嗜碱性芽孢杆菌碱性纤维素酶酶系的研究

／罗 7多≯ 肚＼口 弓 第24卷 第 3期 田亚平等：嗜碱性芽孢杆菌碱性纤维素醇酶幕的研究 J^ ● 嗜碱性芽孢杆菌碱性纤维素酶酶系的研究 竟酶系与去污力的关系，认为除以内切酶为主外，酶系中另二 组分，在去污效果中的辅助作 用不睿怒视。 王’ ． 一 ／一J 关|词 重薹拼力 ～ _ 一 - 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一 反映了三类酶组分的协同作用。 组酶的总称，它往往不是单种酶，而是起换同 近年来国内外的研究发现碱性纤维素酶 作用的多组分酶系。它一般包括C．酶即外切 可添加于洗涤剂中提高洗涤效果，并能使棉 B一1。4葡聚糖纤维二糖水解酶(EC3．2．1． 纤维织物柔软、复色，有着独特的去污机 21)、Cx酶即 内切 口一1，4葡聚糖酶(EC3．2． 理[2 】。此酶目前仅日本及丹麦已实现产业 ． 1．4)、和口一葡萄糖苷酶这兰类酶。不同来源 化，在国内，本校的国家级八五攻关项 目《洗 的纤维素酶其酶系在组成上是有较大差别 涤用碱性鲟维素酶的研究》业已圆满通过鉴 的，即其协同组合酶之种类、比例往往不同。 定，其进一步的产业化研究将填补国内的空 由于自然界合成的纤维素资源及再生资 白。在已知本嗜碱芽孢杆菌所产的碱性纤维 源相当丰富，人们一直以来致力于研究利用 素酶以内切酶为主的基础上，本文对其酶系 纤维素酶制剂酶解纤维素材料到还原糖类物 的情况作些探讨，以期从另一侧面了解其应 质，然后进行发酵 ，但囡成本高 ]，而尚未获 用机理。 得实际应用 ． 。 近年来，研究者们另辟途径，使 1 耕辫 导音{# 纤维素酶制剂在饲料添加剂及烟草加工、纺 ⋯ ⋯ 一 织印染工业和洗涤剂中都有了广泛的应用。 1．1 菌种 人们在研究中发现不管是将天然纤维素 本课组提供的嗜碱性芽孢杆菌 v一5。 转化成糖类，还是在其他应用中使纤维素大 1．2 培养基及培养条件 分子的物理结构发生变化，往往都需要多个 1．2．1发酵培养基 酶组分的协同作用。 麸皮2．o OA 、小麦粉 o．4 、豆饼粉水 人们在研究中还同时都遇到了如何测定 解液4 、味精 o．5 、KHzPO 0．1 、 和评定纤维紊酶各组分酶活力的问题，国内 Na CO。1 (分开灭菌)。 外的溅定方法很多，有代性的是，1)CMC 1．2．2 培养条件 糖化力，主要代表外切和内切的总和；2) 500ml三角瓶装 50ml培养基，斜面接 CMC液化力，它是利用测定高分子溶液粘度 种，旋转式摇床200r／min 34℃、48 h。 从而导出其聚合度和分子量的方法来表征内 1．3 酶液制备与酶活力测定 切酶活力，它可测得初速度，因而可确切反映 1．3．1 酶液制备 内切酶活力，灵敏度也高；3)滤纸糖化力，则 培养液经 3000r／mln离心 10rain，上清 收稿时间：1997—12—15 ， 器 扦 组 张 ¨ 程 等 恫 雌 《 一 一 ， ，婶今 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．24 No．3 液作为粗酶液。 1．3．2 酶活力测定 (1)cMC糖化力(稍加改良)：取适当稀 释酶液 0．2 ml，加入 0．5ml含 1 CMC的 0． lmol／INa2CO3一NaHCOa(pH 9．0)缓冲 液，40"C水浴 准 确反应 lOmin，立即 加 入 lmlDNS终 止反应，沸水 浴 5min后，加 入 4ml去离子水，535nm下比色(以0．2ml灭活 酶液代替活酶液作为空白对照)。 (2)滤纸糖化力t取适当稀释酶液 0．2 ml，加入 0．5ral pH。9．0、0．1mol／L Na2COa — NaHCO。缓冲液，加新华滤纸(1x6cm)混 匀，4O℃保温 lh，加入 lmlDNs试剂，煮沸 5rain，拎后，加去离子水 4ml，在 535nm波长 下比色(以灭活酶液代替活酶液做空白)。 (3)cMc液化力 ]：2．5ml酶液加入 2． 5ml pH 9．0、0．1mol／L Na2CO3一NaHCO3 缓 冲液．预 热后，再加 入 5ml 1 CMC的 Na?CO，一 NaHCO3，混匀，立即加入奥氏粘 (1)麸皮 2．5％ + 小麦橱 o．1 (对照j (2)玉米芯粉 2．5 + 小麦橱 0 4 (3)甘蔗渣2．5 + 小麦粉0．4％ (4)麦糟 2．5 + 小麦橱 0．1 (5)麦芽根 2．5 + 小麦粉 0．4 (6)麦芽根 2．5 + 小麦粉 0．6 (7)zb麦芽粉 2 5 碳源是构成细胞的主要成分，是细胞内 储藏物质和生成各种代谢产物(包括酶类)的 骨架。