黑曲霉产木聚糖酶的研究

食品与发酵工业 Food and Fermentati0n IndustrieS v_0I．29 No．7 黑曲霉产木聚糖酶的研究 张年凤 赵允麟 (江南大学生物工程学院，无锡／214036) 摘 要 筛选 了 1株高产木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)An一238菌株，研 究了其在固 态培养基中的产酶条件。该菌株发酵 曲中除含有木聚糖酶 5 117 u／g(干曲)外，还有纤维素 酶 425 u／g(干 曲)，果皎酶 1 236 U／g(干曲)，蛋 白酶 22531 U／g(干曲)。 关键词 木聚糖酶，黑曲霉，产酶条件 木聚糖酶(1，4一B—D—xylan xylanohydro— lase，EC．3．2．1．8)以内切方式水解木聚糖分 子中的 p一1，4一木糖苷键，其水解产物主要是 木二糖和木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。 国外 已有 不 少 研 究 者 对 黑 曲霉⋯、木 霉 (Trichoderma sp．) J等真 菌及 短小芽孢杆 菌(Bacillus pumilus) J、环状芽孢杆菌(B ． circulans) J等细菌产木聚糖酶进行了研究， 国内也有这方面的研究报道 l6 J。文 中以木 聚糖酶作 为饲 用复合 酶成分之一。对 菌株 An．238的产酶条件进行了研究。 1 材料与方法 1．1 菌 种 An一238。黑曲霉 598经紫外、甲基磺酸乙 酯复合诱变获得。 1．2 培养基和培养方法 1．2．1 斜 面培 养基 PDA培养基 [7l。 1．2．2 产酶基础培养基 麦麸 8 g，豆饼粉 2 g，(NH4)2SO4 0．2 g， 水 10 mL。 1．2．3 培养条件 250mL三角瓶装 10g培养基，接入 1环 孢子，30℃培养 3 d。 1．3 酶 的抽提 向每个发酵好的三角瓶加 2％ CaC|2溶 第一作者 ：硕士研究生。 收稿时间：2002—09—10，改回时间：2003—04—22 28 液 50mL，在往复式摇床上于 30℃、120 r／min 条件下振荡 1 h，过滤得粗酶液。作测定之用。 1．4 酶活力测定方法 1．4．1 木 聚糖酶 活 力测定 Bailey法 】，在 50"C，pH 4．8的条件下。 每毫升抽提酶液每分钟 水解木聚糖生成 1 t~mol木糖的酶量，为 1个酶活力单位(U)。 1．4．2 纤维素酶活 力测定 CMC糖化力测定法[ ，在 40"C，pH 3．8 的条件下，每毫升抽提酶液每分钟水解 CMC 生成 1,umol葡萄糖的酶量，定义为 1个酶活 力单位(U)。 1．4．3 果胶酶活 力测定 Somogyi法[ ，在 50"C条件下。每毫升抽 提酶液每分钟分解果胶底物产生 1 mg半乳 糖醛酸的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。 1．4．4 蛋 白酶 活 力测定 Folin法【加】，在 40"C，pH 3．5的条件下， 每毫升抽提酶液每分钟水解干酪素产生 1 g 酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位 (U)。 1．4．5 酶 活 力的 示 将测得的抽提液酶活以固体干曲表示。 2 结果与讨论 2．1 培养基组成的优化 2．1．1 碳源 的影响 -￡ f， t } } 《 f幸 }t l f 专 t 毒 I { { } 譬 鼙 ￡ 孝 毫 } 芎 警 } 上 j ，lt } 辱 } 辱 { 鞋 唾 酲 《香 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 29卷 第 7期 张年凤等 ：黑曲霉产木聚糖酶的研究 在产酶基础培养基中，试验了 4种碳源， 浓度为干料的 2％。结果(表 1)表明，以木聚 糖(Sigama公司产 )为碳源时，菌株 An一238 产酶活力最高，其次为玉米芯粉，木聚糖 酶属于诱导酶。由于木聚糖系纯试剂，价格 较高，因此以下实验均用自制的玉米芯粉作 为碳源。 表 1 碳源对 An-238菌株产酶的影响 2．1 2 氮源的影响 在产酶基础培养基中，试验了 3种氮源， 浓度为干料的 2％。结果(表 2)表明，酵母膏 和玉 米浆对产酶 有一定影 响，添 加尿素对 An一238菌株产酶有明显的促进作用，木聚糖 酶活力提高 71 1％。 表 2 氮源对 An-238菌株产酶的影响 2．1．3 无机盐 对产酶 的影响 在基础培养基中添加无机盐 (浓度为干 料的 2％)，结果(表 3)表明，添加无机盐有利 于酶活的提高。其中添加 K2HPO4对 An一238 菌株产酶的促进作用最明显。木聚糖酶活力 提高 54．4％。