地衣芽孢杆菌β—甘露聚糖酶的制备

第 27卷 第 2期 张 峻等：地衣芽孢杆菌 B一甘露聚糖酵的制备 地衣芽孢杆菌 p．甘露聚糖酶的制备 张 峻 何志敏 胡 鲲 冯耀宇 张志钢 (天 津大学化学研究所，天津，300072) **(天津渤海化工集 团公司．天津，300040) 摘 要 提出了一种地衰芽孢杆菌 B一甘露聚糖酶制备 的工 艺。结果 明：在设定的操作条件 下，6．6L 自控罐发酵酶活可遮 260 u／mL。发酵液用 AICI3与竞聚糖絮凝预处理后，絮凝体喷 霉干燥 可制成 900u／g的酶粉，适鲁饲# 和造纸工业使用；絮凝上清液先 以平均截 留分子质量 5万 的中空纤维聚砜膜分离，连过_谊再 用平均截 留分子质量 1万的 中空纤维曩砜 膜浓缩后， 喷霉千燥可制或 1l000u／g曲酶粉，适合食 品和匮茹 工业使用。 以上 工艺酶 活．鲁收率 88％， 并易于工业放大。 关麓调 甘露聚糖酶 地衰芽孢杆 菌 制备 一甘 露 聚糖 酶 (endo．1，4．口．D-mannan mannohydrolase；EC 3．2．1．78)能 随机水懈 以 1，4糖苷键连接的线状或分枝的甘露聚 糖，特别适宜于水解甘露聚糖型植物胶(如魔 芋粉、角豆胶、瓜 儿豆胶 等)生产低 聚甘露 糖 ——一种双歧杆菌 的 有效 促生长 因 子_11。此外，口．甘露聚糖 酶还被广泛用 于食 品与饲 料 工 业、造 纸及 石 油 开采 业 等_21。 1995年，杨文博等人口]首先报道了产 口一甘露 聚糖酶的一株地衣芽孢杆菌，摇瓶发酵酶活 达到 110 I|／mL。本文在前人工 作基础上，报 道适合于工业放大的 甘露聚糖酶的制备方 法。 1 材料与 1．1 材料与设备 菌种 ：地 衣芽孢 杆菌 (Bac~lus licheni— formis)，南开大学扬文博教授提供。 固态培养基(g／L)：牛肉膏 5，蛋 白胨 10，酵母膏 5，NaC1 5，琼脂 20，pH7．5，0．15 MPa灭菌 30min。 6．6L自控罐培养基(g／L)：魔芋粉 20， *第一作者 ：博士研究生 。 天津市重大科技攻关资助项 目(编号 ：973103011) 收穑时间：2000—03—26 骨胨 30，玉米浆 5，(NH4)2SO4 5，Na2HPO4 4，KH2PO4 0．3，MgCh 0．6，cacb 3，FeSO4 0．01，Na2CO3 3，pH7．5．0．15 MPa灭菌 30 m i1"1。 发酵罐：B{oflo．ⅡC型 自控通气搅拌罐 (美国 NBS公司)。 中空纤维聚砜膜 ：PS1，平均截留分子量 (MWCO)5万；PS2，MWCO 1万(天津纺织 工学院膜天公司)。 1，2 方 法 1．2．1 发 酵 实验 将在 固态培养基(装液量 50 mL／250 mL 克 氏瓶)中培养 24h的菌斜面用 50mL无菌 水冲下制得菌悬液，接种于自控发酵罐发酵， 装液量 60％。 1．2．2 酶的制备 发酵液边搅拌(80～100f／min)，边 加入 A1C13(1g／L)，待 出现凝聚现象后，加入适量 壳聚糖，待絮凝体产生后，40 f／min搅拌约 2 min，静置，重力沉降约30 mln，将絮凝上清液 泵入超滤系统 (PS1)中，操作压力 0．1 MPa， 循环流量 30L／h，待料液浓缩 9～10倍后 (料 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol 27 No．2 液浓缩倍数=透过液体积／浓缩液体积)，截 留液与上述 絮凝沉淀物合并，喷雾干燥 制成 酶粉 A。收集透过液，以 PS2超滤膜进行浓 缩，操作压力 0．08 MPa；循环流量 24 L／h，浓 缩液喷雾干燥制成酶粉 Bc 1．2．3 酶活 力测定 参照文献[ ，以 pH7．0的磷酸缓 冲液代 瞽 pH9．0的甘氨酸缓冲液。 2 结果与讨论 2．