核酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用

有机亿学 YOUJI HUAXUE，1 990．10，298~327 综述与进展 核酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 陈海宝 (出匿科学院上海有机化学研宄所，上海 200032) 摘耍c本文主要综进有机化学在建立核酸的顺宁 定法和自动l顶- 仪，在破译遗传窘码。在建立接酸片匿的化学 台成方法，圉稠合成法及DNA舍成 嚣设计，在台成许多。 生榜磐力的桂酸分子，在发展并完善 遗传工程 及 新近发现酶 RNA(Rfbozy田e)等方面的卓越贡献 最后简要地展望有机化学将对生物学发展作 出进一步贡献的几 个方面。 瓿葡t核酸化学，生物有机化学，分子生物学，核酸的顺序测定，桉酸的化学台成，遗传工程，蛋白质工程，酶 ． RNA，生 命分子的起源 ‘ The Role of Organic Chemical Research Oil Nucleic Adds in the De— velopment of Molecular Biology CHEN Hai—Bao (Shanghai m“it te oi Organic Chemistry，Academia Sinfca，200032 Shanghai) Abstract： This Paper reviews the role of organic chemistry on nucleic acid research in the following aspects=on the determination of nucleotide sequence and the establishment of DNA a~ios明 l／enter，oil the decipherment of genetic code，on the syntheses of many nllc|tic acids with biological activities，on the solid phase synthetic method and the design of DNA syn- thesizer as well，on the development and modification of genetic engineering， and on the recent discovery of ribozyme． Finally．the prospect of the contribution of organic chemistry to the further develop ment of molecular biology is dfcussed briefly． Descriptori nucleic acid chemistry bioorganic chemistry， molecular biology， nucleotide sequencing determination， chemical synthesis of nucleic acid，genetic engineering，protein engineering， ribozym e origin of lfie 白1953年Watson和 Crick提出了 DNA双螺旋模型的三十五年以来，一门 从分子水平上来 · 研究生命现象的新兴学科——分子生物学，正在迅速地发展着，它引起了学者们的注意。由于太 家共舄努力，尤其是生物学家的卓越贡献，迄今所取得的丰硕成果 已深刻地改变了生命科学的面 貌。对医学、农业、畜牧业等领域也发生了重大影响。 本文主要从核酸的化学研究来回顾一下，有机化学家在分子生物学的一些重大进展中作出的 成绩，并展望有机化学还将在l哪些课题中发挥重要作用。 有机化学对于核陵及其缘分的研究可以追溯到二百 多 年 前 Scheele和Bergmann对尿酸的结 构测定[】 ，而 1869年 Miescher首敬从脓液中分离含磷的核质(Nuclein)，这是人们把核酸作为一 个整体来研究的开端。裘 J列出 1953年前与棱酸坦分有关的化合物 结询 测 定和全合成研究的 大事记。其中重要的结果不仅直接被提出 DNA双螺旋模型的 Watson和 cr 瞬引隋 ，而且为 后来分子生物学许多重要进展奠定基础，并提供了有关的化学基础知识。 1988年 6月 7日收稿，1989年 1月27日修回． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 核酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 襄 1 与核酸组分有关的化台翱的发现、结构涮定和全台成研究太事记 1．核酸是嘌岭或嘧啶的 D核糖一或 D一2 脱氧核糖一N一糖苷通过 3 ，5 一磷酸二酯键连接 成的生物大分子(图 1)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 300 有 机 化 学 围 1 核酸的化学结构 这里显示的是 RNA的结构。只要把2 一碳原子上的 OH换成 H，把屎嘧啶碱基的 5 位 H换成 CH 就是DNA的结构。