透明质酸发酵液的絮凝预处理研究

食品 与发酵工业 Foxed and Fermentation lnduslries Vol 27 No．12 透明质酸发酵液的絮凝预处理研究 周荣清 郭祀 远 李 琳 (华南理 工大学轻化工研究所，广州，510641) 摘 要 通过测定 过媾摅饼常数、适光率及处理前后透明质酸浓度(cHA)的变化，分析讨论 了同絮凝j圭预处理 透明质醴发酵疆的台理性。实践证明：透 明质酸发酵最妊絮凝 预处理后， 不住可 大土 改善发酵砸 的固癌分离l薮果，司 时其滤清藏的纯度亦有 一定幅度 的提 高，在超 媾过程 中污染程度 明显减 少，渗透通量增加。 关键词 透 明质酸 ‘絮凝 携饼常数 透明质酸(hyaluronic acid简称 HA)又称 玻璃酸，是一类酸性粘 多糖，具有粘性强，保 湿性好，能润滑关节，困其独特 的分子结构 和理化性质而在机体 内具有多种生理功 能， 广泛应用于医药、化妆品l1 等行业。 在 1937年 Kendau【 等 就 发 现 了 StreptococcⅡs属 A族微生物具有生产 HA的 能力，但直到 1983年才有 日本专利报道了微 生物发 酵 法 生产 HA 的工 业过 程 。近 1O多 年来，利用非致病性 的 Streptococcus egui(马 链球菌)，StreptococcⅡs zooeptidomicus(兽疫 链球菌)发酵法生产 HA的研 究引起了国内 外众 多研 究者的极大兴趣l3 J。用微生物 发酵法生产 HA的过程通常 溶媒萃取法或 膜分离技术提取。 由于发酵液中含有杂蛋白、菌体等杂质， 不仅妨碍料液的有效分离，而且对其膜的污 染产生 r极为不 良的影响 。笔者等通 过滤 饼常数等的测定，对絮凝法预处理透 明质酸 发酵液进行了研究。 1 和试剂 1．1 药品和试剂 透明质酸发酵液 ：由四川省食 品发酵工 业研究设计院酶工程研究所发酵法产生 HA 课题 组提供 ；絮凝剂 ：聚 丙烯 酰胺 系 列 由 SNF公司上海办 啦处提供；壳聚糖，广J州凯 第一作者 ：高级工程师，博 士研究生。 收稿时 同：2帅1—03—21．改回时间 2001—10 24 利生物制剂厂产 ；G409，华南理工大学轻化 工研究所研制 ；F691，华南理工大学 化工所 研制。 1．2 方 法 (1)絮 凝效 果 的 测 定 过 滤滤 饼 常 数 法 ；透明质酸含量的测定：改 良咔唑法【 ； 透光率的测定 ：以水 为空 白，在 610nm 比色 测定。 (2)絮凝条件的确定：絮凝条件采用正交 设计。对 pH值、温度和絮凝 剂用量进行 3 因素 3水平的实验，选 用 k(34)正交表，每 个条件重复 5次，因素水平排列见表 1。 表 1 絮凝条件因素水平表 (3)过 滤常 数 的测 定 ：在 拟 定 的 絮凝条 件下，对发酵液进行处理，记录不同时间恒压 过滤所得清液体积，根据恒压过滤方程： d q = ，采用最小二乘法 求得过滤 常 数 K。 1．3 实验装 置 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 l2期 周荣清等 ：透明质醢发酵液的絮凝预处理研究 17 搅拌式超滤杯 (450 mI ，北京中科院膜 技术开发 中心)；721型分光光度计 (上海第 分析仪 器厂)；JB 2型恒 温磁力搅 拌器 (上海雷磁仪器厂)；cs5o1超级水浴恒温槽 (重庆实验仪器厂)；D25—2F型 电动搅拌器 (杭州仪器 电机厂)；PHS 25型酸度计(上 海伟业仪器厂)。 2 结 果 2．1 絮凝剂 2．1．1 絮凝 剂的 筛选 影响萃取或膜分离提取透明质酸的主要 杂质是蛋白质和菌体等，一般工艺中对此不 作处 理。为 提 高 分 离 效 果，根 据 絮 凝 原 理l1 ．进行 了有关絮凝剂 的定性筛选，结果 表 明：雕离子型聚丙烯酰胺(AN926)效果最 好(表 1)。 2．1．2 絮凝 条件 的确 定 2 1．2 1 正交实验 正交实验的结果如表 3和表 4所示，料 液的 pH值和絮凝剂 用量对絮凝效果有显著 影响，而絮凝温度对絮凝效果的影响则相对 要弱一些，这可能与絮凝剂及发酵液中 HA、 蛋白质等的分子构象和荷 电状况受溶液 口H 值的影响有关 。 表 2 不同絮凝剂的絮凝效果对比 宴验序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K I K 2 K 3 极 差 11 78 11 40 14 9 36 9 36 9 4 09 3 1O 63 0．