家蚕微孢子虫Nosema bombycis功能基因组研究——家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定及其蛋白定位研究

家蚕微孢子虫Nosema bombycis功能基因组研究——家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定及其蛋白定位研究 家蚕微孢子虫Nosema bombycis功能基因组研究——家 蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定及其蛋白定位研究 \ \ 西南大学 二零一二届博士学位 家蚕微孢子虫 功能基因组研究 ??家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定 及其蛋白定位研究 微生物学 学科专业: 研究方向: 基因组学与代谢调控 周泽扬教授 指导教师: 研究生: 林立鹏 中国?重庆年月 ?? ‘ 一 ?? ,扫聊 』聊:: : ..: ,. ,‖ ‖.? .‘独创性声明 学位论文题目:塞蚕邀塑王里丛苎曼丝堡垒丝鲤堡垫功鱼星基因组婴究 二二塞蚕邀塑王虫缠锤丞』签担羞基因的鉴定区基蛋自定焦婴究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 ,. 签字日期: 年月砂日 学位论文作者:味客硼豸 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查弼借阅。本人授权西南大学研究生院筹可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:蛳保密,口 保密期限至 年 月止。 导师签名: 学位论文作者签名:寄磷分彰 签字日期: 勿々年‘月钐日 签字日期:?了年占月?日\ 目 录 摘要?????.??...??.??.??.....?.. 第一章文献综述 .微孢子虫概述?. .微孢子虫的分类与进化地位?. .纺锤剩体的研究. ..纺锤剩体的发现和形态? ..纺锤剩体的功能? ..纺锤剩体的起源与进化. 第二章引 言.. .研究背景 .研究目的和意义 .主要研究内容? .研究技术路线? 第三章家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定及转录特征??.. .与..基因组序列??. ..试剂和耗材??. ..主要试剂及配制. ..主要的仪器和设备??. ..方法与步骤??. .结果与?一 ..家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因??. ..家蚕微孢子虫纺锤剩体的铁硫簇组装. ..家蚕微孢子虫纺锤剩体蛋白质的转运. ..家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因共线性分析. ..家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的转录特征?,?.. .结论与讨论第四章家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的克隆分析??.. .材料与方法..生物实验材料?. ..基因序列分析软件??...主要试剂及配制?:??.. ..主要仪器设备?.. ..方法与步骤??.. .结果与分析..家蚕微孢子虫的纯化和基因组的提取? ..家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因克隆..家蚕微孢子虫线粒体型热激蛋白 的序列分析?. ..家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶的序列分析 ..家蚕微孢子虫转位酶的序列分析??. ..家蚕微孢子虫核苷转运蛋白的序列分析 .结论与讨论第五章家蚕微孢子虫纺锤剩体相关蛋白在酿酒酵母的定位分析 .材料与方法..载体和菌株??.. ..分析的工具软件一 ..主要试剂及配制.. ..主要仪器设备?.. ..方法与步骤.结果与分析..线粒体型导肽序列和亚细胞定位预测.. ..酿酒酵母表达载体构建.. ..