因此其种类及浓度对产酶有一定影响， 从碳源的实验种类的选择上参考了前人的研 究，我们大多选择复合碳源，其特点是含有纤 维素，因为所用菌种为非组成型菌种，所产碱 性纤维素酶需适当诱导才能产生。分析表 l 的结果，从三种指标的关系可反映此酶系成 分并不单一，且不同种类的碳源对酶系各组 分的影响有差别，就 cMc糖化力而言，6号 相对酶活最高，而其代表内切酶酶活的CMC 液化力数据却较低，这说明麦芽根对外切酶 有较好的诱导作用，而对内切酶则较差{再看 内切酶最高的数据 ，我们发现小麦芽粉对内 度计中，测反应液流经毛细管上液泡两刻度 间的时间，4O℃反应 l0rain后再测，则酶活 力简化计算公式如下： 、 酶活力 一 (tl--t2)xto／(tI--t~)(t 2一to) X t 式中：t 为缓冲液流速}t 为酶解 t分钟 后样品流速；t 为酶解前样品流速{t为酶解 时间。 (4)蛋白酶活力 “：缓冲液选择pH 10硼 砂一氢氧化钠。 1．i 芳力的测定方法跚 · 洗涤试验接 QBS1 1--84方法进行。 2 结果与讨论 2．1 产酶条件对酶系影响 2．1．1 碳源的影响 在其它条件不变的情况下(即与发酵培 养基比)，改变碳源如下： (8)大麦芽粉 2．5 (9)麸皮 2．5 (10)麸皮 2．5 + 山芋粉 0．4 (11)麸皮 2 5 + 山芋橱 0 8 (12)麸皮 2．5％ + 小麦芽粉 0．6 (13)麦糟 2．5 + 小麦芽粉 0．6 (H)麸皮 2 5 + 小麦橱 0．4Vo+幕乙二醇 0．01 切酶的诱导产生似乎较为有利；最不利于产 内切酶的碳源种类当属 l4号(古聚乙二醇)， 同时比较滤纸酶活发现，聚乙二醇的添加，尽 管对内切酶不利，但对酶系中另两种组分的 产生是有利的；我们知道酶系中蛋白质酶的 存在常常影响其它酶的稳定性，本课题曾在 酶的稳定性研究中发现，蛋白酶活在酶系中 达到 500u／100ml以上时，对酶的稳定性有 较大影响(以CMC糖化力来看)，表 l中变 化碳源时，蛋白酶的产生也有不同变化，对照 组麸皮与小麦粉的组合和单纯麸皮蛋白酶产 生都较步，相反含有麦糟的两种组合蛋白酶 都较高，分析比较后认为，可能麦糟中的蛋白 质音量较麸皮高，从而诱导产生较多的碱性 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 24卷 第 3期 田亚平等：嗜碱性芽孢杆菌碱性纤维素酶酶系的研究 蛋白酶，从碱性纤维索酶系的稳定性考虑，显 然蛋白酶的产生越少越好。 表 l 不同碳灞对产酶的影响 CIVIC糖化力 CMC液化力 墟纸糖化力 蛋自酶活力 碳源 相对酶活( ) 相对酵活( 、 丰目对酶活( ) (u／I) 1 l00 100 100 0．6608 2 l41 l18 102．6 1．9824 3 78 90．8 80．6 3．304 4 160 112．8 97．4 7．434 5 140 98．7 89．5 4．2952 6 170 - 69．8 98．7 4．6256 ～ 7 100 146 69．8 4．956 8 98 118 100 4．13 9 164 78．7 94．7 O．9912 J 1O 104 133 89．5 3．304 11 156 84．7 1o0 6．608 12 132 133 92．1 3．9648 13 148 98．1 108 7．9296 14 116 3 ．8 121 6．9884 2．1．2 氮源的影响 在碳源和其它条件都不变的情况下，选 择一些可工业化的有机碳源和一些无机氮源 进行实验，以 1．0 豆饼粉水解液为对照，结 果见表 2。 衰 2 不同氯蠢对产醇的影响 CIVIC糖化力 CMC液化力 滤纸培化力 蛋白酶活力 氯源 相对酶活( ) 相对酶活( ) 相对酶活( ) (u／I) 豆饼糖水解液 1．oN 100 1OO 100 0．080 ． - ‘ 豆饼粉 1．6 14-9 68．4 37．99 O．6608 玉米浆 1．oN 1-1 13．1 1l5 0．3304 蛋白胨 1．0 119-3 47 197 1．4868 牛内膏 1．o 。 167．8 95．7 128．7 2．478 ? 酵母膏 1．0 5、7 0．00002 69．88 1．8172 牛内膏 1．0 +酵母膏 0．5 100 6 8 14B．4 1．0304 尿紊 1．O 1-1 0．9 0．377 1．1388 NH NO31．oN 1·1 1．0 0．374 2．652 (NH．)2SO41．0 0·8 0．15 0．15 2．1476 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Ind㈣st i s Vo1．