63 5 43 1 69 4 37 4 86 2 55 3．40 1．11 5．12 丁 ：29．16 Ⅱ 3．24 表 4 方差分析表 注 ：*较显著 t 显著 2 1．2 2 絮凝剂最佳用量的确定 固定发酵 液的 pH 值 (6．5)、搅 拌速 度 (60 r／min)，絮凝温度 (45℃)，使絮凝剂的添 加量在(0～200)×10 ／mg·mL 的范围变 化，分别测定处理发酵液 的过 滤常数 K、滤 清液的透光率和 CHA，结果表 明当絮凝剂的 添加量是 100 x 10。／mg·mI 1，絮凝效果 以 ∞ 他 蚰 ：2 ” H 加 0 5 1 4 4 2 ， 1 5 ● 砧 粥 卯 北 ¨ 佗 0 5 1 4 4 2 3 1 5 ¨ 观 孔 弛 仲 腮 0 5 1 4 4 2 3 1 5 ∞ ¨ 鲫 仰 驺 加 0 5 1 4 4 2 3 5 们 帅 他 鲫 坨 ； ! i c 2 3 2 3 1 3 2 凹 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 维普资讯 http://www.cqvip.com l8 食品与发酵工业 Foc~l and Fermentalion Indust ri~； v[】I．27 No．12 壁 ! ： ：。 0 25 50 75 100 125 1 50 2【H】 注 ：表 中 的数据 居 7攻 实验 数据 的平 均 值 2．1 2．3 最佳 pH值的确定 固定发酵液的浓度、絮凝剂的添加量、搅 拌速度和絮凝温度，使发酵液的 pH值在 4．0 ～ 8．0的范围内变化。分别测定处理发酵液 的过滤常数 K、滤清液 的透 光率和 Crta，结 果表明 当 pH值 6．5，絮凝效果最佳(表 6)。 表 6 发酵液 plt值对分离效果 的影响的影响 DH值 4．0 5 0 6 0 6 5 7 0 8 o0 10 ⋯ ‘ 1．56 2．40 2．40 5．o0 4．30 2．∞ 透光章，％ 81．47 82．22 83．18 83．36 83．I7 82．如 fm L 1．12 1．14 1．14 1．14 1．14 1．11 }丰 表中的数据是 5戎宴驻数据的平均值 2 1．2 4 搅拌速度对絮凝效果的影响 固定絮 凝 剂添 加 量 (100×100／rag· mI 。’)、发酵液 pH 值 (6．5)、发酵液的浓度 cH^ (1．06／gLI1)和 絮凝温度(45℃) 改变 搅拌速度(30～120 r／min) 检测不同搅拌条 件下，絮凝处理发酵液过滤常数 K及滤清液 透光率和CHA的变化规律。结果如表 7所示， 在絮凝过程 中 适当地搅拌有益十分子间的 有效碰撞。从而提高 r絮凝的效果。但搅拌 速度过快。一方是分子间的有效碰撞增大 ；而 另一方剪切力的增加使己絮凝的聚合物被切 小 絮凝剂的分子链被切断，从而影响 』，絮凝 效果。表 7的结果也验证 r该规律 同时对 于研究的对象 搅拌速度为 60r／rain时，絮凝 效果最佳。 表 7 搅拌速度对分离效果的影响 2．1．3 不同预 处理 方 法所 得 滤 清液 对 膜 污 染 程 度 的 比 较 为进一步确定 HA发酵液絮凝预处理对 超滤膜的污染的影响，分别将发酵液离心，加 2％，0．4tool／L三氯 乙酸 90℃保温 20rain 冷却后离心的上清液进行超滤。测定膜通 量 的变化 其结果表 明，絮凝预处理 的上清液 通量降低最少(表 8)。 表 8 各种上清液超滤后真的遥量变化 3 讨 论 (1)透明质酸发酵液 因其粘度高，溶质的 分子质量夫。固液分离是相当困难的 不但过 滤速度 慢，而且滤液 混浊 并对后 续工序 有很 大影响 。 (2)透明质酸属聚合电解质，在一定条件 下有絮凝能力。同时亦 易与加入的高分子絮 凝剂通过架桥等作用，随固体物质被分离 因 此必须进一步探明所选絮凝剂与 HA相互作 用的关系。 (3)温度升高，胶体粒子的动能增大导致 碰撞机会增多，提高搅拌速度，亦增加了粒子 的碰撞机会，但温度过高易引起聚丙烯 酰胺 水解．搅拌速度过大其剪切作用会使絮凝物 被切小影响絮凝效果。其流体力学条件值得 更进一 步探 讨。