1 自控罐发酵实验 为了给发酵扩试提供工艺数据参考，在 摇瓶发酵基础上，利用 6．6 L自控罐分别考 察了不同培养温度 (30、33．5和 37℃)、搅拌 转速 (450、600和 750 r／rain)及 通气量 (1： 0，5、1：0．75和 l：1 v／v／rain)对菌体生长 和 酶合成的影响。结果表明，自控罐分批发酵 最适操作条件为 ：培养温度 30℃ ±2"C，搅拌 转速 600 r／rain，通气 量 1：0．75(v／v／m／n)。 在该条 件下，培 养 36 h时发酵液酶 活可达 260u／mL。结果见图 1。 E 壤 赫 {墨 时间 ，h 图 1 甘露聚糖酵 6．6L罐发酵 曲线 2．2 混合絮摄 地衣芽孢杆菌发酵液粘稠且密度与水相 近，实验室中去除菌体的常规方法使用高速 离心机(8000 g以上 )，但高速离 心法不易 工业放大。如果发酵液用絮凝法预处理后。 则很容易进行固液分离【41。本实验选用安 全无毒的壳聚糖为絮凝剂，实验表明，单用壳 聚糖时，絮凝体虽然较大，但是 比较蓬松，而 先用 AICI，助凝后，再用壳聚糖絮凝，产生的 絮凝体紧密、体积小，便于 固液 分离，结果见 表 1。 衰 1 混壤作用效果 注：*(发酵液 A枷一絮凝上清液 A枷)／发葬液A枷。 * * 絮蕞上清液体积／发酵藏体积。 由表 1可知，壳聚糖用量以80mg／L为 宜，用量不足，选不到最佳效果 ；过 多则会使 已形成的絮凝团重新变为稳定的分散状 态， 并且会使料液粘度增加，絮凝体体积加大，不 利于固液分离。此外．由于絮凝体的回收利 用，不仅使絮凝处理基本没有酶活损失，而且 无需再利用离心机进行 固液分离。 2．3 超 滤 超滤法具有设备简 单、操作方 便、无相 变、无化学变化、处理效率高和节能等优点， 已广泛用于生物工程及 医药食品等工业 。由 于地衣芽孢杆菌 甘露聚糖酶的分子质量约 26kDa J，因此絮凝上清液 用 5万的膜处理 既可以去除残留的菌体，又可以截留高分子 量的杂蛋白，起到纯化作用。超滤采用低压 操作方式，以减轻浓差极化现象，同时利于蛋 白质分级分离_6l。料液循环浓缩约 10倍后， 透过液(酶 活收率约 65％)用 1万的膜进行 浓缩，保留液则与上述絮凝沉淀物共同喷雾 干燥 ，所碍酶粉酶活为 900u／g。此步操作酶 活总收率可达 98％以上 (仅少 量酶 被膜吸 附)。用 1万的膜进行浓缩时。浓缩倍数越高 体积越小，越便于后续操作。但是因为 PS2 膜对该酶的截留率<100％，浓缩倍数越高， 透膜损失的酶越 多。并且膜的透液量也会下 降，若不升高操作压，需时较长。因此，综合 考虑，料液浓缩 6倍较合适，此时酶活收率可 达 85％以上，见图 2。浓缩液喷雾干燥后所 得酶粉酶 活为 n 000 u／g，不含菌体，可用于 食品及医药工业，也可经进一步纯化，制备工 具酶。上述絮凝与超滤工艺酶活总收率可达 维普资讯 http://www.cqvip.com ／，27 一7 f 第 27卷 第 2期 张 峻等：地衣芽孢杆菌 甘露聚糖酶的制备 7 88％，并且易于工业放大。 ； 翟 浓缩倍数 图 2 浓缩倍数对酶活收率及膜的 透液量的影响 ● 毒 文 献 l KobayashiY，EchizenR．M a山 M el aI_Pro． ceedings ot the 4th Kiken Symposium on lme*tinal Flora．Tokyo．(Mitsuoka T ed．)Tokyo：Japan Scien— title Societies Pre璺．1984．69～90 2 Gollfl~ J．Steiner W ．B~otech．Lett．，1998， 20(8)：729～733 3 扬文博．沈 庚．佟树敏 ．徽生物学通报， l995．22(3)：154～157 4 阵驹声，胡学智 ．酶制剂生产技术 ．北京： 化学工业 出板社，1994，119～125 5 扬文博。