24 No．3 氮是组成蛋白质和核酸的主要元素．酶 的本质是蛋白质，微生物的生长代谢离不开 氮源，氮源对产酶的影响很大，从结果总体来 看，大部分有机氮源对产酶都比无机氮源有 利，这与课题组工艺研究中的结果是一致的， 主要原因认为一是有机氮源营养较无机氮源 丰富得多，二是无机铵盐在 pH 10时以 NH。 形式挥发而不能被利用，此外大量游离氨可 能对菌体有毒害作用口]；我们认为与此微生 物细胞本身代谢酶系也有一定关系。具体看 有机氮源种类对产纤维素酶系的影响，从内 外切酶的综合指标CMC糖化力及表征三类 酶总酶活的滤纸酶活看 蛋白胨和牛肉膏对 产酶较有利，但蛋白胨对其中的内切酶却不 利，相对的外切酶及 p一葡萄糖苷酶则比例 更高}酵母膏的存在对外切和内切酶都很不 利，尤其单独存在且浓度较高时更加明显，我 们推测酵母膏成分中可能存在这两种酶的抑 制因子}将豆饼粉与豆饼粉水解液对比，除蛋 白酶外，后者对酶系各组分都较为有利，显然 这是因蛋白质被水解成小分子的氮基酸或短 肽而更易被菌体利用，同时正因蛋白质大部 分被水解，需诱导才产生的蛋白酶反而较少 了；课题组研究曾发现玉米浆对产酶不利(以 CMC酶活力计)“]，而上面的结果则表明酶 系中内外切酶受影响最大}尿素对产碱性纤 维素酶各组分都不利的原因可能是，碱性条 件下尿素不稳定、易挥发．从而利用效果较 差。 2．1．3 通风量对产酶的影响 对好氧菌来说，适量的氧气供给有利于 菌体的生长，供氧不足或供氧过多都会影响 微生物的生长代谢和产酶。我们采用发酵培 养基，通过 500ml摇瓶装液量的变化来探讨 通风量对产酶酶系各组分的影响。从图 1曲 线趋势反映酶系各组分对通风量有不同要 求，首先我们发现内切酶对通风量的要求不 高，其产酶随通风量的减少渐增但很缓慢}从 CMC糖化力的变化和滤纸糖化力的变化，我 们可推测酶系中另两种组分受通风量的影响 较大，尤其外切酶在较高通风量时产酶高(装 液量为 5Ora1)；综合指标滤纸糖化力则表现 出在装液量为 75mi时总纤维素酶活最高， 此时的通风量对产蛋白酶也较适宜。此时的 通风量对此菌既不至于过高而造成生长过 快，衰老过早影响产酶；又不至于过低造成菌 体代谢积累产酸，抑制酶的合成。 JI● 图 1 通风量对产酶的影响 数据系列 1：CMC糖化力I数据系列 2}CMC液化力 ×l0。；数据系列 3：滤纸糖化力；数据系列4：蛋白酶 活力 (因酶活力定义不向，各系列之间不能相互比 较) 2．1．4 pH 对产酶的影响 图2 pH对产酶的影响 维普资讯 http://www.cqvip.com 第24卷 第 3期 田亚平等：嗜碱性芽孢杆菌碱性纤维素酶酶系的研究 数据系列 I：CMC糖化力 ；数据系列 2：CMC液化力 ×l0 ；数据系列 3：滤纸糖化力；数据系列 4；蛋白酶 活力 (因酶活力定义不同，各系列之间不能互相}匕 转 ) 嗜碱性细菌能够建立起一个逆向跨膜质 子梯度(ApH)．通过细胞膜上的 Na ／H 反 向载体调节胞质而使之在高碱环境中正常生 长 。我们采用发酵培养基，通过添加不同浓 度的 NazCO ，考察不同初始 pH环境对产酶 酶系各组分的影响。从综合指标来看，产总纤 维素酶在加碱量为 O．75 时较高，而其中内 切酶在 0．5 以上的加量范围变化并不大， 似乎加碱量高一点反而有利；通过 CMC糖 化力的变化，发现外切酶和 p一葡萄糖苷酶 则在低一些的加碱范围(0．5％～0．75 )产 酶较高。 2．2 表面活性剂对酶粉酶系的影响 衰 3 不同种娄衰面活性卉鼍对醴粉醴系的影响 表面活性剂 相对 CMC糖化力( ) 相对液化力( ) 相对滤纸糖化力( ) 相对蛋白酶活( ) 0．1 LAS 94．52 95．24 92．31 94．98 o．1 AED 102．74 143．27 76．92 80．0 o．1％SDs 】01．3．7 131．88 】30．77 150 0．1 皂片 84．93 83．85 144．76 1I9．鹕 0．0l荧光增白剂 95．21 89．13 130．77 109．99 空 白 100 100 100 100 衰 4 不周浓度衰面活性卉鼍LAS对H粉一系的影响 LAS 相对 CMC糖化力( ) 相对藏化力( ) 相对滤纸培化力 ( ) 相对蛋白酶活( ) 0．05 88·4 93．6 98 47 0．1 92·7 — 98．2 92 97 0．2 96·7 101．9 80 108 r 0．3 99·8 102．6 78 129 O ． 3。o． 100 1OO 】00 在攻关项目的研究中，课题组曾实验了 各种表面活性剂和助剂在使用浓度范围对碱 性纤维素酶活(cMc糖化力)的影响，发现一 般都无什么不良影响，此酶具有在洗衣 粉中应用的可行性。