一方面，可能是黑曲霉在培养 时生成有机酸，使曲的 pH降低，而无机盐解 离的阴离子对其能够起到调节作用；另一方 表 3 无机盐对 An-238菌株产酶的影响 面，可能是解离的阴、阳离子同时对菌株的代 谢起到调控作用。 2．1．4 产酶培养基 的正交优化 选择玉米芯粉、尿素、K2HPO4、固水比 4 个因素做 为影 响产酶培养基配 比的主要 因 子，分 别 以不 同浓度 选 择 3个 水平，列 表 (3 )(表 4)，经综合极差分析 (表 5)，得出 最佳培养基组 成为玉米芯 粉 2％、K2HPO4 3％、固水比 1：0 8、尿素 4％。 表 4 因素水平表 表 5 正交试验结果 实验号 A B c 。 2 2 发酵条件的优化 2．2 1 时 间对 产酶的影响 黑曲霉在静态生长 中能产木聚糖酶，且 其静态生长时间与产酶有很大关系。由图 1 可知，An一238静态生长 3 d比较合适，此时 正值产酶高峰，酶活可达 4445U／g(干曲)。 主 -- 主 羹 图 1 黑 曲霉 An．238产酶进程曲线 2．2．2 温度 对产酶 的影响 29 4 5 1 3 4 5 9 ： 舛 加 2 3 3 2 3 2 叭啷嘶 3 6 n 7 9 0 7 9 3 1 2 2 3 1 1 2 3 舵 8 5 7 3 0 2 3 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 " 7 7 5 2 6 4 6 0 1 2 3 1 2 3 1 2 3 " 1 2 3 4 5 6 7 8 9 I Ⅱ Ⅲ R 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品与发酵工业 Food and Fem entation Industries v01．29 No．7 利用最佳组成的发酵培养基在不同温度 下培养后测定木聚糖酶酶活。24℃菌体生长 缓慢，产酶能力亦低，30℃以上菌体生长虽然 旺盛，但产酶能力却低。这说明菌体生长最 适温度并不一定是产物积累的最佳温度，在 28～30℃产酶能力最高，如图 2。 主 羹 图 2 温度 对 An-238菌 株 产酶 的影 响 2．2．3 起始 pH 值对产酶 的影响 优化好 的发酵培 养基 起 始 pH 值 用 1 mol／L HCL和 1 mol／L NaOH 调 节，测试 5 种 pH值 (4．5、5．0、5．5、6．0、6．5)，发现在 pH 5．5时酶活最高，如图 3。 图 3 起 始 pH 对 An一238菌 株产 酶 的影 响 2．2．4 接 种量对 产酶 的影响 采用 0．3 mL，10 ／mL孢 子悬液接种较 为合适 (表 6)。接种 量过低会 使其生长缓 慢，发酵周期延长，而过高的接种量则会造成 菌种生长迅速，曲温升高，不利于产酶。 表 6 接种量对 An-238菌株产酶的影响 2．3 最适产酶条件试验 在最适培养基组成和最佳发酵条件下进 行实验，测得 4种酶，结果见表 7。 表 7 量适产酶条件试验 3 结 论 通过 对主要营养因子 与发酵条 件的优 化，初步确定了该菌株产酶最佳培养基组成 为：麦麸 8 g，豆饼粉 2 g，(NI-I4)2SO4 0．2 g， 玉米芯粉 0．2 g，K2HP04 0．3 g，尿素 0．4 g， 水 9 mL；适宜的发酵工艺条件为 28～30℃， 起始 pH 5．5，发酵 3 d。在此条件下，发酵曲 的木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶活力 分别达到 5 117 U／g、425 U／g、1 236 U／g、22 806 U／g。 参 考 文 献 1 G0khale D V．Bioteehnol Lett，1986(8)：137～ 138 2 Royer J C，Nakas J P．Abstract Annu Meet Am Soc Microbial，1985，85 Meet，236 3 Panbangred W ， Shinmyo A， Kinoshita S et a1． Enzyme Mierob Teehnol，1985(7)：295～299 4 Esteban R，Villanueva J R，Villa T G．Can J Mi— crobial，1982，28：733～739 5 蔡敬民，吴 克，张 洁等 ．工业微生物。1977。27 (2)：1～4 6 陈惠忠，高培基，王祖农 ．微 生物 学报，1990，30 (5)：351～357 7 诸葛健，王正祥 ．工业 微生物实验 技术手 册．北 京：中国轻工业 出版社，1994 8 Bailey M J，Biely P，Poutanen K．J Bioteehnol， 1992。23：257～ 270 9 Somogyi S．J Bid Chem，1952，195(1)：19～23 10 邬显章 ．酶 的工 业生产技术．