核醚的生物台成过程中，新加上去的桉苷酸 5"-三 磷酸被 DNA或 RNA链上的 3"-OH 亲桉进攻生成 磷酸二酯键，同时释放 出焦磷酸盐。 1990正 2．桉酸按其组分戍糖的结构不同可以分为两大类：即由桉糖组成的核 糖 核 酸 (RNA)和由 2L脱氧核糖组成的脱氧核糖桉酸(DNA)。 3．RNA 由四种常见的碱基，即腺嘌呤(A)、鸟嘌吟(G)、胞嘧啶 (c)和碌 嘧 啶(u)组成。 ’ DNA也由四种碱基组成，除了 A、G、C之外，胸腺嘧啶 (T)代替了 RNA中的 U。并且在所有 测定过的 DNA分子中A的摩尔数与T的相等，G的与C的相等。 4．核酸一些重要性质的研究，例如，酸性条件下嘌呤碱基容易脱落，得到无嘿呤的胸腺酸， 又如，罔肼处理 DNA，则使嘧畦碱基脱落，而得到几乎是无嘧啶的多聚产物。 为了便于讨论起见，对于 1 953年至今的发展 ，我们仅按棱酸的核苷酸顺序测定、化学合成及 RNA化学的新篇章等三方面来讨论。 棱酸的}袤苷酸顺序潮定 确定核酸分子中桉苷酸顺序最早由美国生物化学家 Holley等完成 他们用 二种核糖核酸 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 核酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 3o1 酶，即胰核糖核酸酶和核糖核酸酶 T 1，对最小的 RNA分子，即转移核糖核酸(t RNA)，进行选 择性酶解，然后对酶解片段的顺序进行测定，再用片段重叠法分析综合，最后便能确定整分子顺 序。但铡定 DNA的顺序时却遇到了极大困难，这是由于当时找 到一种酶可以选择性地酶解DNA 分子，对 RNA分子的顺序铡定也由于上述方法本身的繁琐，而仅限于核苷酸数为 150个 左右的 小分子。后来，虽然应用蛇毒磷酸二酯酶对 5 [”P]一寡核苷酸片 段 进行部分酶解，并对酶解产物 用电泳和同系层析进行双向分离而建立了双向图谱法 ，但也只能测 定 核 苷 酸 数为 20左右的 DNA片段，远远不能满足测定成千上万个棱苷酸组成的 DNA大分子顺 序 的 需要。啥佛大学的 Gilbert研究组在研究乳糖操纵子的操纵基困与阻抑蛋 白相互作用时，用硫酸二甲酯使 DNA分子 中的鸟嘌呤的 N 位和腺嘌岭的 N。位甲基化，甲基化嘌呤核苷的糖苷键不稳定而容易断裂 [37~3a] 糖苷键断裂后的核糖磷酸酯容易在弱碱性条件下经加热后发生 B一消除反应，而 使 磷 酸二酯键断 裂(图 2)。操纵基因和阻抑蛋自结合时，其中 G、A受结合蛋 白的屏蔽而不易被 甲基化，操纵基 因片段不被裂解，Maxam和 Gilbert就利用这一原 理来分离、纯化操纵基目 片段，以及研究它和 阻抑蛋白的相互作用等。当没有阻抑蛋白时，这实际上是一个使 DNA大分子在 G、A处 选择性 裂解的方法，于是他们就系统地研究了选择性的化学降解法，为了弥}}上述方法中G的甲基化反 应比A的约快五倍之不足，他们利用酸处理DNA[”】，使之在嘌呤处选择性地降解，这就是(A+ G)的反应}他们还应用嘧啶核苷的肼解反应 ，使 DNA大分子在嘧啶 核苷处选择性地降解(图 3)，这就是(c+T)的反应。他们还发现 2mo!·L NaC1存在时可以抑制 T的肼解反应，而使C 与 T有所区别，这 就是对c特异的反应。将上述四组反应经适当处理后，在变性条件下，进行聚丙 ～ i帮生 ≯棼o cH 直 ’ ． HJ 且； ； 一 ÷ 一。 向 一} + ～ ． ． 。 ；_-。 一 O 0 图 2 化学降勰 DNA顺序测定法 中对 G专一的反应 (1)硫酸二甲酯将 DNA链中G的 『_7位甲基化，使咪唑环这一部分带有 电正性 (2)碱进攻 c-8位，使 c 8与N-9之舸的共价键打开 (3)哌啶 在上一步生成的带有开环碱基的糖的 c_l 源子上进行取 代反应，并催化 消除反应而切开核酸大分子链。 维普资讯 http://www.cqvip.com 3O2 有 机 化 学 1990妊 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，就可得到图 4所示的放射自显影图。从图上的色带直 接就可读出被铡 DNA片段的桉苷酸顺序。这就是 Max苫m—Gilbert的化学降解 DNA顺序测定洼 】。 ‘H‘●● 图 3 『七掌降解 DNA顺序测定法中的肼解反应 肼进&滴臃嘧啶的 c_4 I}『1 C一6，并打开嘧啶环 ，同时与 C一4，C一5}．1 C一6 蠼新的五元环 ，进一步肼斛厦如释放此吡唑酮和由胁 。谊啶 N—l—c一2一 N-3生成 的!正祟，DNA 链中这部分糖转化成糖路，最后哌g：处型引起 消除反 而叻开 DNA链。 6 G ^ C + T C ●■■ ‘■- Jl 、 - ●～ ●、 一 ‘ 、 _-- ● ‘ ● - ●．．- ^ 。 ● C 一 圈 4 Gilbert—Max．am的 DNA囊序 测定放射自显影圈 DNA片段顺序为 叫 CATAAGCTCGCGTT— GATTAA⋯，色带自下而上阅读，每鲺色带 上的字母 G，G+A，C—T和 c分别是相应 的专一顺序反童 ^ ^ T f ^ G f T G C G C T C 6 ^ ^ r ^ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 核酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 3似 与此同时，英国医学研究中心(MRC)的 sanger研究组也进行了核酸的桉苷醴顺序测定研究， 他们应用了 DNA的复制原理 。