酿酒酵母诱导表达??.. .结论与讨论第六章、、和在家蚕微孢子虫的免疫定位? .材料与方法..载体与菌株??.. ..主要试剂.. ..主要试剂配制?.. ..主要仪器设备?.. ..方法与步骤??.. .结果与分析..重组表达质粒构建??.. ..重组质粒原核表达??.. ..原核表达产物的纯化及其抗血清制备.. .. .. 、、和的亚细胞定位?. .结论与讨论第七章综合与结论?一 论文的创新点一 参考文献??一附录?一 博士期间发表文章及参研课题??.. 致谢?.. ,: :‰驴.:.: ?摘要 家蚕微孢子虫 功能基因组研究 ??家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定 及其蛋白定位研究 微生物学专业博士研究生林立鹏 指导教师周泽扬教授 摘要 微孢子虫是一类特殊的专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能 感染几乎所有的动物,包括一些重要的经济昆虫如蜜蜂和家蚕和鱼类。甚至, 某些微孢子虫可以感染免疫缺陷的病人而导致其腹泻、脑炎和肝炎。在早期研究 中微孢子虫被认为是无线粒体的真核生物属于原始的真核生物,但最新研究表明 微孢子虫与真菌的亲缘关系较近。由于适应胞内专性寄生,微孢子虫在基因组、 细胞结构和代谢水平都高度减缩。特别是微孢子虫的线粒体己经减缩成生化代谢 和形态结构简单的纺锤剩体,在人气管普孢虫 和蝗虫微孢子虫 、兔脑炎微孢子虫 等细胞内均已鉴定到纺锤剩体。纺锤剩体是由双层膜包裹,结构简单的 线粒体源细胞器,不具有许多典型的线粒体代谢途径。微孢子虫纺锤剩体不能通 过氧化磷酸化合成,而是利用核苷转运蛋白从细胞质中获得能量分子。尽管 纺锤剩体高度减缩,但兔脑炎微孢子虫和人气管普孢虫的纺锤剩体具有组装铁硫 簇的功能。微孢子虫纺锤剩体不具有独立的基因组,所有的纺锤剩体蛋白是细胞 核内的基因组编码。 关于家蚕微孢子虫 纺锤剩体的研究目前报道较少,也没 有纺锤剩体相关蛋白的定位研究。本研究基于家蚕微孢子虫基因组数据库,采用 和方法鉴定了家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因,采用方法 调查了这些基因的转录特征,并比较家蚕微孢子虫纺锤剩体蛋白与其它生物纺锤 剩体蛋白间的差异;随后,克隆了个纺锤剩体相关基因,并对其中的两个假定四甬大字博士学位论文 纺锤剩体膜蛋白和两个基质蛋白进行保守性和系统进化研究;采用酿酒酵母 表达 系统对纺锤剩体相关蛋白进行体外亚细胞定位分析;对个纺锤剩体相关蛋白进 行原核表达并制备抗血清,采用免疫电镜分析它们在家蚕微孢子虫孢子中的亚细 胞定位。主要研究如下: .家蚕微孢子虫基因组中纺锤剩体相关基因的鉴定及转录特征 下载酿酒酵母线粒体蛋白、阴道毛滴虫氢化酶体蛋白和原虫纺锤剩体蛋白, 与家蚕微孢子虫所有蛋白序列进行和检索,通过比对在家蚕微孢 子虫基因组中检索到个纺锤剩体相关基因,对应于个蛋白,其中 有四个基因拷贝,和各有两个基因拷贝。个蛋白参与铁硫 簇组装、、 、、、、、 、和;个转运蛋白,分别是、、、 和;参与交替呼吸途径;和 参与抗氧化呼吸途径;参与能量代谢; 和 参与 丙酮酸脱羧。与线粒体和氢化酶体蛋白质组相比较,家蚕微孢子虫纺锤剩体蛋白 质组比线粒体和氢化酶体更为减缩。反转录结果表明、 和在感染后检测到转录本,推测个蛋白在感染的早期裂殖子时 期扮演重要角色。、、加和在感染后 检测到转录本,其余基因在感染后才检测到转录本。 .家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的克隆分析 根据基因组预测序列的开放阅读框,设计个纺锤剩体相关基因的特异引物, 进行扩增、克隆、测序,结果显示所有的克隆序列与基因组预测的完全一致。 并对、、和四个重要纺锤剩体蛋白的序列保 守性和系统发育关系进行了深入分析:,通常被作为纺锤剩体鉴定 的标记蛋白,含有其行使功能所需的氨基酸位点:、、、、、 、、和;具有个保守的基序/和;与 酿酒酵母相比,的.端导肽已丢失,系统进化分析表明 与线粒体型聚为一类,共同起源于【一变形细菌,进一步支持 微孢子虫是真菌的姐妹分支的假说。含有典型的半胱氨酸脱硫酶活性 所需的氨基酸位点,不具有靶向线粒体的.