处 的吸光 度 A 为 0．05左右 。添加一定量的防腐剂 至所需浓度 放入 37℃恒温箱中培养 定 一 ～ ㈣ 鼯 _骂 Ⅲ 叽 叽 l至 ＆ 删 t ●■f 维普资讯 http://www.cqvip.com 时测定 A一值 ，以不含防腐剂的无菌培养 基作为空白对照。某时刻 t时的抑菌率 ( )用下式计算 ：： 其中．A I和 分别为作对 照的样品在 培养时 间为 0和 t时的吸光度．山． ．．分 别为舍防腐剂的样品在培 养时问为 0和 时的吸光 度 。 四、呼吸抑制实验 用 SP 2型溶氧测定仪 测定菌体悬浮 液 中的溶氧量一 。在 30C下将干酵母在酵 母 培养基中活化 6h．离心收 集菌体．用生 理盐水洗涤两次后再用生理盐水悬浮，使 每 1 00ml菌体悬浮液中约含 lg菌体 低温 保存备用。测定时在反应杯 中加入 1．5ml 磷酸盐缓冲液(0．1m0J／J，pH7．2)、0．5ml恢 复至常温的上述菌体悬浮液和 0．2ml葡萄 糖溶液 (1 )。露空搅拌 5分钟后开始测 定。抑制剂用微型注射器注入反应杯中。由 于菌体悬浮液中溶氧量的变化可以求出菌 体呼吸速率 根据抑制剂加入前后菌体的 呼吸速率．用下式求 出抑制剂对菌体呼吸 的抑制率 ： 一 曼 × 】00 一—瓦_ 其中， 为抑制剂对菌体呼吸的抑制率 ( )，Ro、见分别为抑制剂加入前、后菌体 的呼吸速率~fimol／g．min)。 结 果 与 讨 论 一 、不同防腐剂的抑菌效果比较 对烧基、烷烯基霞酯 类物质及 山梨酸 钾和苯甲酸钠这两种常规防腐剂进行抑菌 效果比较的结果表明 供试化合物对大肠 杆菌都有抑制作用 ．但 DMF效果最好 抑 菌率超过 60 (图 1) 反丁烯二酸和丙烯 酸也有较好的抑菌效果 丙二酸二甲酯和 丙酸乙酯的抑苗救果相对较差。这说明抗 菌活性与烷烯基酸酯的 “，p一不饱和结构 关系极为密切 有报道指出 ，马来酸二甲酯 和山梨酸钾的抑菌作用也与其 。．B一不饱 和结构有 美 这与我们的结果是 一致 的 2 4 ； 墙莽时问(1I 图 1．不同化台物 (200ppm)~大脑杆菌的 抑菌效果比较 ● DMF Z3．丙烯酸 ▲丙二酸二甲酯 0 山梨酸钾 X反丁烯二酸 ×苯 甲酸钠 口而敢 乙酯 ●空白对照 作为对照的山梨酸钾和苯 甲酸钠的抑 蕾率都很低，原因在于它们都是酸型防腐 剂．抑菌作用主要依靠来 电离的酸 。以盐的 形式加入近 中性的培养液 中．使它们的有 效作用浓度降低，抑菌作用就相应减弱。而 DMF是不带电的分子，这种分子容易穿透 微生物的细胞膜 ，进入细胞中，从而有利于 抑制作用的发挥。 二、影响 DMR抑菌效果的因素 I．DMF浓度 的影响 DMF在 l 00ppm时对大肠杆菌已有显 著抑制效果。随着浓度的增大 抑苗率逐渐 提高 300ppm时 DMF对大肠杆菌几乎达 到完全抑制 ，甚至使菌体细胞出现 自溶 现 象 浓度继续增大 ，自溶随之加剧 (表 1) 这与 Freeze[ 等人的研究结果是一致的 ● -● T● 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 1．不同浓度 DMF对大肠杆菌的 抑菌率( ) 墙养时 DME维度 (ppm) 问 (" 1OO 2O0 300 4OO jOO 500 1200 93．3 96 7 66 7 56．7 70 0 ll 6．7 l10 C 67．6 82．4 89 7 7B．5 92．2 lO】_5 97 I 6 4．5 88．8 95 3 90 5 92．9 97 0 】01．2 4B 3 84．4 98 0 98 0 99．5 l0 ．4 107．3 35 5 8 3 97 0 J04．3 1 0O 0 1 07 1 07．1 J I 21．5 102．5 103．5 1 04 2 1 06 1 06 4 注 ：抑菌率为 1 00 表示微生物没有生长．抑 菌率 高于 100 表示菌体细胞 自溶⋯。 2．DMF对不同菌种的抑制效果 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌通常分别 代表细菌中的革 兰氏阴性菌和革兰氏阳性 菌 。DMF对大肠杆菌的最低抑菌 浓度 为 300ppm(图 1)，而完全抑制金黄色葡萄球 菌需 要 DMF的浓 度在 600ppm 以上 (图 2)。这表明DlMF对革兰 氏阴性菌和革兰氏 阳性菌都有较好的抑制效果．但对大肠杆 菌的最低抑菌浓度低于对金黄色葡萄球菌 的 低抑菌浓度 。这是否意味着 DMF对革 兰 氏阴性菌有更好的抑制效果 ，还需要进 行更广泛的验证 。 暗 时 问 (h】 图 2．不同浓度 DMF对金黄色葡萄球菌的抑制效果 00ppm 0200ppm ×4 00ppm △ 600ppm ×1200ppm 3．热处理对 DMF抑菌效果的影响 DME作为气相 防腐剂使用时可 不考 虑其受热处理的影响 。