即在 DNA的体外复制体系中，分别进行 四担复制反应，每组 反应除了有复制酶 、目 物和四种脱氧核苷三磷酸(其中之--La- p]标记)外， 他们成 功地应用 了 2 ，3 双脱氧核苷三磷陵作为碱基特定的复制链终止剂。这四组反应后的产物经变性处理后， 也同样进行 PAGE，从放射自显影图谱上的色带就可以 直接读出被测DNA的顺序(图 5)。这就 是 Sanger的双脱氧末端终止法测 DNA顺序。Gilbert和 Sanger因此丽和其他学者一起荣 获 1980 年诺贝尔 化学奖。 圈 5 Sanger双脱氲隶端终止洼涮定 DNA腰序 DNA片段顺序为GC'CATAAGAGAAGAAGAT GACAATCAGCGGGATGATGAAGTGGA CCACGAACAT⋯⋯，色带 自下而上阅读 ，每 组色带上的字母A，G，T和C分踟为相应的 终止末端碱基。 最近，DNA顺序分析方法又有了新的发展，加州理工学院的 Hood研究组 在 上述 Sanget方 法的基础上，用荧光试剂标记的引物结合激光和计算机数据处理技术发明了DNA自动顺序仪 a 其原理是先台成 50三氟乙酰氨基一5，．脱氧胸腺核苷 3I-亚磷酰胺，然后在 DNA台 或仪上 (见下 节介绍)台成寡核苷酸引物时，将此 5 氯基保护的胸腺 苷 接 到引物的 5t-端，从丽得到有 5t-氢 基的引物，然后用下面四种荧光试剂(图 6 a)与引物的 St-氨基缩台以标记引物。接着在四姐测序 的复制反应中，安排使荧光素(Fluorescein)标记的引物与A末端终止 反 应 匹配，使 NBD黄，四 维普资讯 http://www.cqvip.com §04 有 机 化 学 199o年 甲基罗丹 明橙以及德克萨斯红依次分别与C、G和 T终止相匹配，然后将这四组反应物按合适比 例混匀后，在一根聚丙烯酰胺凝胶柱上电泳，在电泳柱的下端用一个带激光发射的检出器，后者 与计算机处理器相联(图 6 b)，如图 6 b原理的 DNA 自动顺序仪每天能测定 8000个碱基的顺序。 最近杜邦公司推出新的DNA 自动顺序仪 “，原理与上述的相似，但采用四种荧光标记的末端终 止剂(图 7)，井用底部装有激光荧光检出系统的垂直式平板 电封：代替往电沫，这样可同时测定几 十个顺序反应产物，使顺序测定的速度提高到每天一万个碱基。 值得注意的是，上述各种顺序测定的方法都应用 PAGE作为 最 后 的分离方法。这是因为凝 胶的孔径大小可 以经调聚控制，分辨率高。使反应后的多聚核苷酸混合物按分子量大小分离，即 使只有一个核苷酸的差别也能分开。 由于 DNA顺序测定方法的重大突破，人们现在已决定测定人的染色体基 因，其总 量 为 3× lO。接苷酸单位。今年美国国家卫生研究所和能源部分别决定以二千七百万 美 元和一千二百五十 万美元支持这项耗资巨大的研究，估计总经费需要三十亿萋元，现在已有三个圈家实验室开始了 具体工作 。 需要强调的是 DNA顺序分析之所以职得如此巨大的进展，除了上述化学方面的 贡献之外， 生物学家的卓越贡献也 有 决 定 意 义，特 别 是 Abet，Smith和Nathans发现了限 4性棱酸内切 酶 】，能把成千上万碱基对的天然 DNA大分子切割成链 氏约为几百个 基对的片段，使顺序分 析成为可能，当然要实际测定一个有完整功能的DNA大分子顺序，还涉及许多方 法，某些对象 还要进行特殊研究，测定顺序只是其中一部分工作而已。 DNA顺序方法还在发展之中，据有关资料 ， 日本科学家两年 内要创造 每天测十万碱 基的仪器。而最终 目标是希望每天测一百万个碱基。 TETRAMETHYLRHOD~Mt rJE TEXAS RED 霉 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 l翎 桉酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 图 6 DNA 自动顺序 定仪爱四种荧光染科 a．四种染料及其激光荧光光谱：一 萤光蠢i‘⋯ ， NBD黄，一⋯ 一．四甲基罗丹明 橙j ． _ 一 ． 一 一 ， 德克萨斯红。 b．1DNA自动顺序仪示意图 、 C．DNA 自动顺序仪的理想捡出结果 特定顺序的低聚和多聚核苷酸的化学合成 305 核酸的化学台成就是如何实现棱酸的组成单元——核苷酸——之间按特定 顺 序的 3 ，5 磷 陵二酯髓连接。1955年 Todd 首先台成了县响 3 ，5 磷酸二酯键的二按苷酸。 ’ 桉酸的化学台成研坑，从磷膝二南法 。 到磷酸三酯涛 直到今天被广泛 采用的亚磷酰胺 ’ r 三酯法 】，其经历了近 30年。核陵合成研 究从它的开始阶段就显示出对分子 生物学 f究的推动 作用，、而今天儿乎没有一个生物学领域不 在用或设有潜力用台成的核酸(片艘 )进行研究。 ¨ 坛 吼 c c ( { S 6 C G 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1990年 C．Sl● 圈 T 四种带荧光标记基团的双脱氯榱苷兰磷酸 碡酸二蘸法合成的低聚核苷酸片段用于破译遗传密码研究 遗传密码的破译是多学科协同努力的结果。首先，经过许多学者的努力，五十年代后期建立 了无细胞的蛋白质台成体系 1。