高效液相色谱法测定低热量食品中的葡萄糖,果糖,蔗糖,麦芽糖醇？…

l2 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．24 No 4 高效液相色谱法测定低热量食品中的 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖醇和山梨糖醇的研究 ．| 一 马立田 王式箴 (国家食品质量监督检验 中心．北京，100027) 摘 要 车研究将高赦液相色谱法与化学水解赠结台，探讨 了低热量食品 葡萄糖、皋糖、 蔗糖、麦芽糖醇和山梨糖醇 同时测定方法。采 Wsters Sugar PakI桂，以甲醇为流动档， 样品中曲葡萄糖、果糖、麦芽糖醇乖 由椠楷醇进行分离，用示差折光检测器连行河定。并根据 蔗糖水解生成等摩尔的果糖和葡萄糖，毗五法测得样品水样前后果糖的增加量，判定祥品中 是否舍有蔗糖并计算蔗糖曲音量。从而达到同 测定低热量食品中五种组舟的目的，率、击简 单、快速、精确、实用 群患病率 已达 5．3 ，糖尿病的防治工作已 引起全社会的关注。我国目前约有 2000万糖 尿病人，每年新增加的病人高达 75万人。正 是 由于众多的糖尿病人的存在，近年来低热 量、无蔗糖食品的开发方兴未艾。另外针对含 蔗糖食品对儿童牙齿的损害，无蔗糖儿童食 品也大量出现。所以对上述食物中的蔗糖组 分的鉴定有着非常重要的意义。 再者，近年来由于淡乳粉的价格上扬 ，少 数生产厂家在淡乳粉中掺人 3 ～4 蔗糖、 糊精等替代物，这个量既不易为食用者觉察， 又大大降低了生产成本，从中谋取了不法之 利。打击以蔗糖为添充物的造假行为，科学、 准确地鉴定食品中的蔗糖已成为当务之急。 麦芽糖醇、山梨糖醇分别是麦芽糖和葡 萄糖的加氢产物，是低热量甜味料，被广泛用 来加工低热量食品，目前食品中的麦芽糖醇、 山梨糖醇的分析尚没有标准方法。食品中的 蔗糖分析方法有化学法 1]、酶比色法一 ]、酶 电极法口]、毛细管电泳法 、高效液相色谱 法 等。以GB5009．8为代的化学法测 定蔗糖是先将蔗糖用盐酸水解为葡萄糖和果 糖，再测定还原糖的总量，由于这种方法在水 * 收稿时间：l998一Ol-09 7-9 a 解过程中还可将糊精、麦芽糖等组分水解成 葡萄糖，故使最后测定结果偏高。酶比色法、 酶电极法(GB／T 16285)是一种对葡萄糖具 有专一性的分析方法，在测定蔗糖时先将蔗 糖用 B一果糖苷酶转化为葡萄糖再测定葡萄 糖的含量，该方法只能测定单一组分，检测结 果常会受到酶纯度及酶活性的影响。毛细管 色谱法、高效液相色谱具有可同时测定多种 组分的优点，近年来被广泛用于糖类组分的 分析。本研究采用高效液相色谱法 ，利用 Wa ters Sugar Pak I柱所具有的对葡萄糖、果 糖、麦芽糖醇和山梨糖醇的分离特性，对低热 量食品中的上述四种组分进行同时测定；并 对低热量食品中的蔗糖组分采取先水解，再 利用高效液相色谱分离后测定果糖的增加 量，从而计算出蔗糖含量。本法克服了化学法 分析蔗糖不易准确的不足，可测定低热量食 品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖醇和山梨糖 醇五种组分，使测定结果准确可靠。 1 原理及分析方法 1．1 原理 Waters Sugar Pak I柱对葡萄糖、果糖、 麦芽糖醇和山梨糖醇具有 良好的分离，利用 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 24卷 第 4期 马立田等：高效液相色谱法测定低热量食品中的葡萄糖、果糖等的研究 l3 Waters 244高效液相色谱仪和 Waters Sug- ar Pak I柱及折光检测器即可对葡萄糖、果 糖、麦芽糖醇和山梨糖醇进行同时测定。 蔗糖分子由一分子的葡萄糖与一分子的 果糖联接而成，在 7O℃条件下经盐酸水解后 即可分解成等摩尔量的葡萄糖和果糖，再利 用高效液相色谱法测定样品中果糖水解后的 增加量，即可计算出样品中的蔗糖含量。 