当我们从酶系的角度研 究影响时发现，一些主要表面活性剂对酶系 中各组分的影响还是有些差别的 从表 3我 们看到 0 1 的皂片的添加会使酶系中内切 和外切酶酶活有所降低，但总酶活反而增强， 说明酶系中 葡萄糖苷酶被激活}选择洗衣 粉主要成分之一 LA$(烷基苯磺酸纳)作变 化浓度的影响，发现在使用范围内增大浓度， 对内外切酶都无不良影响。 2．3 酶系与去污力的关系韧撵 为探讨酶系与去污力之间的关系，我们 选取 cMC酶活有较大差别的两批硫镶盐析 酶粉(1，l 与 2，2’)以加酶量 SSu／t(按 CMC 糖化力计)，进行洗涤实验，井将酶粉酶系分 析测定结果与击污力提高值一起列出。洗涤 条件为：40℃、预浸 30分钟、洗涤 1小时、酶 粉与自配洗衣粉配合。 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries VOI．24 No．3 衰 5 不同批次醴柑的洗涤效果 CIVIC糖化力 CMC液化力 滤纸糖化力 去污力相对提 酶粉 液化力／糖化力 (u／g) (u／g) (u／g) ( ) l l 661．52 467 38． 0．2594 9．4 l‘ 1629．6 483 24．64 0．2964 3．14 2 437．52 256 2O．02 0．5851 7．35 2 355 19 275 9．24 0．7742 l_02 从表 5的结果来看，对于同一批酶粉，比 较发现，糖化力／液化力低的酶粉其去污力反 而高，而且滤纸糖化力也相对较高，这些都说 明酶粉的洗涤作用是碱性纤维索酶系的协同 作用，除内切酶为主外，酶系中的另两种组分 对去污力的影响不容忽视。但究竟各组分以 怎样的比例存在去污效果最好，是一个比较 复杂的问题，这从不同批次的情况看也有所 体现，课题组曾经在研究去污力实验中发现， 不仅不同菌种、不同工艺条件得到的酶粉对 去污力的提高不同，即使前面条件完全相同， 仅后提取工艺有差别，去枵力的提高仍有较 大差别，我们认为除了其它因素韵影响外， 应该说与酶粉的酶系成分比例确有一定的相 关性。 参 考 文 献 1 刘洁，李宪臻。高培基 工业微生物。1994，24 (4)：27～ 31 2 村田守摩．日化协月报，1988，41(6)：27～ 0i 3 S~sulr,o Ito．Agfic．B 0I．Chem．，1989．53 (S)：1275 4 生物化学教研室．茇酵生物化学实验．无锡 轻工大学 ，1994．28～31 5 Yoko Ikura．Agric．B[o1．Chem．，1987-51 (11) 814_3 6 Koki．Horikoshi，Teruhiko． Alkalophilic Mieroorganim s，A New Microbial World．Japan： JaPq Scientific Societies Pr s．：198Z．33~35 7 高培基。曲音波，王祖农．山东大学学报。 1990，25(2 ：249～ 256 8 王沁，赶学慧．【也微生物 ，1 995，25(3)Il 3 ～ 15 Studies on the Enzymes System of Alkaline Cellulase from Alkalophilic Bacillus sp．V-5 Tian Yaping Quan Wenhai (Seh。ol Bio'e。nginee rlng。Wuxi uIliv啉 ity。f Lig。ht Indusny ，Wu，i，214636) AlkSU~ACT The effects of Various carbon，nitrogen sources，pH and air condition 011 the en- zyme system produetion~of alkaline cellulase from alkMophilic bacillus sp．V一5 were studied Analyzed the cha~e of the enzyme~ystem when they were put into various interracial active agent，each component(include endo-~l，4-glucanase，exo—B_1，4-gluca~ase and~-glucosi- dase)in the enzyme system have been enhanced diffierently by above condition．