接着，Crick等明确提 出了三联密码的遗 传学证 据 。1961年 Nirenberg等发现：无细胞的蛋白质台成体系中，多聚尿苷酸指导聚苯丙氢酸 的 台 成[5“ 。 1964 年，Nirenbcrg还发现化学合成的各种桉糖三桉苷酸只能促使特定的氢酰化tRNA与核糖体结合， 例 GCC只能使丙氨硫化 tRNA与核糖体结台，并 用 这 种 核 糖 体结台实验测定了五十多个密码 子 。Khorana当时对转录研究有兴趣，对依赖 DNA的 RNA聚台酶 进行了 研究，并发现作 为模板的寡聚 dT不管聚数多少，经过 RNA聚合酶作用后，转录产物多聚A都是高聚物。后来， 当他访问 Kornberg实验室时，用带去的寡聚 d(AT)．(H=3～5)，经 DNA聚台酶复制后，也得到 高聚的 d(AT)⋯ 这些实验结果表明，这二种酶对化学合成的低聚核苷酸片段有 放大 和“增殖 作用。于是他勾划出一 啊 用化学食成的穿褰接蕾酸来破译遗传密硒的研究方案(图8) 旦塑照 塑塞 照 壁萱睦f垡望宣盛 体台 寿k． RNA聚合酶 茧 白仟 }萧 五 DNA聚旨酶 ===={巳知顺序的多臻桉糖桉苷琏— 叫 巴鲤婀 圭 l 。 ’! I l RNA聚合酶 j ； 一 + ’ 已知顺序的多采脱氧接苷酸 ． 圉 8 化学合成的寡聚腰f氯榱苷酸片段用干破译遗传密码的研究方橐 在六十年代中期，他用磷酸二酯法台成丁各种组台的寡聚核苷酸，斟 9是 台成三．桉苷二磷 廿 I_ O 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 桉蘸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 0 I} 眦 。-- P l O ^ C H, 0 ]~ 0 ， l + O IV + lI ， 0。 q ! NCCHlCH 0一 ． 一 0-- p=-0 V IV { 。 ， ： - jl R，R ，R”；Thymine， cetyJg 龃 jne，N-~nzoyladenine or～一am oyJcytosjne ， 凰 鼠 台威霖护的脱氧三棱苷酸 通用方法 TAGATA舌 ． -． 、 ． TATCrAT l C 一 1 一e- AT P． ’ ． ． UAUCUAU~UAUCUAUCUAUCUAUCLeAUCUAUCUAUC一一 一 ． 1 l 。 ’毒 ryrLeuSerIfe 1l - 一 · ：in vitro pFotel。n synEhesJzing,system 、 一 一 ‘ ． ： TyrLeuSert~Tyr王 珥 一暑h — L ， _ ‘ 圈。To 合成的寡聚核苷酸用于 破译遗传密码的例子 化学台成的 dGATAGATA与 d TATCTATC 成j口图 E的DNA 双键，然后在 RNA霖 台酶作用 下只 ^ATP，CTP和 UTP三 种梭苷三磷酸 ，固 E只能转录出 含重复顺序 (UAUC) 的高聚桉 糖棱苷魏， 它为 mRNA，在体 外蛋白质台成 体系中合成出 (TyrLeuScrHe)一的采多肤，用 这种方式建立了 (uAuc)．与 Tyr，Leu，Ser，Ile的对应关系。 酸 的例子，当然 ~ z ---一个带保护基的核苷酸都还有一墨列制备反应，这里载不详述了． 将这些台成的毒聚核苷致竹蹬囊圈 8的研究方案，先甩DNA聚合酶或依赖DN。A的RNA聚 合酶，在试管中转求成高聚的RNA髑累舟子，然后，将这些蜘瑕 RNA住体 外 无细胞援自质合 成体系中指导蛋白质、多肽时台成。例如，’用d(GATA)。与d(TATC) 形成的双链DNA’片段为 ． 0 0 一 。＼ 薅墼．． 强擎 ～ ， 维普资讯 http://www.cqvip.com 308 有 机 化 学 19gO晕 表 2 含重复核苷酸顺序 mRNA 毒l舯体外蛋白质台成体系 台成的多肽l之氨基酸组成 M es enger _ ● Repeating Dm“cIe钟 PolyfU Poly A—G) Poly(U—G) Poly(A—C1 Atn~noacids incorporated Messenger Amino acids incorporated Repeating Trfn t l Ser—Lcu Arg—Glu Val—Cys Thr—His Repeating Trinucleot~es Polv(u u—c) Phe，Set．Lcu Poly(A—A—G、 Lys， GIu． Arg P0h fU—U—G) Cys． Leu— Val PolyfC—A A ) Gln． Thr Poly(G—U—A) Val，se￡ Poly(u—A—C) Tyr，Thr，Lcu Poly(A—U-C) He，Ser， His PoI~{G—A—U) M et， Asp Repeating TetranucZeo*ides PoIv(U—A—U--C) Poly(O—A—U—A Poly(U—U—A—C) Poly(G—U—A—A) Tyr Leu， Ile，Scr none Lcu， Thr， Tyr 襄 3 遗传密码裹 U 1 C Phc S r Phc． j Scr Lcu 1 Scr Leu Ser A I Val Ala { Val’ Ala 0 】 Vo。