小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移实验研究

小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移实验研究姓名XXXX大学xx学院xx级临床X班【摘要】[目的]掌握可移植性小鼠腹水癌淋巴道转移实验的操作过程；从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性；了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。[方法](1)细胞系获取（Hca-F）(2)615小鼠腋窝接种肿瘤细胞(3)组织取材(4)切片染色:石蜡切片法,H.E.染色法。(5)显微镜下观察[结果]16只实验小鼠中0只死亡，光学显微镜下观察，在皮下瘤体和同侧腋下淋巴结中发现同样类型的肿瘤细胞（即ＨｃａＦ），远处脏器未见到转移的肿瘤细胞。[结论]可移植性小鼠腹水癌经淋巴道向其他部位发生转移。【关键词】615小鼠；癌转移；Hca-F;淋巴道【文献标识码】A【前言】恶性肿瘤的转移是癌症患者死亡的重要原因。为了探索肿瘤转移的某些规律，并试图建立适用于研究肿瘤淋巴道转移的实验模型，从感性上认识肿瘤侵袭与转移的生物学特性,了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义，进行了此项试验。而Hca-F（F）,Hca-P（P）是从小鼠肝癌中分离出来的只经淋巴道转移的同源而具有不同转移能力的两株克隆细胞系，F细胞的转移能力明显高于P细胞，达到80%~90%，可以较好的运用于肿瘤淋巴道转移机制的研究。1．材料与方法1.1材料1.1.1细胞系：小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa-P，由大连医科大学病理学教研室建株并保存。1.1.2实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6~8周龄，体重18~22g，由大连医科大学实验动物中心提供。1.1.3主要试剂及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10%福尔马林固定液等。1.2方法1.2.1细胞系获取从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F）塑料冷存管，立即放入40℃的温水中，1分钟内使冻存液全部融化，立即放入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，用生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，再加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHca-F细胞悬液，于第六天无菌条件取腹水。1.2.2615小鼠皮下接种肿瘤细胞取615小鼠癌性腹水0.1ml，内含2×106个活瘤细胞，接种于615小鼠右腋中线皮下。局部严格消毒。注射针头进入皮下。定期检查右腋皮下肿瘤生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，于接种后21天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧有关淋巴结称重，同时观察肺、肝、肾等脏器。将上述组织固定于10%福尔马林固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜检查。(3)组织取材将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚约2~3mm的＜2×1cm大小的组织块，10%中性福尔马林固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24~48小时。经冲洗、透明、浸蜡，然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片，一般常规作HE染色。(4)切片染色:石蜡切片法,H.E.染色法1)脱水程序及时间:组织固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→修蜡块→切片→烘烤切片→染色2)HE切片染色程序与方法:①切片脱蜡水洗(与脱水过程相反)②HE染色③脱水,透明,封固【结果】:显微镜观察淋巴结转移的分布与转移率1．皮下瘤体：大体：皮下瘤体较大，呈灰白色，质硬，与皮下组织黏附紧密、界限不清。ＬＭ：瘤细胞分布不规律（组织结构异型性），细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，呈嗜碱性（细胞异型性）。2．同侧腋下淋巴结：大体：比正常淋巴结大，呈卵圆形，质硬，切面灰白色。ＬＭ：在淋巴结的边缘窦处可看到某些细胞分布不规律，细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，与在皮下瘤体的切片中看到的瘤细胞形态相似，明此淋巴结中的肿瘤组织是原发在皮下的肿瘤经淋巴道转移的结果。3．肺、肝、肾；大体：未见异常ＬＭ：未见到组织结构和细胞的异型性。表明此种肿瘤未经血道转移【讨论】:1为何选用Hca-F细胞，而不是Hca-p？Hca-F和Hca-p是从小鼠肝癌中分离出来的只经过淋巴道转移的同源而具有不同转移能力的两株克隆细胞系，F细胞的转移能力明显高于P细胞，达到70-%-80%，更加容易观察到结果。2在肿瘤转移过程中，瘤细胞通过侵入局部淋巴结（或者血管），随着淋巴结（或者血液），流动达到远隔部位与该处淋巴管（或血管）内皮或内皮下基质相互作用而停留在局部。其转移的可能机制有哪些?①淋巴道转移：恶性肿瘤侵入淋巴管后，随淋巴流首先到达局部淋巴结。局部淋巴结发生转以后，可继续转移至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。值得注意的是，有的肿瘤可以逆行转移（Troisiersign）或者越过相应的引流淋巴结发生跳跃式转移（skipmetastasis）。②血道转移：恶性肿瘤细胞侵入血管后可随血流到达远处器官继续生长，形成转移瘤。血道转移的途径与血栓栓塞的过程相似，即侵入体循环静脉的恶性肿瘤细胞经右心到肺，在肺内形成转移瘤。此外，侵入胸、腰、骨盆静脉的恶性肿瘤细胞也可以通过吻合枝进入脊椎静脉丛。③种植性转移：体腔内器官的恶性肿瘤蔓延至器官表面是，其肿瘤细胞可以脱落，并向播种一样种植在体腔内各个器官的表面，形成多数的转移瘤，这种方式亦称为播种。值得注意的是，手术也可能造成医源性种植性转移。【参考文献】1.刘敏，朱杰，杨佩满，等.L选择蛋白在小鼠肝癌细胞高低转移株HcaF、HcaP的表达及与肿瘤转移潜能的相关性\[J\].解剖科学进展，2003，9（2）：100104.2刘敏，王莉芬，朱杰，等.L选择蛋白可能介导小鼠肝癌HcaF细胞经淋巴道转移的研究\[J\].解剖学报，2004，35（5）：502506.3.李连宏主编《医学形态实验学》，人民卫生出版社，20094.凌茂英，刘希风，郑怀祖等小鼠肝癌细胞系H22-F25/L的建立及其生物学特性中华肿瘤杂志1991,13(1):135.张宏颖，唐建武，朱文婷，胡春秀，许国旺。小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系Hca—P／L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价。大连医学院学报2008，30（5）：465-468