It appeared that exo— 1，4-glucanase have some certainly effects on detergency，through the preliminary research of the relation between the system of enzyme and detergency． Key word alkalophilic BacHlus，alkaline cellulase，the system of enzyme，detergency 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 24卷 第 3期 刘勇等：金针菇 FV088深层发酵工艺的研究 金针菇FVO88深层发酵工艺的研究 刘 勇 张长铠 李昆峰 (山东大学微生物技术国家重点实验室。济南，250100) 摘 要 车文研究了叠钟菇FVO$8菌株 的发酵工艺。以单园子实验和中心蛆合设计序贯形 式．确定 丁谈苗抹 的由水港性碳、氪豫组成的适宜发酵培养基 I．菌丝体 干重可达 I．5Oel loomll以均匀设计形式确定了诚菌株的由发酵工业用粗抖组成的发酵培养基l，菌丝体于 重可达 3．s幢／looml‘井研究了发酵条件对菌些伴得率的影响l经2L发酵罐实验，得出了其 动卉学变化曲线，为工厂化生产盎针菇茴丝体提供 了宥价值的结果． 关■词 金针菇 幂层发酵 中心蛆合设计 均匀设计 苗丝体千重 近年的研究结果表明，金针菇 (Flam— mulina velutipes(Curtis．ex Fr．)Singer．)含 有丰富的抗 癌物 质，其子 实体[1 ]、苗 丝 体[4 和发酵液嘲中均含有抗癌蛋白、多糖和 搪蛋白。采用锞层发酵工艺培养苗丝体替代 子实体进行食品加工或生理活性物质提取被 认为是今后金针菇研究和开发的方向。以往 在对金钟蘸液体发酵培养基进行最适碳、氮 源筛选时，多采用水溶性碳、氮源与发酵工业 用粗料培养基成分混合筛选的方法，虽然有 较高约菌丝体得率，但由于天然来源的粗料 (多为农副产品)培养基成分复杂且一般水溶 性差，往往造成测定菌丝体干重时的较大误 差，也失去了与水溶性碳、氮撼之间的可比 性。作者采用了金针菇栽堵中常用的优良菌 株FV088，以数理统计方法分别研究了该菌 株的由水溶性碳、氯源组成的适宜发酵培养 基 I及由粗料培养基组成的发酵培养基 I， 并研究了各种发酵条件对菌丝体得率的影 响。经2L自控发酵罐扩大实验，得出了其动 力学变化曲线，取得了有价值的结果 1 材料和方法 1．1 菌种 金针菇 FV088，由山东大学微生物系菌 种室提供。 ·收糖时祠^997一钟～24 1．2 木溶性硪潭、氮源 水溶性碳源：葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽 糖、半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇。 水溶性氮源：蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、 酵母粉、氯化铵、硫酸胺、尿素。 1．3 租科培莽基成分 小麦粉、玉米粉、大米粉、赤砂糖过80目 筛子，麸皮采用浸出汁的形式。 I．4 培井基 斜面培养基：PDA培养基，内含1．5 ～ 2．0 琼脂，pH7．0。 灌体种子培养基：液体PDA培养基。 发酵培养基 I；以KH2PO 0．1 、Mg． SO ·7H O 0．05 作为无机盐，添加微 量 VB，、VBz 首先通过单因子实验筛选最适的 碳、氮源，然后在此基础上，再进行中心组合 设计确定碳氮比 发酵培养基 Ⅱ：以粗料培养基成分为原 料，采用均匀设计的形式。筛选出最适发酵培 养基 I。 1．5 培养方法 摇瓶培养：300ml摇瓶装液量 80ml，接 种量 10 ，采用 25℃、100r／rain恒温振荡摇 瓶培养 l20h。 发酵罐：德国B．Brown公司生产的 2L 自控式发酵罐。自动控制罐温 25℃，罐压0．5 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries VO1．24 No．3 kg／cm ，通气量 1：1(vvm)，搅拌转速 200r／ rain，培养时间lOOh 发酵过程中，进行pH、 溶氧的在线检测。放罐：培养基由浑浊 变澄清透明的淡黄色或总糖降至 5mg／ml以 下。 1．6 测定方法 pH值测定：以国产智能型 PHS一2酸 度计测定。 菌丝干重测定：以单层纱布过滤收集菌 丝体，清水冲洗，80 C烘干至恒重。 溶氧测定：以溶氧电极进行测定 2 结果与讨论 2．1 发酵培养基 I的优化0~’ 2．1．1 最适碳源的筛选 采用 1 蛋 白胨、KH2PO。0．