f Aia Val Ala A ∞ ffyr Stop Stop Asp Asp GIu Glu Arg A rg A 嘻 A r量 Set Set A垲 Arg G】y Gly Gly G ly U C G 模板， 经 RNA聚 旨酶 和 加 入 UTP， ATP， CTP使之转录成其有 UAUC重复顺 序 的 同聚 RNA 太分子，后者在体外无细 胞 蛋 白质 合浅 体系中，合成出 (Tyr-Leu—Ser—Ile) ， 这个有 重复四肽顺序的多肽 (图 10)。 他 们用不同组 合的低聚按苷楚进行类似上述的实验，得到各 种多聚RNA中的棱苷酸 顺序与相应的多肽产 物中氨基酸顺序的对应关系(表 2 a‘。 。 进一步综合分析这些数据，- 就揭示了遗传 密码表(表 3) ． Khorana小组的 结果 与 Nirenberg小 飒用 桉糖体结 合实验的结果是一致的， 两位科 学 家 因此而与其他学者一起荣获 i968年 诺 贝尔医 学 奖。 化学和酶倦化帽结台舯方法建 立 了 DNA 大分子舯合成方法 在遗传密码的破译之后，分子生物学家当 时的注意力集中于基因表达的调节控制 蛋白 与核酸的相互作用以及核酸的顺序测定，而其 中特定顺序的双链 DNA的化学合成是一个 核 诅 d _圭 伽 №刚 印 哪哪l蓦 U C A G U C A G 5 S 1 1 r f S § _耋_耋 胁 m m m l亘r量 m 球 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4筋 桉酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 309 心问题，Khorana最早致力于DNA大分子的合成研究。由 于 他 估 N-YTJL粹的有机台成 在桉 酸 台成研究中的局裂洼，疆此 ， ’算利用积链DNA 段钧互种特肚⋯ L1 1960年i 以T !力幢板， 使dA。经水落学 DCC缩合成二聚体dA 。。虽然得率很低，但从原理生卺，这是一个对 按 酸台成 研究有鼓舞性的结果。1965年 ，美国 CorneI1大学的 HolIey等发表了黪母西氮陵转移核糖核酸的顺 序测定结果后，他们就决定龠成这个转移棱糖棱酸(tRNA)的基因。 而正当他们按双段 DNA片段 的配对原 理合成带枯性束端的双链 DNA片段时，．，．务核苷酸磷酸化激酶 和 DNA连接酶被发 现 了 。于是，他们就采用化学和酶催化相结合的方法，首先将 母丙氨酸 tRNA的基因分成十五 个片段(圈 11)，并且用磷酸二酯法将它们合成，’然后经多核苷酸磷酸化激两和[Y一 PJATP，将每 一 个片段进行[5r_3~P]-磷酸化， 接着用 DNA连接酶连成 A(卜4)、B(5—0)和 c(10—15)三个大片 段，最后再将这三个大片段总装成完整的基因 。由于当时对这个基 的 吲控机制很少了解， 因此不能对这个基因的转录等工作进行研究。后来，Khorana等又决定去合成另一个屉示生物活 力的基因，即大肠杆菌压制 tRNA ”前体基因。当时英国瓠桥 MRC实验室的Smith和Altman较 充分地 研究过这个基因[日 国画撇 观夫肠杆菌 tRNA 与压制 tRNA 之 司的区别是反密码子 GUA突 变 为 CUA，这里设_『个碱基的差别，就使原来识别 Tyr密码 予的 UAC突变为识别终止 密码子的UAG,致使经 靖李而譬 q 毹 警复蛑站_人正在延伸的肽链上，这 就是这个转移核糖核酸阻断蛋 最台成的原理 有趣的悬 募剖 I， rA 却能使突变的噬菌体 ． 19： 17 G： 艘 4：；：⋯ ． 。再 秆杆 彳彳 ⋯v【A] ． ． ． 一 —c-{ — ． - G --G--A --C—-T- 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tRNA前体基目的DNA双链，最暑是 2"1 m 基对的终止瞳 毫 混 后这部分中，16剞与天热来源 的植随'、杂下部分是改变过的联净，其f 咆寸青UeoRI识男 艇毕。{ 卜方庸走下方珀 栅的殁链片段系天然来源的基 因在这个部姓旺有的牺序。 一 80得到“医治 而恢复正常。这就为Khorana 宪坦避# ·个 会{ 合成这个 自生物学意义的分 子，并且一旦台成届孰能 定 的活力。于是设计了包括詹勒医[ l檄基对(b．p．)]压制tRNA” 前体基因(126 b．p)终 遁(} b．口．)以及为霹组到 ^啦蔺体所需的限制性内切酶 Ec。RI识别顺序 共计 2．0 6 b．p．的 双链 DNA分子(图 12)。经 过六年努力．一她们钕篓似 于合成1RNA “ 基 因 的方 盛 拦 鍪一 蕊 锈 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 核酸的有机化学研究在分子生物学发展中的作用 311 法合成了这个人工基因[e1]，并将它重组到载带 Aam 32和 Bam 1突变 的 噬 菌 体之中，显示了 活 力[ezlo 中匿合成了具有生物活力的 ]RNA 我国科技工作者在完成了胰岛素的化学合成之后，决定向另一大类生物大分子——核酸的合 成努力， 由于第一个被测定一级结构的 RNA，是酵母丙氯酸转移核糖核酸 (tRNA，“ )， 因此我 们就决定合成这个分子。 ． 合成 RNA比台成 DNA难得多，这是由于前者的单体——接糖核苷酸比后者的多一个2'-羟 基，这样不但在单体保护方面增加了繁复的步骤，而且也使3 -磷酸的活性大大降低 从而燕核 苷酸之间的缩台产 率大大降低，这方面笔者已写过综述 ，这里不再重 复。