吉林：吉林科学 出 版社，1998 蕾 毒 苷 套 毒 t§ 靠翟 § 考 l 童垂r警 童 《 §． t孝l { ●l }蠢f tt{ } i 辱 } l 唯 f哮 } l } ， l E} 《 謦 一善．1一一_暑．n／rr蛙冀 * ． ，一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 29卷 第 7期 张年风等 ：黑 曲霉产木聚糖酶的研究 Studies on the Xylanase Producer Aspergillus niger Zhang Nianfeng Zhao Yunlin (School of Biotechnology，Southern Yangtze University，Wuxi，214036) ABSTRACT Aspergillus niger strain An一238 producing high xylanase was isolated and its so lid state fermentation conditions were studied．The fermentation medium of strain An一238 contained xylanase(5 1 17 U／g dry medium)，cellulase(425 U／g dry medium)，pectolase(1 236 U／g dry medium)，proteinase(22 531 U／g dry medium)． Key words xylanase，Aspergillus niger，ferm entation conditions 『i『】■ 葡萄酒新将于2004年实施 国内许多生产 葡萄酒的企业在使用了近 1O年的商标中去掉 了“葡萄酒”字样，他们 一直用葡 萄汁加水、糖等原料配制的产 品今后将不得再 以葡萄酒的名义生产销售。根据有 关规定，从 2003年 5月 17 日起，凡不是 由纯葡萄汁酿造 的产 品不得再称为葡萄酒。为 了给相 关企 业一个缓冲期，市场上 的产品可 以继 续销售到 2004年 6月 30日，此后将一律按违规产 品处理。 所谓半汁葡萄酒是针对纯葡萄酒而 言的，根据国际通行标准，葡萄酒必须采用纯葡萄汁经发酵制成，惟独 在我国还存在半汁葡萄酒这一品类，即只采用部分葡萄汁与其他原料配制而成。据介绍，半汁葡萄酒是基 于 我国发展葡萄酒产 业初期 时特定的客观状况 出现 的产物，由于 "-3时社会消费水平和原材料供应等多方面因 素．一些企业通过部分葡萄汁加水及其他原料配制生产 了所谓 的葡萄酒，受到了市场 的欢迎，甚至在一些人看 来其 口感、味道 比纯正 的葡萄酒更适合 中国人，因此半 汁葡萄酒一直存 在下来。根据这 一客观情况，我 国在 1994年制定葡萄酒行业标准时还特 意制定 了(半 汁葡萄酒标准)。但 是，我国 目前无论是社会消费水平还是 原材料供应都与当年不可同 日而语，尤其是考虑到加入世 贸组织后我国葡萄酒工 业也应尽快与国际接轨 以 促进出口。国家决定废止(半汁葡萄酒标准)。 据有关部门的统计数据，以往在我 国市场上有至少 40％的葡萄酒属于半汁葡萄酒，新规定对这其 中的正 规企业并未彻底宣判“死刑”。它们除了可以通过兼并、重组、转产等方式调整产品结构外，也可以继续从事原 来的产品生产。只不过不允许再冠名为“葡萄酒”。有关人士指 出，这也是一个务实的决定，因为尽管这种产 品 在其他 国家是不存在的，但相 当数量的国人实际对这种配制的葡萄汁饮品颇有好感，在市场上有一定的需求， 只 不过 一直 被其 “葡 萄酒 ”的名 称误 导 了而 已。 据国家统计局 的统计数据显示，2002年我国葡萄酒总产量达到 28万余 吨，但 出口量仅在 4 000～5 O00t， 远不及 白酒、啤酒等 的出 口量。有关人士分析，这固然与我国葡萄酒工业起步较晚、水平 尚有差距有关，但 国 内葡萄酒标准不一、产品层次混乱也是影响出口的重要因素。据 了解，几年前 欧盟就曾发生因来 自我 国的出 口产品为半汁产品而全部退货的事件，因为在 国外是不允许葡萄酒中掺杂其他原料的。类似事件引发 了中国 葡萄酒在一些国家的整体形象不佳，即使国内几家 已达到 国际优质水平 的葡萄酒企业的产 品出 口状况也不 理想。为此．从 2003年开始实施的(中国葡萄酿酒技 术规 范)在很多 内容上都参照和采用 了国际葡 萄和葡萄 酒组织0Iv 的标准。向国际标准靠拢的趋势十分明显。 我国葡萄酒业目前仍处于前期起步和成长阶段，在我 国整个酿酒行 业 3 000万 t饮料酒总产量 中，葡萄 酒仅 占到 1％的份 额．在世界葡萄酒总产量中我国的产 量也只 占到 1．1％。2002年我国葡萄酒消费量超过 了 40万 t。从 1994～2000年，相 比于世界年产量 6．5％的增长率，我国葡萄酒消费增长 了61．8％，而专 家预测， 到 2006年。亚洲特别是中国将成为全球葡萄酒消费增长最快 的地方。 3t 。 爨 维普资讯 http://www.cqvip.com