1 、VB 10~g／100ml、VB 50~g／lOOml的液 体培养 基 ，再分别添加 l0种水溶性碳源，实验浓度 为 2％。采用 300ml摇瓶振荡培养，测定菌丝 干重，结果见表 1。 衰 1 不同碳源对菌丝产量髟响 营丝碍率 碳源 (2“) (克干 100 ml 葡萄糖 0．602 果糖 0．668 可溶性淀粉 0、985 乳糖 0．5l9 糊精 0．698 麦芽糖 0．492 甘露尊 I 0．582 1、5 可溶性淀粉 +O．5 葡萄糖 0．990 半乳糖 0．497 蔗糖 0．572 结果显示 金针菇对可溶性淀粉、糊精、 果糖、蔗糖等均能较好利用。综合考虑成本、 操作方便等因素，碳源采用 2 可溶性淀粉 为宜。 2．1．2 最适氮源的筛选 采用 2 可溶性淀粉的液体培养基(无 机盐、维生素同前)，再分别添加 8种水溶性 氮源 ，实验浓度 2 ，采用 300ml摇瓶恒温振 荡培养，测定菌丝干重，结果见表 2。 衰 2 不同氮童对曹丝产量骷畸 氮源(1 ) 菌丝得率(克干重／loOm1) (NH。) ot 0．208 尿素 ●●●●-- NH。C1 0．100 酵母粉 1．122 牛肉膏 0．925 胰蛋白胨 0+930 蛋白胨 0．961 N}LNO3 0．221 注：“⋯⋯ 表示几乎不生长 结果显示：FV088。对无机氮源利用不 好，而有机氯源中以酵母粉为最佳。 2．2 中心组台设计实验 在以上单因子实验结果分析的基础上， 针对碳源、氮源两因素进一步采用中心组合 设计来研究，其实验设计及分析结果见表3。 衰 3 培养基成分的中心组台设计爰实验结果 试验号 碳源 氮源 蕾丝碍率 ( ) l 1(5) I．414(3．8) 1。 347 2 “ 5) 1(3) 1．402 3 一1(1) 1(3) I．020 4 一 1(1) 一1(1) 0．907 _ 0 0<3) o(2) 1．340 6 1．414(5．8) o(2) I．660 7 一1．414(0．2) o(2) 0．405 1 8 o(3) l、414(3．8) 0．885 9 o(3) 一1．4l4(0、2) 0．870 经 STA软件对中心组合设计的二次多 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 24卷 第 3期 刘勇等 金针菇 FV088深层发酵工艺的研究 项式回归方程的回归系数进行计算，利用得 在不同水平上的等高线(见图 1) 出的菌丝体生物量(Y)回归方程，可求出 Y 4 3 - z 2 ' O 3D●膏量啊fLIUI：STA 10v~0C) "x'x*0．01S'x'y-0．14~ey 乡，／ ，／乏 、 - 一 — ＼ ＼ ，， 一 。、 ＼ 。＼ f(《 、 f ) ) ＼ —／ ，／ ＼ — 一 、’．’’一 、 — ～ ’ 、 ， ～ I —． ' ’ ' ～ l O t 2 3 4 5 霉 7 ● C ■ 图 1．不同碾氯比对生街量的 影响(推算值) 由图 1可见，碳源和氮源浓度对菌体得 率的影响比较复杂。菌体得率的极大值为 1．58 。综合考虑菌丝体得率和原料成本等 因素，培养基成分确定为：碳源为 3．5 可溶 性淀粉、氮源为2．O 酵母粉。进一步经实验 验证，菌丝俸得率基本稳定在 1．45g／100ml 左右。 2．3 摇瓶发酵条件的优化 2．3．1 培养温度对菌丝产量的影响 采用发酵培养基 I，将 300nd摇瓶分别 置于 15 C、20C、25℃、30℃、35℃下振荡 uO 小时，测定培养温度对菌丝得率的影响见表 4。 ． 衰4 培养沮度对曾丝产量的髟响 洼：一表示生长不良 结果显示：2O～25℃为最佳培养温度。 2．3．2 通气量对．菌丝产量的影响 将 3J00ml摇瓶分别置于 80、120、160、 200r／rain等不同的摇床转速下，培养 110小 时后潞菌丝千重，结果见表 5。 衰5 通鼻量对蕾丝产量的影嗨 结果显示；以120~160r／min为比较适 宜的转速。低于此转速。生长较缓慢，菌丝球 直径大小不一，进一步提高转速，虽菌丝球 直径变小，发酵周期缩短，但最终菌丝体干重 无显著性差异，说明此茵对通气量要求不高 2．3．3 培养基起始pH对菌丝产量的影响 发酵培养基 1分别以HCI和 NaOH调 成不相同pH值，140r／min振荡培养 l10小 时后，测菌丝体千重，结果见表 6。 裹 6 pH值对曹丝产量的髟响 狲s；憎 咖m眦m叭啪 礤m峭枷 口 口 O O O O n O O 1 1 1 1 t 二二=二二二=二 维普资讯 http://www.cqvip.com lO 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries VOI．