我 们 首 先 用 磷 酸 二酯法化学台成了十多个低聚核苷酸片段，它们 都 相 应 于 tRNA 的组 成部 分，然后，每个 片段的 6 端[ P]-磷酸化后，用 T|RNA连接酶将它们连接戒六个大片段，后者又进一 步 被 连 接成分别具有 35个核苷酸和 41个核苷酸的5 r-和 3r_--个半分子，最后将这二个半分 子 在 配_对 条件下 利用二个半分子的空间构象和它们之间的碱基配对连接成具 有 正 确 构 象 的 t础 A， ‘ (圈13)[e41。 l 经纯化后， 这个合成的tRNA ‘，在体外无细胞蛋 白质台成体系中具有接受和转移 [。H]—丙 氯酸剥蛋白质分子中的功能 。这是国际上第一个人王合成的存播力的RNA。日本学者池田森男 和大璩荣 等虽然当时也在从事甲酰甲硫氨酸转移桉糖核酸(~RNAlM e L)的台成，但由于他们合成 的产物中波有稀有碱基，因此严格地讲，他们只台成了一个类似物，只具有银弱的氨基酸接爱活 力 ，而没有转移活力。1988年 ，加拿大学者 Ogillvle发~T-tRNA r ‘的全化 学台成结果，由于 也不含修饰核苷酸，氨基酸接受活力也极微弱 。 磷戤量鹭 法合成的 DNA片段成功地甩手鼍传工程研究 遗传工程是分子生物学从基础研究1旬应用领域扩展并显示出威力的一个领域，它主要应嘻桉 酸生但相分-子遗传学的基本原理，对那些不易得到的蛋白质分子，通过天然分离或人工合成l其相 应的结构基因，用基因煎组的方法整台到质粒中去，。后者转化经过适当处理螅宿主 细胞， 如 大 肠杆菌，酵母或真核细胞等，使宿主细胞经过培养后产生它们原来不能合成的磕白质。 遗传 工 程中第一个成功的例子就是化学台成的促生长幕制抑素(~ tost鲥in>的结 构 基因(简称 I基 因)，经过遗传工程方法(图l d)，使大肠杆茁产生这种昂贵l舶多肤激素 麓者对此已有专文介 绍 ”。这项成果的实际意义，在十年后的今天察看鼹 囊狮明显 它开创-了遗传五程进入实际应 用的时代，对医学、农业、畜牧业及人类生活均带来浑运的影响t A，胰岛露A、B链的结构基 因也被合成、并成功地在大肠杆菌中得到表选，导蓬可以应用细旨生产人胰岛索 ”。迄今至少 有3o个人工基因被台成(表4)，绝大多数已在各种台适的体系申表达，使人们得到按自然来源 很难得到或不易研究的多肽激素或功能蛋白质。台成基因日}手下述原因是遗传工程和蛋白质工程 的重要工作之一 在生理上起重要作用的多肽激素在生理祭件下数量极少，要研究它们的结搀与 功能关系或扩大其药用来源，应用人工台成的基因寒进行遗传工程是太量T生产这些多肽激素的有 效途径。许多真核细胞产生的蛋白质，它们相应的 mRNA 琵经过转录后加工剪切而成的 ，虽然它 们的蛋白质一级结构可 通过氨基酸顺序分析或通过对相应的基因库分析 而 测 定，但在 mRNA 不易分离纯化的情况下，按裘达体系的密码子系统来设计相应于其氨基酸顺序的结构基 因，是这 类蛋白厩遗传工程的重要方法。近年来， 预先设 。的合成的人工基因来进行基因突变当然要比 天然的结构基因方便得多，自由度也大得多。关于这最后一点，下面将要详细 讨论． 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1990芷 特 犍永 样g +幛 ．讲k鞯划晡懈抖鞯譬 景 ．g 墨【隶捌鞣 《z粤 g 镬如 叠 晕 {f 岱 怛 岳匿 譬《 ：}’罂 赡滥龉 嚣 ，￡譬岳啦裁槛社蜒媳 靴臣 露 君 蕉川杠壁忙魁 瑚鹾蛙 哥}盏 越中 赫 l兽键蟾避魁鞋柱 谁君 磐谧器谣嚣 ．∞ g爵 晋嚣醒 制 征 蓬罂 兽噬 罂啦 赫冒一醐 缮 ．∞ 牟} ． ．翟钠钠暑 ； 乏 ￡I_田 ． ≮ 。 0 j{u v) ● ． ；毛 ．． f； ． 她 譬 f_ ． ●●●●●●●●●●●●●●●-●．_●．h ●-_●_●I_■■■■l_．●『‘●●Iln●●●●rJ■●■■■■■■■■_Jt●1l●●J●●I●l_ll_l-●t●●●●●●●●-Il 】l¨1{¨u 一 一 】l0】l! =! n 一 ． ． 一 Il_ t t uu 。《0c00 ] 0 c09J0 0 c l】0L。寸 一 juu0000l【l 00 《a 000ct 0u口 【1ln0 8 G‘ ÷ -J 《 Lt‘)一 0u《u090u) t0000] t00 c u_]u 6”【】《000 I- _J0 lt《uu 0U]0u00《0 00一 0tl】|]々 0uu u c0t0t000 H．c u 。” ul】(z t 一 ， 0．z 一 ． t^A 一 ● ‘● ●● l ■_ 1 ， ●1 ● ●● ● ●● ●I ●， ●● l ，●I 1 ● 1 ●1● ●● J ●● ■ r■ ■ _■● ■ ■_ _ J ■● ● 1 ●● ● ●● ● ●● ● ●● ● ●● ● ●1 s 。 v 0一 3uuu 0 =u0uu《08 u凸0 08 0．1u0000 000 =_ z ． 呻 CIfl(_000_1u0～Eu0u0 0_】u00 ‘． § 一 ‘ t L^： 一 0g3u0 0百 u0u 口000口0《 啦^ u L050uu00u0 u0u0 口0u0口0《 ， 性 ． ．