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 27卷 第 l2期 周荣清等：透明质酸发酵液的 絮凝预处理 研究 19 (4)添加聚合电解质发酵液胶体 体系与 电位及流体力学条件对絮凝机理及动力学的 影响也是一个值得进一步探讨的课题。 致谢 四 Jll省 食 品 发酵 工 业 研 究 设 计 院 潘 红 梅工程师、赵萍工程师、享洁芝助理 工程师参加 了该 研 究的 实 验 工作 ．在此 致 以谢 意 。 参 考 文 献 1 Drobnik J．Adv Dnlg Delive．Rev．．1991 7：295～ 308 2 Forr~t K E et al J．Biol chem ，1937，137 61～ 69 4 Davidc A，M iechael R el a1． Appl Evniron Microbio1．，1997，63(7)：2 759～2764 5 K】m J H ，Yoe S J et a1．Enzyme Mi~ob Techno1．，1996，19：440～ 445 6 Michael R J， Goh I T et a1．Biotechnol Lett，1994，16(5)：507～512 7 安海平 ，姚 敏杰 ，陈德铭等 ．江 苏食品与 发 酵，1995．4：11～4 8 上海化工学院等编 化学 t程 北京 ：化学 工业出版社，1980．174～175 9 Bitter T ．M uir H Anal Bioehem．，1962 (4)：330～334 3 闫家麒 ，贾定武，赵 敏 中国医药工业杂 10 李庆杨等 ·数值分析 -武 汉：华 中理大学 志，l994，25(4)：l45～147 出版社，1986 101～103 The Study on the Pre-treatment of Ferm entation Broth Containing Hyaluronic Acid by Fiocculation Zhou Rongqing Guo Siyuan Li Lin (Research ]rmtitute of Light Industry＆ Chemical Engineering，South China University of Technology，Guozhou，510641) ABSTRACT The filtration cake constant(K)，percentage transmission and，the concentration change of hyaluronie acid in fermentation broth before and after preteatment were investigated． The reason for pre-treatment of the broth was discussed．It is shown that the solid—liquid seDara— tion have been im proved by flocculation；The purity of supernatant was increased in some con— tent In addition，th e pollution during the ultrafihration was decrease and permeation rate was in— creased． Key words hyalumnlc acid，flocculation，filtration cake constant 团囵 添加剂 CSPHP及其固体饮料的开发 最近．日本协和发酵工业公司在市场推 出 了以礴脂质 结合 性女豆多肽(CSPI-IP)为 主要成舟 的粉 束型 固 件饮料“阵胆 固醇、咖啡嚎～阵胆固醇、可可嚎”2个新产 品。CSpI-1P系来源干大豆的新材料，有 阻碍胆固醇暧 收 的作用。现潘加 CSPHP的各种食品 已由日本厚生劳动省(原厚 生省 )批准为特定保健 食品，兜许在商 品上 标 明有“降胆 固醇 的作用。 新上市的 2种固体 饮料都是可溶于水和 牛乳后戢用的速淳制品。每 1小包装袋含 CSPHP1 5g，30小袋 台装 1大包，售价 4 600日元。 谊产品 已于 2001年 3月开始正式上甫销售。CSPHP系女豆蛋 白质经酶解处理后，再 幂加大豆卵磷脂而 制得的产 品。其功能强于大豆，用量少效果好+可广泛添加应用在食品加工中。 维普资讯 http://www.cqvip.com