实验五 显微镜油镜的使用、细菌的革兰氏染色及芽孢染色（张理珉）

null实 验 五 显微镜油镜的使用 细菌的革兰氏染色和芽孢染色实 验 五 显微镜油镜的使用 细菌的革兰氏染色和芽孢染色目的要求目的要求1、掌握细菌观察制片染色技术 2、掌握革兰氏染色和芽孢染色的原理及方法步骤 3、掌握显微镜观察技术（油镜的原理及使用）实 验 内 容 一 显微镜油镜的使用 及显微技术的介绍实 验 内 容 一 显微镜油镜的使用 及显微技术的介绍常用的度量单位常用的度量单位 一、显微镜的种类 一、显微镜的种类光学显微镜——常规研究工作 电子显微镜——研究细胞内部的、表面的结构及亚细胞结构 微生物的大小情况微生物的大小情况列文·虎克及其发明的显微镜、观察到的微生物形态列文·虎克及其发明的显微镜、观察到的微生物形态null 1676年荷兰人列文虎克用自磨镜片，创造了一架能放大266倍的原始显微镜检查了污水、齿垢、粪便等，发现了许多肉眼看不见的微小生物，正确描述了微生物的形态有球形、杆状和螺旋样，为微生物的存在提供了科学依据。null二、一般光学显微镜的结构组成二、一般光学显微镜的结构组成普通光学显微镜光路及原理普通光学显微镜光路及原理显微镜的数值孔径值显微镜的数值孔径值镜口角——指从物镜光轴上的像点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张开的角度，即形成的光锥（ α：光锥角度的一半）； 数值孔径和显微镜的光学性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦距成反比，与镜像亮度的平方根成正比 NA=η·sinα光学显微镜物镜的特性光学显微镜物镜的特性物镜的焦距、工作距离和孔径光栏的关系物镜的焦距、工作距离和孔径光栏的关系油浸物镜分别在空气和浸没油为介质时的工作情况油浸物镜分别在空气和浸没油为介质时的工作情况显微镜油镜的原理和使用显微镜油镜的原理和使用油浸系→香柏油：η=1.52 数值孔径：NA=η·sinα 显微镜的分辨率： 分辨两点间最小距离的能力 加入香柏油的作用? 油镜使用注意事项? 三、显微镜油镜的使用步骤 三、显微镜油镜的使用步骤利用低倍物镜找到所需要观察的材料视野（放大倍数由低到高），并利用载物台调节器（水平和垂直）将其调到视野的中央位置（有时可以省略——肉眼判断）； 利用粗调旋钮降低载物台，旋转物镜转盘，使油镜（100×）转到标本上方； 从侧面滴加香柏油于载玻片标本上（少量，中央）； 利用粗调旋钮升高载物台，使油镜刚刚浸没于香柏油即可（用肉眼从显微镜侧面观察）； 开大孔径光栏，升高聚光镜，用眼通过目镜观察，前后调节细调旋钮，直至物像清晰； 观察完后，降低载物台，利用镜头纸蘸二甲苯擦拭油镜或粘到香柏油其它物镜（40 × ）。一般光学显微镜（内置光源）的调整要求一般光学显微镜（内置光源）的调整要求放大倍数的选择（物镜的选择，一般有4×、10×、40×、100×） 光照强度（照明）的调节（灯泡电压高低的调整） 聚光镜的调整（升降）——光线的会聚 孔径光栏的调整（大小）——通光量 瞳距调节（具体后面介绍） 屈光度调节（具体后面介绍） 以上各项综合调整，达到的唯一目的——物像清晰、反差强。四、光学显微镜所涉及的观察方式四、光学显微镜所涉及的观察方式1.明场观察 2.暗场观察（暗视野） 3.相差观察（明视野） 4.偏光观察 5. DIC观察（微分干涉） 6. RC观察（浮雕相衬） 7.荧光观察1.明场观察方式1.明场观察方式常规观察方式 应用领域： 常规镜检、病理、染色标本 优点： 视野亮度高、均匀， 应用范围广， 操作简单，价格低， 物镜适用于荧光观察 缺点： 透明标本对比度低， 标本没有立体感明场观察显微镜的调节明场观察显微镜的调节瞳距调节 屈光度调节 光路转换 聚光镜中心 孔径光栏设置瞳距调节瞳距调节刻度指示屈光度调节屈光度调节调节屈光度调节指示光路转换光路转换100%80%20%100%聚光镜中心调节聚光镜中心调节⑤ 光轴中心调节螺钉 ③ 视场光阑③ 孔径光阑②10X物镜① 标本④ 聚光镜升降旋钮孔径光栏调节孔径光栏调节N.A聚=(0.6~0.8)N.A物 和物镜配合使用孔径光栏开度与图象孔径光栏开度与图象100%70%30%HR LCHC LRMR MC2.暗场观察（暗视野）2.暗场观察（暗视野）暗视野显微镜的结构及其效果照片（梅毒螺旋体和团藻属、水棉属）暗视野显微镜的结构及其效果照片（梅毒螺旋体和团藻属、水棉属）原理： 丁道尔（Tyndall）现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。null特点： 观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 ~ 0.004 um （明场0.4um）—“超显微” 。 