1．2 仪器及试剂 Waters 244型高效液相色谱仪，Waters Sugar Pak I柱，Waters 400型折光检测器 ， Waters 730型积分仪。 0．25mol／L硫酸锌溶液，0．085 mol／L 亚铁氰化钾溶液 ，0．1 mol／L氢氧化钠溶液 ， 重蒸水，盐酸(AR级)，15 氢氧化钠溶液， 25．0mg／ml葡萄糖标准溶液，25．0 mg／ml 果糖标准溶液，25．0 mg／ml麦芽糖醇标准溶 液，25．0mg／ml山梨糖醇标准溶液 1．3 样品制备 1．3．1 检测葡萄糖、果糖、麦芽糖醇和山梨 糖醇样品的制奋 称取5～10g样品，加入20ml蒸馏水使 样品溶解后转移至 lOOml容量瓶中，加入 0．085 mol／L 亚 铁 氰 化 钾 溶 液 5mL、 0．25mol／L硫酸锌溶液 5mL和 0．1mol／L氢 氧化钠溶液 1Oral，使蛋白质沉淀。用重蒸馏 水定容至 100ml。上清液过滤，弃去前 20ml 初滤液，再取滤液 lOml过 0．45 m膜后上高 效液相色谱测定。 1．3．2 检测蔗糖样品的制奋 取 1．3．1的滤液 25ml，加入 5ml盐酸， 在 70"C条件下水解 8min。然后用 1 5 氢氧 化钠溶液中和，再定容至 lOOml。过 0．45；~m 膜后上高效液相色谱测定。 I．4 高效液相色谱的澜定条件 检测器灵敏度：8×，流动相：重蒸水，流 速 ：0．4ml／min，柱温：90U，进样量：1O 1。 1．5 标准曲线的制作及样品的测定 L 5．1 标准曲线制作 用移液管取 2．O0、4．O0、6．O0、8．O0、 10．OOml(25mg／ml葡萄糖、果糖、麦芽糖醇 及山梨糖醇)标准溶液，分别用重蒸水定至 10ml，以进样量 i0；~i测定其峰面积，并以峰 面积为x轴，样液浓度为 Y轴分别制作出葡 萄糖、果糖、麦芽糖醇及 山梨糖醇标准曲线 (计算回归方程)。 1．5．2 样品测定 1．5．2．1 葡萄糖、果糖、麦芽糖醇和山梨糖 醇的测定 取 1．3．1制备好的样液 10 1注入高效 液相色谱，在前述测定条件下记录葡萄糖、果 糖、麦芽糖醇和山梨糖醇的峰面积，依保留时 间分别通过标准曲线查得样液中的各组分浓 度，然后计算各组分含量。 x c 越 器 慧 XIO0 X ( )：葡萄糖 果糖 麦芽糖醇或山梨糖醇的百丹古量 1．5．2．2 蔗糖的测定 先依照 1．5．2．1步骤测得水解前样品中 果糖含量(F1) 再取 1．3．2制备好的样液 i0#i注入高效液相色谱测定果糖的峰面积， 查果糖的标准曲线求得样液中果糖的浓度， 然后计算水解后样液中果糖含量(F2)。 黯 蒋嘉 。 蔗糖( )一( F1)×2×0．95 F1球屏 前样品中晕捂吉 量 F2水解后样品中果糖古量 2 结果与讨论 2．1 分离柱的选择 分离柱是高效液相色谱的核心，其对组 分的分离度将直接影响分析结果，为了研究 低热量食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖 醇和山梨糖醇的高效液相色谱分析方法，本 研究对常用来分离和测定糖类物质的 Wa— ters Sugar Pak I柱 和 Waters Bondapak NH 柱进行了比较。 Waters Sugar Pak I柱是一根适用于分 离葡萄糖、果糖的离子交换型的高效液相色 谱柱，通过对该柱的进一步研究发现(见表 1)，该柱还具有同时分离麦芽糖醇和山梨糖 醇的功能，可用于对葡萄糖、果糖、麦芽糖醇 维普资讯 http://www.cqvip.com 14 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．34 No．4 和山梨糖醇四种组分的同时测定(如图 1、 图 2、图 3所示)。由于该柱对双糖组分不能 进行分离，故不能进行蔗糖的直接测定。