24 No．3 结果显示：适宜的起始 pH为 6．0～6． 5。 2．3．4 接种量对茵丝产量的影响 发酵培养基 I灭菌后分装 30Oral摇瓶， 接种不同量一级摇瓶种 (种龄 5天)。发酵 100小时后，观察菌丝球生长情况，井测定菌 丝体干重，结果见表 7。 表 7 接种■对蕾丝产量的影响 接种量 5％ 1O 15 2O 菌丝得率 1．44 l_55 1．53 1．5b (克干重／lOOm1) ● 结果显示：接种量为 10 左右为宜。 2．4 金针菇 FV088菌株发酵过程中溶曩和 pH的变化 金针菇 FV088菌株在 2升发酵罐中溶 ， 氧和 pH的变化如图 2所示。 t 艟 时 目(h 图2 金针菇FV088菌株发酵过程中 ! 藩氧和 pH的变化 金针菇液体发酵同固体培养一样，需在 稍偏酸性的环境下生长。实验结果显示，金针 菇 FV088发酵过程中的pH变化较小；在搅 拌转速 200r／min、通气量为 1：1(vvm)时， 发酵进行到 60小时左右，溶氧降到最低点． 随后溶氧上升，发酵周期短于摇瓶培养。 2 5 发酵培养基 Ⅱ的优化[I 脚 选用天然来源、价格低廉的粗料(农副产 品)为发酵培养基，可得到很高的菌丝体产 量。但这类物质一般水溶性差，所得的菌丝体 不可避免的混入这些培养基成分，降低了与 水溶性碳、氨源之间的可比性 因此，我们采 用均匀设计(5因素 l1水平)的方法单独对 其进行优化。均匀设计的基本出发点是让试 验点在整个实验范周内更加充分地均匀分 散，从而具有更好的代表性，但每个因素的每 个水平只做一次实验，就使得最少试验次数 与水平数相等，作为多因素条件优化的预备 试验可显著提高工作效率 实验设计及结果 见表 8、表 9、表 10。 2．5．1 均匀设计实验结果 表 8 均匀设计表 U11(11 ) 试验号 列号 表9 墙井基l优化试验园素殛水平 5 3 6 口 l 4 7 加 2 5 8 n 3 S 4 9 3 8 2 7 1 n 2 7 3 m 6 2 9 5 l 8 4 n l l 2 3 l 5 6 7 8 9 ． n 维普资讯 http://www.cqvip.com 第24卷 第 3期 刘勇等：盒针菇FV088深层发酵工艺的研究 ll 衰10 粗料培井基均匀设计和实验分斩结暴 试验号 生鞫量( ) 玉米粉 大米粉 面粉 麸皮 赤砂糖 l 1．10 o 0．2 0 8 1．2 0．7 2 l|8O O．5 0．6 2．0 2．7 0．3 3 2．7g 1．O I．0 3．2 0．9 l_0 4 l_88 1．5 1．4 0 2．4 0．6 5 2．40 2．0 1．8 1．2 0．6 0．2 6 2．80 2．5 0 2．4 2．1 0．9 7 3．10 3．0 0．4 3，6 0．3 0．5 8 3．30 3．5 0．8 0．4 1．8 0．1 9 3．5o 4．O 1．2 I．6 0 0．8 l0 3．60 4．5 1．6 2．8 1．5 0．4 11 3．25 5．-0 ：‘ 2．0 ． O 3．0 1．1 对实验结果进行二次多项式回归分析， 结果如下：所得回归方程为： Y — 1．112345+ 0．7819529X1+ 0． 3388749X3— 7．51 9403E 一 02XX1— 5． 374752E一02XX3—3_251018E一02XX‘各 因素对结果的影响强弱顺序为： XXs>XI>XX1>xa>xx‘>xx3>X． 各因素的极大(极小)值为： X1 = 5．199568 Xa =8．15247 X一 = 0 约定的回 归系数显著性检验临界值： FIS=0．3 最终方程的复相关系数：R=O．9558852 最终方程的剩余标准差 S=0．3328497 最终方程的检验统计量tF—10．58971 经预测分析，并考虑到原料价格等因索， 发酵培养基 II最终确定为4 玉米粉、1 麸 ’ 皮、0．．5 赤砂糖等，又经摇瓶培养确证，菌丝 体千重稳定在 3．5g／IOOml。 在生物学实验中，各因素对实验结果的 效应是相当复杂的，依据显著性分析构建的 回归方程往往难以全面真实反映其作用，尚 需结合生物学知识及其它实验设计方法加以 分析修正，才能得到比较合理的优化结果。在 均匀设计的计算结果后，有的因素的值超出 了所取的水平范匾，应进一步对应这些范围 设立新的水平，继续试验．使结果更接近最优 。 2．6 讨论 食用菌的生长繁殖与细菌不同，它是以 菌丝尖端不断向前蔓延的方式生长繁殖 这 就要求深层发酵初期的发酵液中菌丝球的体 积要小，数量要多．即发菌点多，发酵才能取 得好的结果。