缺点： 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高（灰尘、盖片、载片） 应用： 微小粒子、细菌形态观察、细菌计数，透明标本观察等3.相差观察（明视野） 3.相差观察（明视野） 相差显微镜结构及原理图相差显微镜结构及原理图原理： 利用被检物体的光程（折射率×厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。相差显微镜效果照片（迂回螺菌、肉毒梭菌、草履虫、阿米巴变形虫）相差显微镜效果照片（迂回螺菌、肉毒梭菌、草履虫、阿米巴变形虫）null特点： 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 缺点： 需要光强高 切片不能太厚（5~10um） 盖玻片、载玻片需符合 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜 应用： 无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞（培养细胞，分离细胞）null调节： 苛勒照明调节 将相差物镜及附件转入光路,对样品聚焦 取下目镜，装上CT望远镜， 调节焦距看到清晰的相差环 调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合不同类型的光学显微镜的效果图不同类型的光学显微镜的效果图说明：用不同类型的光学显微镜在同一条件下拍摄的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）显微照片：①明视野；②相差；③暗视野）4.偏光观察 4.偏光观察 偏光观察方式偏光观察方式原理： 依据波动光学原理观察和精密测定标本细节，或透明物体改变光束的物理参数，以此判别物质结构的一种显微镜自然光（多振动面）偏振器1偏振器2偏振光（单一振动面）null应用： 矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等5. DIC观察（微分干涉） 5. DIC观察（微分干涉） null微分干涉观察方法原理： 通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束在极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。微分干涉差显微镜照片微分干涉差显微镜照片null特点： 可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观 无须特殊物镜，与荧光观察配合更好 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。 缺点： 需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂 应用： 无色透明活体标本的细微结构，无色荧光标本，染色标本，显微操作等6. RC观察（浮雕相衬） 6. RC观察（浮雕相衬） 浮雕相衬显微镜浮雕相衬显微镜null原理：斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。浮雕相衬显微镜null历史： 1975年，Robert Hoffman 博士发明 2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品 特点： 提高未染色标本的可见性和对比度； 图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕； 可检测双折射物质（岩石切片、水晶、骨头）； 可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织； 聚光镜的工作距离可以的更长； RC物镜也可用于明场、暗场和荧光观察浮雕相衬显微镜null缺点： 观察效果与标本方向密切相关 操作较复杂 必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜 观察荧光效果不如明场物镜 应用： 所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作浮雕相衬显微镜7.荧光观察 7.荧光观察 荧光观察方法荧光观察方法什么是荧光 ?什么是荧光 ?