针对 这种情况，本研究依据蔗糖可以水解成葡萄 糖和果糖的原理，采用先将蔗糖水解为葡萄 糖和果糖后，再用Waters Sugar Pak I柱对 果糖进行测定的方法，解决了蔗糖测定的问 题。实现了用同一柱测定五种组分的功能，提 高了Waters sugar Pak I柱的使用效益。再 者 ，此柱以水为流动相，具有无毒、无污染的 优点，与其它试剂比较更具有经济性。 NH 柱常用于测定糖类组分，通过对此 柱的研究发现(见表 2)，尽管 NH 柱可以通 过改变流动相中CH CN与 H zO的比例达到 分离葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的目的，但不 能满足麦芽糖与麦芽糖醇、葡萄糖与山梨糖 醇的分离要求；即使通过提高 CH CN 的比 例达到对麦芽糖与麦芽糖醇 葡萄糖与山梨 糖醇的分离目的，柱中将会残留大量三糖以 上组分，使柱效逐渐降低，必须用 H O再生 后才能使用，这将给操作者带来很多麻烦}再 者CH CN的毒性会对操作者的身体造成伤 害。 衰 1 Waters Sugar Pak l柱对双■粪、麦芽■醇、蕾萄■、果■和山梨■醇等组分的保留时间 组分 乳糖{麦芽糖1蔗糖1麦芽糖醇1葡萄糖1果糖1山梨糖醇 保留时间(min) 7．4o}7．35 l 7．58} l 11．39 l 12．95 l 16．09 流动相： Hz0 流速 ： 0．4 m[／rain 柱温 ：90"(2 衰 2 NH 柱对果■、葡萄■、山梨■醇、蔗■、麦芽■，麦芽■醇、乳着苷组分的保留时间 流动相 CH3CN：H：O 85：15 流速： 1．5 ml／min 通过对两柱特性的比较，认为 Waters 糖、果糖、麦芽糖醇和山梨糖醇四种组分，及 Sugar Pak I柱更适用于对低热量食品中的 将蔗糖水解后再进行测定的方法，为低热量 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖醇和山梨糖醇的 食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖醇和山 分析，并就此开展了进一步的研究工作，建立 梨糖醇五种组分的测定提供了可靠手段。 了采用Waters Sugar Pak I柱同时测定葡萄 2．2 标准曲线的线性 表 3 标准曲线的线性 项 目 线性方程 检出限 线性范围 回归系数(r) 葡萄糖 Y一0．00005462X—O．02376 5．O g 5．O～250gg O．999'6 果糖 Y一0．00004935X一0．0938 4．0 g 4．0～250／~g 0．9998 麦芽糖醇 Y一0．00004239X+0．0946 4．0 g 4 O～250／~g 0．9999 山梨糖醇 Y=0．00004077+0．03524 4．0 g 4．0～250／~g 0．9998 2．3 实验方法的可靠性研究 2．3．1 葡萄糖、果糖、麦芽糖醇和山梨糖醇 样品测定的重复性及回收率 舒卡无糖糖果为以麦芽糖醇为甜味剂生 产的一种无糖低热量型食品，从对样品的重 复 测 定结果 看，麦 芽 糖醇 的变异 系数 为 1．86 、山梨糖醇的变异系数为 4．53 ；再 以槐花儿童蜂蜜为样品进行重复性测定，葡 萄糖变异系数为 0．98 、果糖变异系数为 1．41 ，以上四项的变异系数均小于 5 ，显 示本方法重复性 良好。 以舒卡无糖糖果和槐花儿童蜂蜜为样品 进 行加标 回收率的测定，结果为麦芽糖醇 95．1 ～ 105．0 、山 梨 糖 醇 95．2 ～ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 24卷 第4期 马立田等：高效液相色谱法测定低热量食品中的葡萄糖、果糖等的研究 15 102．9 、葡 萄 糖 95．7 ～ 98．2 、果 糖 95．8 ～102．2 ，四项的 回收率均在 95 ～105 之间，说明本方法准确可靠，满足测 定要求。 2．3．2 样品中蔗糖测定的重复性及回收率 以红星全脂奶粉为样品进行重复性测 94．