1_ ． ¨．! j0u00一E ；0u8 0 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 转酸的有机 拦研究在分子生物学发展中的作用 襄 4 人工合成的基 因汇总裹 Year of Synthetic Geiie Publication for 1979 Yeast Alanine 【RNA 976 E coli． tytosinc tRN A sUrf)resgor 197 Som atostatin i978 Human insulin A ＆ B Chains 1979 Bradykinin l 980 Thym osine-~I 】980 Poly(I-Asp-1一Phe) 】98】 Human leukocyte interferon一01 199 l l 7-Desam ldosceretin 198 J Mini—C aealo8 of H proinsulln 1992 r~-Neocndorphin 1932 Human-like proinsulin ＆ orsproinsulin 】982 H um an urogastrone 】983 1983 Human interferon 1983 Htllnall intetfcron-~2 1983 H um an interferon一丫 1984 1984 198 4 H uman proinsulia 1984 Ribanuclcase S 1984 Protease inhibitor cglin C 1984 H um an growth hormone 1985 Som atom cdin C 1985 Human complement fraoment Ca 1986 Bovine rhodopsin 1986 Human lysozyme 1986 I986 R ibonuclease Tl 1987 Bacteriorhodopsin 3】3 Num bers 0f b．P． Method Authors 44 277 A A B B Khorana et a1． Khorand ct al。 Itakura et a1 Crea et a1． Korobko et al W etzel et a1． DOel et a1． Edge et a1． M i ． xoshi et a1， W etzel et a1． № ore R N o E． E． E． E．(72) E． E． E．(76) 59 61 Tanaka et a1． E． 90， 9i Brousseau et a1． E． 82 (83， 84， 85) Smith et a1． Urdea ct a1． Nagasc et a1． Eflgc ct a1． Tanaka et aJ． Jay ct a1． Engels et a1． OvcbinnJkov et a1． Nam biar et a1． Rink et a1． 1kehara et a1． Buell t a1． M andccki Khorana M uraki et alI． ikehara et a1． Ikehara et a1． Khorana et a1． A．磷酸二酯法 B．液相磷酸三酯法 C．固相磷酸三酯浩 D． 固相亚磷酰膝三醋法为基础的 DNA台成仪为避传工程、 究工具 周相孤磷酸蜡，包括亚磷酰胺法 蛋白质工程的发 展提供了有 效的研 跨八n十年，e，DNA合成化学研究中有三项煎犬发展。第一项是将 自羼 化学家Merrifield 创造韵 固相{去 合成多肽的技术成功地用于磷酸三酯法合成 DNA片段 Edge等 于 1981年 ∞ r二 珀 B B B B B C C B 驺 ㈨ 蚰 川Ⅲ拼 舳 盯 鹊 聃 蓦：叭 s{ _宝 盯 鲫 ∞ ∞ n n n n n n 艮 E 融 n B n № n D D C C C D D B D C C C D D C C C C m Ⅲ叭州 ㈣ 川 咿 Ⅲ三耄研 维普资讯 http://www.cqvip.com 314 有 机 化 学 1990罐 bE～E1【C CODE ． I Chemicol ‘ 0NA Synln音s ． i ’ D 60 J F， 0mP rs } ’ p { 。cII_ t P．．．1 ”‘ i ln Vi¨ O 0e “ ． { c。如∞ ． ． ～， la G c¨ L r- ‘。_ ， i 。 H。 c L'1． r hl P- 1 ’‘。 6 c『1ve Som口10s1口fl rr 图 14 促生长素抑制素基因工程计划示意圈 化学台成的 Sore基困与犬脑杆茁 吕一半乳糖苦酶基医融台在质粒 p丑R 322，此质粒转 化大肠杆菌，使之台成出融台蛋 白，后者在体外经溴化氰处理而在 B-半乳糖苷酶与 Sore的结台点半胱氧酸处切开释放有播力的促生长素抑制豢 发表了人自血球干扰素 o 结构基因的台成，它 是包括启动区、结 构 基因、终止区以及两端的限 f内切酶识别顺序共计 sI4 6．P．的双链DNA。 }=}f于采用了同相三酯法，提 高 了 每一步的缩台 产军、简化了分离纯化步骤，因此合成的片段长度有所增加，这样整分子的台成速度就加仗了。 第二项是Caruthers等改进了 Lets Jnger的亚磷酸三酯法[] ，用在室温下较 稳 定的棱苷亚磷 酰胳 取代化学活性走高、在宣温不稳定，而需要在低温(～ 8℃)无水条件下才 能 进行反应的 核苷亚磷酰二氯中间体。