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光荧光的种类荧光的种类自发（固有）荧光二次荧光荧光显微镜的作用原理荧光显微镜的作用原理宽谱线发射光（汞灯）滤掉其他光，透过激发光激发滤色片吸收滤色片滤掉激发光，透过荧光标本受激发产生荧光向四周发散激发光受反射、折射或衍射向四周发散荧光显微镜结构及其显微照片 （藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌）荧光显微镜结构及其显微照片 （藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌）荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察——荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的主要部件荧光显微镜的主要部件 透射式 吸收滤色镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯光源落射式 吸收滤色镜 分光镜 激发滤色镜 汞灯光源 五、常见电子显微镜 五、常见电子显微镜透射电子显微镜 扫描电子显微镜透射电镜的结构（和光学的比较）及其显微照片（奇异变形杆菌和T4大肠杆菌噬菌体）透射电镜的结构（和光学的比较）及其显微照片（奇异变形杆菌和T4大肠杆菌噬菌体）扫描电子显微镜结构及其显微照片（葡萄球菌和脊螺旋体）扫描电子显微镜结构及其显微照片（葡萄球菌和脊螺旋体）透射电子显微镜设备图透射电子显微镜设备图原核生物具有代表性的细胞形状原核生物具有代表性的细胞形状球菌和杆菌的电子显微镜照片球菌和杆菌的电子显微镜照片nullAverage size: 0.2 -1.0 µm  2 - 8 µm Basic shapes:nullUnusual shapes Star-shaped Stella Square Haloarcula Most bacteria are monomorphic A few are pleomorphic实 验 内 容 二 细菌的革兰氏染色实 验 内 容 二 细菌的革兰氏染色 一、微生物染色的原理 一、微生物染色的原理微生物个体微小，在光学显微镜下，折光性较小，反差小，看不清，所以要进行染色； 染色剂的选择 具发色基团——共轭双键（有时需要助色基团） 可和细胞结合——离子键、共价键、疏水键等 染色剂的种类： 碱性染料——美兰、碱性品红、结晶紫、番红、孔雀石绿（氯化盐类） 酸性染料——伊红、玫瑰红、酸性品红（带-COOH、-OH） 一般情况下，微生物细胞带负电荷，可以和碱性染料电离的正电荷发色基团结合，从而细胞被着色。 二、微生物染色的方法 二、微生物染色的方法单染色——1种染料（着色和不着色） 复染色——2种以上染料（使不结构呈现不同的颜色） 负染色——视野背景染色，所观察材料不着色 活体染色——TTC、美兰，利用活体细胞代谢中的脱氢作用。 三、革兰氏染色介绍 三、革兰氏染色介绍革兰氏染色是用来鉴别细菌的一种方法，利用这种染色法，可将细菌分成两大类。 是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰(Hans Christian Gram，1853~1938年)于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。 四、革兰氏染色法原理 四、革兰氏染色法原理细胞壁组成网状结构物质——微纤维——形状与硬度填充基质成分——胞壁间质——有无不影响形状，有则增强细胞壁的坚固性，可用化学方法处理而去掉 细胞壁成分和结构的不同 ①肽聚糖含量的不同（肽聚层的厚薄） ②肽聚糖层交联程度不同 ③脂类的含量不同G+细菌与G-细菌细胞壁成分的比较G+和G-细菌细胞壁结构图G+和G-细菌细胞壁结构图G+和G-细菌细胞壁结构图G+和G-细菌细胞壁结构图肽聚糖交联情况 （金黄葡萄球菌、大肠杆菌）肽聚糖交联情况 （金黄葡萄球菌、大肠杆菌）革兰氏染色的效果图革兰氏染色的效果图nullnull五、革兰氏染色法几个操作的作用五、革兰氏染色法几个操作的作用1、固定目的 杀死微生物，固定细胞结构。 保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉——蛋白质变性。 改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。2、卢戈氏碘液媒染的作用2、卢戈氏碘液媒染的作用在细胞内和结晶紫形成更大分子的复合物。 脱色时不容易被脱色剂脱除。 3、95%乙醇的脱色作用 3、95%乙醇的脱色作用作为脱水剂——引起G+菌细胞壁脱水收缩，造成细胞壁网孔孔径变小。 