3 ～102．7 ，说明本方法准确可靠，满 足测定要求 2．3．3 方法比对 由于未见麦芽糖酵和山梨糖醇的测定方 法的文献报道，故没有进行麦芽糖醇和山梨 糖醇的测定方法比对实验。下面是葡萄糖、果 定，变 异 系数 为 1．47 ，加标 回收 率 为 糖及蔗糖的测定方法比对结果 衰 4 葡萄■ 果麓比对结果 葡萄糖 果糖 样品名称 单位 本方法 GB／T 16285 相对偏差 本方法 C B12I6 相对偏差 二代果葡糖浆 42．4 41．5 2 15 55．1 55．9 1 44 福运泉酸枣汁 O．63 0．66 4．65 0．77 0．80 3．82 液体葡萄糖 15．2 l5．8 3．87 ND ND 衰 5 蔗糖比对结果 如表 4、5所示，比对结果的方法相对偏差均小于 5 ，证明本方法准确可靠。 2 0 5 lo 15 20 m’。 图 1 标样色谱图 1．蔗糖+麦芽糖 2．麦芽糖醇 3．葡萄糖 4．果糖 5．山梨醇 0 5 i0 15 20 25 mill 图2 儿童蜂蜜佯品色谱图 1．葡萄糖 2．果糖 0 5 111 】5 2O 25mla 图 3 儿童蜂蜜{羊品加标色谱图 1．麦芽糖醇 2．葡萄糖 3．果糖 4．山梨醇 卜0 Z一 丛 zH 维普资讯 http://www.cqvip.com l6 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vo1．24 No．4 § 三 0 5 10 15 20 ml 图4 未经水解处理的脱盐乳清橱样品 未见到葡萄糖、果糖 盆 暑 图 5 经水解处理的脱盐乳清橱样品 1．葡萄糖 2．果糖 2．4 蔗糖测定中样品水解的必要性 国家标准 GB5009．8(食品中蔗糖的测 定方法)是一个经典的化学法。其原理是先测 定样品中的还原糖 ，再测定经过盐酸水解后 的总还原糖。然后用水解后的总还原糖减去 原样品中所含的还原糖。其差值即表示由蔗 糖分解而来的还原糖。这种方法在实际工作 有一定的局限性 ，因为在加酸水解过程中，可 以水解为还原糖的前体物质不只是蔗糖，一 些小分子糊精，及麦芽糖等化合物都可降解 为葡萄糖而显示为还原糖，一些低聚糖也可 分解出含葡萄糖成分的还原糖。因此上述方 法中所测定的蔗糖，实际是以蔗糖表示的一 类糖的集合 。这个集合体中很可能含有非蔗 糖成分，使用这种方法对蔗糖为未知物的鉴 定将显示出盲目性，测定出的蔗糖结果，常常 比实际值偏高，从而造成测定误差。 姗 前 所 述，本 实验 所 采用 的 Waters Sugar Pak I柱对单糖类的葡萄糖、果糖有一 个很好的分离度。而对于双糖类的麦芽糖、蔗 糖不能分离好。也就是说，如果不将样品进行 水解处理，直接进样分析，则很难判定样品中 存在的是蔗糖还是麦芽糖或其它双糖类物 质；而经过水解这些双糖的分解产物是截然 不同的，麦芽糖只能分解出葡萄糖，蔗糖则可 分解出等摩尔量的葡萄糖和果糖，因此对样 品进行水解处理对于准确地判定样品中的蔗 糖成分是非常必要的，这一点从图 4、图 5中 可以得到清楚的证明。这也正是利用高效液 相色谱图谱来判定样品中是否含有蔗糖的原 理 3 本研究采用 Waters Sugar Pak I柱，对 食品中的糖类物质进行分析，在本实验 中充 分利用了 Waters Sugar Pak I柱对葡萄糖、 果糖、麦芽糖醇和山梨糖醇的分离特性，进行 四种组分的同时测定；由于受柱子性能的限 制 ，蔗糖不能直接测定，为避免其它双糖组分 对蔗糖测定的干扰，必须对样品进行水解处 维普资讯 http://www.cqvip.com 第24卷 第 4期 马立田等：高技液相色谱法测定低热量食品中的葡萄糖、果糖等的研究 1 7 理使蔗糖分解出果糖后再对果糖进行测定， 根据果糖水解后的增加量即可计算出蔗糖的 含量。同样由于受柱子性能的限制，本研究尚 不能对其它双糖及三糖以上组分进行可靠的 测定。