但国外一些资料报 遭 ，DMF直接添加科食品中也有相当好的 效果0]。我们试验了热处理对 DMF抑菌效 果的影响(图 3)。 图 3．热处理对 DMF抑菌效果的影响 0 0ppm △ 200ppmDMF在培养基杀菌前加八 ● 20OpprnDMF在培养基杀菌后加八 ×200ppmDMF在培养基杀菌后加入， 加热至沸 ．保持 20分钟 结果表明，各种形式的热处理均不同 程度地削弱了 DMF的抑菌效果 ．原因可能 是 DMF在热处理过程中被水解 ，降低 了有 效作用浓度。 4．pH值的影响 DMF的抑菌作 用受 pH值影 响不大 (图 43。pH5时 DNIF对大肠杆菌的抑制很 显著．表明处于不适宜生长环境 中的微生 物对 DMF更为敏感。pH9时菌体在培养末 期生长较快，是因为犬肠杆菌在生长过程 中产酸，降低了培养液的pH值，从而改善 了自身的生长环境。 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 较快。随着氧气逐渐耗尽 ，菌体转而进行无 氧生长 ，对 DMF的敏感性提高 ，菌体数 目 迅速减 步 。 三 、DMF对微生物呼吸的抑制 1．酵母菌的呼吸途径 碘 乙酸、丙二酸和磷酸钠是三种典型 的呼吸途径抑制剂。它们分别抑制酵解途 径 (EMP)、三羧酸循环(TCAC)和磷酸已搪 途径(HMP)。碘乙酸对酵母的呼吸作用抑 制最为显著，碑酸钠的抑制程度最j氐，丙二 酸的抑制效果则介于二者之间(表 2)。 表 2．几种典型抑制剂对酵母呼吸的抑制 2．DMF对酵母呼吸途径的抑制 DMF与典型的呼吸途径抑制剂混用 ， 其结果与DMF单独作用时的结果进行比 较，可判断出 DMF所作用的呼吸途径 ：。 混合使用时 的理论抑制率 由下式计 算： P， 一 Plo+ (1O0 PID)× PI⋯ ／iO0 其中，Plo为典型抑制剂单独作用时的抑制 率 ，PI⋯ 为 DMF单独使用时的抑制率 。由 混和抑制率的实际值 和理论值 目可 求出重叠率。重叠率越大 ，DMF对相应的 呼吸途径抑制越显著。 重叠率 一 × 1O0 从重叠率数据(表 3)可看出，DMF能显著 抑制酵母的呼吸。DMF与丙 二酸混合作用 时，重叠率晟大；与磷酸钠 混合作 用时，重 叠率最 小。这表 明 DMF对 TCAC抑制晟 大 ，其次是 HMP，撮后才是 EMP。换言之， DMF对微生物呼吸的抑制，主要是通过抑 制 TCAC酶系的活性而起作用的。 表 3．DMF对酵母菌呼吸途径的抑制 浓度 抑制率 与 1000~m 重叠率 抑制剂 DMF混台后 ( ppm) ( ) ( ) 的抑制率( ) 啦乙酸 500 42．9 57．0 毒0 丙二酸 600 24．5 27．8 34．9 磷酸钠 500 1 4．2 30．2 1 3 5 】000 24 1 ———— ———— 3．不同底物对 DMF抑制效果的影响 呼吸底物为葡萄糖时 DMF的抑制效 果最差 ，而以柠檬酸、琥珀酸和苹果酸等作 为底物 时抑制率相对较高(表 4)。这从另 一 角 度 说 明 DMF作 用 的 主 要 部 位 是 TCAC。因为柠檬酸、苹果酸和琥珀酸都是 TCAC中的底物 ，它们必须通过 TCAC才能 进行代谢。一但 TCA(~。被抑制，整个菌体的 代谢就出现障碍。而葡萄糖在TcAc被抑 触肘还可通过其它途径为微生物利用，所 以速时的抑菌效果较差。 ． 表 4．不同底物中 DMF对酵母呼吸的 抑制率 底 物 DMF浓度(ppm) 抑制率( ) 葡萄糖 J 000 24 1 柠檬酸 29．2 琥珀酸 26．7 苹果酸 33．8 致谢：感谢卢寅泉老师对本文写作所提 出的宝贵 意 见和建议 。 参 考 文 献 LI J Islam Mir N．；J．Food Sei ，47(5)I 710～ 1712．1 982 [2]汪锦邦，高学敏等 f工业微生物 ，(6)I9～ 25，1987 [3一Dymichy M．一Ben~ivengo M．．et a1{ p_ plied and EnviromentaI Microbiology 53(1) 1 10～ I1 3．I987 维普资讯 http://www.cqvip.com [4]范秀容，李广武 ，沈萍；《微 生物学实验 》， 高等教育出版社，1981 r5]Davids鲫 P．M．et a1．}J． od 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experiment su~ es'Lg that DMF ex- eTt| inhibitory action at the tricarboxylie acid cycle mainly· ～ l Key words：DJmethyl fumarate，AntimicrobiaI activity，Food preserv~ive · 6· 维普资讯 http://www.cqvip.com