特别是棱苷亚磷酰=异丙胺，它可以 经 卜H四 唑 活化后与醇娄反盘生 成烷氧基磷化物。这一改进使得在 DNA 台成中颇有潜力的亚确酰三酯法能够应用 到实 际中击， 并成为现在广泛采用的亚磷酰胺三酯法。 第三项是上述二项发展的最终结果 导 至 DNA 合成自动化 现 在 采 用 控 制 孔 径 的 玻璃珠 (Centrolled pore glass缩写 CPG)做固相投体，把带保护的棱苷，通常是 51一D一双对甲氧三苯甲基 一 ， N一|虢基一2 脱氧桉苷，经过 3~_O-一T--酸酰的另一 个 酰 基与 先接上长链酯肪胺的CPG相 接， E』便 31-端的挟苷接到剧相藏体上，然后，按圈 l5的萧环进行按苷酸的绍 ， 反应，寡聚接苷 酸键逐个 由 3 端向5 端延仲，由于一般情况下只要用凹种核苷亚磷酰胺， 并且每个循环的反应 程序和条件都是相同的， 因此，Hood与 Carm~ers台作 发 明 了 微机控制的 DNA 合成仪 ， 它用高纯惰性气体(例氲气)驱动．每一个通向台成反应柱的开关 由教{=『1控制，这样，不 仪可以保 证反 过程 无水无氧的条件。F进行，而且可以使侮步反应十分精确。 由于在缩台反应这一步采 用-t’至二十倍过量的核苷亚磷酰胺，因此每个循环的缩台产率可以高达98％．台成的最长片段已 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4书 按陵的搴杌化学研究在分子生物学发展中的作用 _ _ _ ～ 一 一 ～ ～ 0 f『 CH1C STILL’．aT FURTHER f一 0CH， 囤 1 5 DNA台成倪每个循环的反应步骤 第一步脱帽，陵处理同翘树脂 【：故：特的核昔或多核苷酸，使之l兑陵 5"-O一三革甲基保护基 而显 出 5"-OH 第二步征化．核苷弧麟胺与 1_H一四溲混合使可E磷酰胺皤亿 第三步加成 ，十倍过量 的磐比的亚磷酰敝核苷与5"-OH反应 在亚磷酰胺烷氧基化的过理 加一个 的棱苷酸单位到 善 斜I 。第四步戴帽，用连餐醋酐将救肴参与反应的5 -OH加以保护，即乙酰化，阻止其 ]～抗下一循环的反应。第五步氧 化， 12-H：O节化新生成的三烷氧基磷，使之转化戚磷酸三酯 可达到 106个榱苷酸单位长。 晦梭督陵确帆食成l前进展为酶倦化连接或 延 伸 成 DNA六 分 子 方 法 的 发展创造了条件， Rossi等 用 冀 30瑶宵 1 0个 b，口．互补的寡榜苷 片段 (均为 十个孩苷 酸 岔 妊)，经过 DNA聚合酶延伸成肯 70 b．P．的 DNA 链 ，然后用限制陆内切酶处理形成的有粘性末端的双链， 再与另 一个用相同方敲得到的双链DNA连接台成了白细胞干扰紊 d 垡因的部位片段。最近陈常 庆等巧妙地应用这～身藩， 将台成的链} 为 i08个棱苷酸单位的舅 接苷酸，切胳保护基后不经过 分离纯化， 由事先设计膏勺3 端列稼的限制性内切酶 BamHI识别顺序的 自身配对，直接甩 DNA 聚台酶反应延伸复Iil：成双链 DNA，最后用内}7J酶 Bam H I和 HindⅢ处理后克隆进藏体质粒，而 合成了相应于胰翌内酶抑制剂类似物的结构基因 。陈海宝等 最 近 发 展了一个新的结构基 因台成方法(图 16)。这个方法的一个特点是，首先合成链 长 约 为 350个桉苷酸单位的基因单链 DNA(ssDNA)，用计算机辅助设计短的互补片段将特连接的长片段定位，使 相 邻 的几个寡棱苷 醴片段(30 7f个接苷酸单 妥)分步或一步 T DNA连接酶厦应合成 ssDNA。第二 个特点是， 直接将这样合成蛇 SsDNA 与线堪 受粒连接，连接帕产物直接转化大腑杆菌，在 体 内复制成所需 要的结构整团歧基因片段的双链。这些祈方法虽然没有 越出 Khorana骢定的台成 DNA大分子的 战略，但是在减少．[作盈 简化操作方面还是有所前进。特目 是基 因的单链合成过程 中，在片段 划分的设计：疗面可以较自田地安排。丽 固双链昀合战过罨 中，必须颢及双链分子糕性束端韵岛 身配对和异种分子间的错误配对对双链片段定位的干扰，在片段的划分方面就有种种限制。 ／ ． 咆 维普资讯 http://www.cqvip.com 3l6 HindIII 有 机 化 学 D口 — — — — — — — 。 — — — — — — — ’ — — — ‘ — — — ’ 。 一 I 。 ligase ^p帅 c p叶 pE★pF ，$t J liga =~ n wi ttt lin ear≯pla 囝 16 新的结构基因台成法 先一步法将六个寡核苷酸片段(A， pB，’pC， pD， pE和 pF)在片殷间互补片艘 (SIFCO)bc，cd和 de及端基互补片段 (TerCO)A，b l eF 存在下连接 茂洲t弓口的基 习的正股单锭 DNA(ssDNA)．然后经缒|‘后的 ssDNA ~(TerCO)A b川]eF 退史配 对后与太片段线性质粒连接 (这 里是 pWR 13 lm经 Hind||l和 Psi!双 酶解后产生的线 性 片段 )，连接产物直接转化宿主细胞后， 在体内复制成台成基 医的双链而完成 基 因的台戚 近十年来，DNA台成方珐的突 飞猛进，加上 DNA重组克隆按求和外源 DNA分子在异种宿 主中的裘达成功及方法的进一步完善，为以遗传工程为基础的蛋白质工程奠定了基础。但它有更 高的研究 目标和采