对于酸性饮料，由于蔗糖在酸性条件下 极易分解为葡萄糖和果糖 ，因此在实际测定 中只能测定出葡萄糖和果糖，对于原样 中是 否含有蔗糖不能给以判定，只能给出样品水 解后的组分情况 本研究的意义还在于将原 仅用于测定食 品中葡萄糖、果糖两组分的 Waters Sugar Pak I柱扩大到测定食品中的 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖醇和山梨糖酵五 种组分，提高了该柱的使用效益。本研究对低 热量食品的开发研制有着特殊的意义；为测 定低热量食品中的上述五种组分提供了可靠 的测定方法。 参 考 文 献 1 GB5009．8食品中蔗糖的测定方法 2 GB／T 16285—1996食品中葡萄糖的测定方 法(酶一比色法和酶一电极法) 3 GB／T l6286—1996食品中蔗糖的测定方法 (酵～比色法) 4 朱岩等．分析化学．1990，18(2)：l02～10S 5 常理文等．分析化学，1994，22(10)：975～ 979 6 王维通等．生物化学杂志，1988．4：116 7 仁吉存等．分析化学，1995，23(9)：1040～ 1042 8 李 敬慈．丁天 惠．分 析测试学报，1995．14 (5)t 62～ 94 9 George M J·Haleem J I．J．L quid Chro— matogr．，1992·15：927 A Study on the Determination of Glucose，Fructose，Sucrose， M altitol and Sorbitol in Low--calorie Foods by HPLC M a Litian W ang Shizhen (The National Center for Food Quality of Supervision and Test·Bering，100027) ABSTRACT Through the combination HPLC with chemical hydrolysis，We have studied on the simultaneous determination method of glucose，fructose，sucrose，maltltol and sorbitol in low--calorie foods．Waters Sugar Pak I column}ms been used to separate glucose，fructose。 maltitol and sorbitol in sample with methanol as mobile phase and detected with differential refractometer．Furthermore，according to the sucrose can be hydrolyzed int0 fructose and glucose with equal molor，and an increase of the fructose content in sample before and after hyarolysis determined by our method．we have determined whether sucrose is present in sample and calculate the sucrose content in the sample．Thus a simultaneous determination method of five compositions in low--calorie foods has been obtained．This method is simple， fast，accurate and practica1． Key word HPLC，glucose，fructose，sucrose，maltitol，sorbitol 维普资讯 http://www.cqvip.com