佟树敏．沈 庚 ．徽生物学通报． 1995。22(6)：338～342 6 B akmhnanM．Agarwal G P．J．Memb． Sci．．1996，l12：47～74 Preparation of p—Mannanase from Bacillus licheniformis Zhang Jun He Zhimin Hu Kun Feng Yaoyu Zhang Zhigang (Chemical Engineering Research Center．Tianjin University。Ti in．300072) *(Tian]in Bohai Chemical Group Corp．，Tianjin．300040) ABSTRACT A process has been developed for the preparation of B．manrmnase from Bacillus licheniformis．The enzyme activitywas 260u／mLwhenincubatedin a 6．6Lfermentor underthe designed conditions．After pretreatment of culture broth using flocculants of A1C13 and chitosan， the floc Was spray-dried(900 utg)for use in feed or pulp ind ustries。while the supernatant was fractionated by polysulfone membrane and then concentrated by polysulfone membrane．The fiIla1 product was spray-dried (11 000u／g)for use in food or pharmaceutical industries．The proposed process resulted in the total yield Of B-mRla~ se activity of 88％ and is easily scale-up． Key words IxLRnnanose，Bacillus lichenlformis，preparation ≯( 世界葡萄酒市场稳定增长 一 20世纪世界葡萄酒消费颚呈稳定增长势头．全 都将在这里被消费。北蔓洲葡萄酒消费量将占垒球 球葡 萄酒的消费盘额从 1996年 的 780亿美 元、1997 的 8％．但消费额 将 占 15％．说 明北美 市场畅销 高价 年的810亿美元、1998年的845亿美元，增加到 1999 位葡萄酒。2001年．东欧昔萄酒消费市场增长速度 年的 880亿美元和 2000年 915亿美元，年均增 长 幅 将高于軎大地 区，其消费颚将超过北美。法国是最大 度不低干 4％。但 葡萄酒 消费量增 长速度 则要低 得 的葡萄酒消费国，1996年 的消 费盎 额遗 140亿美 元． 多．将维持在 220亿 L左右。消费量增长速度低干消 人均消费 242美元。葡 萄酒 消费盘颚较 争 的国家还 费额增长速度的情况袁明。軎国葡萄酒饮用者 已惫来 有：美国 112亿美元、荛国76亿美元、德 国 55亿美 愈倾 向于消费高档葡萄酒。 元、意大利 48亿 美元、俄罗斯 23亿美 元、奥地 利 20 2001盎。普通 纯葡萄酒 的消 费盎 额将提 高到 占 亿美元、阿根筵 l6亿美元、加拿大 l3亿美元、希腊 u 总额 的 75％．酒精音量高 的葡 萄酒将 占6％。西欧仍 亿美元、澳大利亚 u 亿美 元、比利时 6亿美元。 将是葡萄酒 的主要消费地 区．全球六成 上 的葡 萄酒 、静荽骧键 维普资讯 http://www.cqvip.com