作为脂溶性溶剂——溶解G-菌的细胞壁中的脂质，造成细胞壁网孔孔径变大。六、革兰氏染色法的操作六、革兰氏染色法的操作菌种： 大肠杆菌（Escherichia coli ） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subitilis） 未知菌（前面实验中分离得到）实验步骤：实验步骤：在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水（用接种环取最好，量适中易风干）→接种环挑取少量菌体（无菌操作，接种环轻磕，水滴刚变混即可）→涂片→风干→固定（过火3~5次）→初染（草酸铵结晶紫，1~2分钟）→水洗→媒染（卢戈氏碘液1分钟）→水洗→95%乙醇脱色（直至无紫色流出）→水洗→复染（番红染色，1~2分钟）→水洗→风干→镜检涂片要求及示意图（演示操作）涂片要求及示意图（演示操作）设置对照（G+、G-） 涂布成雾状薄层（半透明，对光线基本无遮挡） 涂斑大小一般直径小于1cm。革兰氏染色操作演示图革兰氏染色操作演示图革兰氏染色操作演示图革兰氏染色操作演示图 七、注意事项 七、注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12~16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。介绍三步法介绍三步法黄元桐等. 革兰氏染色三步法与质理控制. 微生物学报，1996，36（1）；76~78 脱色和复染一步完成（0.4%碱性复红95%乙醇溶液）实 验 内 容 三 芽 孢 染 色实 验 内 容 三 芽 孢 染 色 一、芽孢染色的原理 一、芽孢染色的原理芽孢结构特点——具皮层（吡啶二羧酸-钙，DPA），渗透性较差，使其具抗逆性； 阻止染色剂的浸入——不利于着色； 一经着色后，也可阻止染色剂的洗脱； 经过复染后，就可以使营养体和芽孢染上不同颜色，而加以区分。芽孢的结构与着生部位芽孢的结构与着生部位2，6-吡啶二羧酸EX：孢外壁；SC：芽孢衣；CX：皮层；CW：芽孢壁；N：拟核；CR：核糖体芽孢的形成和萌发芽孢的形成和萌发细菌的内生孢子——芽孢细菌的内生孢子——芽孢二、芽孢染色的操作步骤二、芽孢染色的操作步骤菌种： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subitilis） 实验步聚： 涂片（可以稍多一点）→风干→固定→孔雀绿染色（1--2滴）→火焰上加热，冒蒸汽但不沸腾（不得蒸干，染液可添加）→保持4~5分钟→冷却→水洗（无孔雀绿流出）→番红复染5分钟→水洗→风干（可用吸水纸吸去水滴，但不擦拭）→镜检补充介绍：生物科学绘图补充介绍：生物科学绘图 生物科学绘图，不同于美术作品，它以科学性为标准，要求形体正确，比例正确，倍数正确，色彩正确，即形象必须真实。null1.生物绘图应具有严格的科学性 (1)形体（态）准确 (2)比例正确 (3)特征明晰 2.生物绘图应具有真实感 3.生物绘图需符合制板要求 (1)线条粗细规律； (2)图像明暗用点或线多寡衬托，不能用涂色方法来表示； (3)图面清洁，黑白分明； （一）生物绘图的基本要求（二）生物绘图的一般步骤1、选材 2、草图的绘制 3、定图与修饰（二）生物绘图的一般步骤1、选材 选材典型，有明显特征，有代表性。选题材后，要对其作细心观察，对它形态、色彩、斑纹等，各部分关系，比例数据等特征，要有个完整概念。1、选材2、草图的绘制(1)合理布局，画面大小要适宜、层次要清楚 (2)重点突出，主次分明 (3)物体各部分比例要正确 (4)落笔要轻，线条简洁 (5)点要均匀，线条方向与角度要准确 2、草图的绘制3、定图与修饰 检查草图无误后，接着就是上墨或着色。在定图时，还要做结尾工作， 包括： (1)标示比例 (2)标题和注字 3、定图与修饰本次实验的思考题本次实验的思考题1、对上周自己接种在三支斜面上的菌株生长结果观察，并做出描述和。 2、对细菌的二种染色方法及观察结果，绘图并标注说明。 3、如何判断未知菌的革兰氏染色正确与否？ 4、用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间滴加香柏油起什么作用?下周实验课的内容下周实验课的内容微生物大小的测定及利用血球计数板测定微生物的数量 要点： 掌握微生物大小的测定原理和方法（包括测微尺的校正） 掌握血球计数板测定微生物数量的原理和方法（包括死活菌在显微镜下的观察区分——美兰染色法）下次实验课内容下次实验课内容放线菌、霉菌个体形态的显微观察 要点： 放线菌形态的观察 （显微观察放线菌的三种菌丝形态特征） 霉菌的形态观察 （显微观察三种霉菌的形态结构特征）