所以作为食用菌深层发酵的培 养基不仅要具备生长繁殖所需要的各种营养 成分，还需要具备形成大小适当的苗丝球的 乱 仉 仉 0 O 0 m 螂 嚣 x x 维普资讯 http://www.cqvip.com l2 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries VOI．24 No．3 生长环境条件。菌丝球的大小和数量多少与 培养液的粘度和剪切有关。在一定范围内粘 度和剪切作用越大，菌球越小，数量越多。实 验结果显示：由粗料组成的发酵培养基 I，其 菌体干重大于由水溶性碳、氮源组成的发酵 培养基 I，原因可能主要有=：一是 80目过 筛的玉米粉、面粉等在发酵初期能起到增加 粘度的作用+--是粗料含有丰富的生长园子、 维生素等。由于粗料成分复杂且水溶性较差， 以发酵培养基 I培养苗丝体用于提取某些生 理活性物质．可能会给后续的提取过程增加 一 些难度。 参 考 文 献 1 Komatsu N et a1．The Journal of antibi- otics+1963+18(3)：139 2 Yoshioka et a1．Chem．Pharm．Bul1．．1993。 21：l772 3 曹培让 等．生物化 学与生 物物 理学报 ， 1989．3：152 4 Lin et aI．Nature．．1974．252～235 5 Jiunn—Liang KO．et a1．Eur．J．Biochem．+ 1995．228．244～ 249 6 郭美英译．应用镦生物，1984,4：32 7 宋士良等．食品与发酵工业，1992，(6)：8 ～ 13 8 阵洪章等．林产化学与工业，1992+(3)： 217～ 224 Percy D I'hahn Experimental Design in Biotechnology． New York：Marcel De kker，Inc． 1989。l9～ 35 lO 方开泰．应用数学学报，1980，3(4)：363～ 372 孙振寰等．天津微生物，1991，(3)：13～19 刘扬等．山东大学学报，1994，(2)：224～ Studies on Submerged Fermentation Process of Flammulina velutipes FV088 。 ● Liu Yong Zhang Changkai Li Kunfeng (State Key Laboratory Of Microbi0．Technol0gY，Shandong University，Jinan，250100) ABSTRACT In this paper，the fermer／tation process of the Flammulina ~elutipes strain FV088 was studied．By means of single factor experiment and Cehtral composite design·0p— tlmal fermentation medium I containing soluble carbon source and soluble nitrogen source was detem ined．A kind of low--price fermentation medium 1 which consists of crude mate— rials was also determined by method of uniform design．The experimental results showed that the myeelieal dry weight was 1．50 (w／v)and 3．50 (w／v)in flask culture respective— ly．Tlhe effects of different culture conditions on the mycelical dry weight were also studied． By using 2L auto--fermentator under the suitable culture conditions，the change curve of ki— netics was obtained，Which provided practical results for the hvel of industrial production． Key word Fl~ramulina vegu~ es，submerged culture，central composite design，uniform de— sign，mycelical dry weight u 地 哪 维普资讯 http://www.cqvip.com