端导肽,系统进化分析发现家蚕微 孢 是纺锤剩 予虫半胱氨酸脱硫酶起源于.变形细菌的家族; 体外膜上的主要转运蛋白,与酿酒酵母相比,蛋白序列高度减缩,但通过 三维结构预测仍可以形成个折叠组成的桶状结构,在.端含有一信号基序,但 基序中的极性氨酸酸被甘氨酸替代。系统进化分析表明与其他物种的 聚为一类,属于亚家族,不属于亚家族。核苷转运体 蛋白与质体和细菌的/转运蛋白具有序列相似性,生物信息分析 表明预测有个跨膜结构域,多重序列比对表明其含有,, 和四个功能位点,与序列有%的相似性。 .纺锤剩体相关蛋白在酿酒酵母的定位分析 采用线粒体导肽预测软件:、、、和 分析纺锤剩体相关蛋白的一端导肽,结果显示大部分预测位于基质中的家蚕 微 孢子虫纺锤剩体相关蛋白都丢失了.端导肽,仅、、 和具有较短的.端导肽,在预测的剪切位点.位存在保守的精氨酸位 点。 为了研究纺锤剩体蛋白的定位特征,我们采用酿酒酵母系统表达具有标 签的重组蛋白。将除外个基因的开放阅读框克隆到酵母表达载体 中,重组质粒转化酿酒酵母.。用.平板筛选阳性重组酵母, 采用?.培养基诱导表达融合蛋白,用线粒体探针 染色。荧 光显微镜观察结果显示,参与蛋白转运的、和能够 靶向导入酿酒酵母的线粒体,暗示了、和功能与线 粒体同源物类似,是纺锤剩体主要的转运蛋白。另外,两个重要的参与铁硫簇 组 装的蛋白和也能定位于酿酒酵母的线粒体,说明和 蛋白靶向依赖于其蛋白内部的靶向序列,而且表明家蚕微孢子虫纺锤 剩体保留有铁硫簇组装的功能。 .纺锤剩体相关蛋白在成熟微孢子虫孢子中的免疫定位 我们构建了个原核表达载体,分别为:.、.、 一、、一、和 后,用/ ...。重组质粒转化 诱导。检测到六个重组蛋白表达,且重组蛋白与预测大小相一致,分别是、 、、、和,其中个重 组蛋白以包涵体形式表达。采用亲和层析进行蛋白纯化,获得重组蛋白 、?、和。用个重组蛋白分别免疫 昆明小鼠制备多克隆抗体,免疫印迹结果表明、和在成熟 的孢子中都有表达,而且制备的抗血清特异性高。然而,用重组蛋白 制备的抗血清则在成熟的孢子总蛋白中既可以识别,也能够识别其它 腰雨入学博:学位论文 家族成员。间接免疫荧光分析表明定位于家蚕微孢子虫的细胞质 膜,可能参与从宿主细胞运输能量分子。免疫胶体金定位研究表明和 在成熟的孢子中定位于细胞质中,而的胶体金颗粒则呈现两种分布形 式,第一种形式为成簇存在,推测是家蚕微孢子虫纺锤剩体的位置,另一种形 式 为分散于细胞质中,可能是其它成员的分布。本研究鉴定了一批家蚕微孢 子虫纺锤剩体的相关基因,并对其功能进行了分类,对个蛋白的表达特征进 行 了深入分析,完成了个蛋白的免疫定位,为深入开展纺锤剩体的功能基因组 学 奠定了基础。 关键词:家蚕微孢子虫纺锤剩体定位铁硫簇的组装蛋白转运? 』 .: : . ,, , ., , . ..,,, ‘’, , ,.“”. , . .. ., .‘. ,. ,. , ?. ?, . ,. . , , 。 .. . . . . ,:. ? , ..,,,,, . ,,,,. , . . ,、、 . . . . . . :, : , . . ,,,,,, / . ,. . , 仪。..乙 .. , .,, ,. , ? ., . / , , . . :, , % ..?,,, . ?. ,,,, . 一 . ,,,.. . . ?? , . ,’ , , . , . ?, ?. . :?, , 一 一 , , 一 一,? .一一. ,. 。 ,, ?,,. . , 一 , ?, . 一 , ., . . ?.. , . ... , 人:, ., . ?.? . :,,,第一章文献综述 第一章文献综述 .微孢子虫概述 微孢子虫是一类专性寄生于细胞内的单细胞真核生物。其寄 主涉及广泛,能够寄生于几乎所有的动物,包括经济昆虫家蚕和蜜蜂、甲壳 类、 鱼类、啮齿类和灵长类等具有重要经济价值的动物,而且能够寄生于单细胞 的寄 生纤毛虫【】,甚至个属的个种能够感染免疫缺陷型病人。自年法国学 者首次发现家蚕微粒子病病体家蚕微孢子虫 至今的 多年里,已经陆续发现且被报道的微孢子虫已超过种,分别被归入约个 属【。 微孢子虫孢子形态多样,有圆形,卵圆形,棒状和月牙形,最多为卵圆形图 .。微孢子虫孢子大小差异较大,绝大多数约~ ,最大的 ~ 『,/.可达 。孢子的超微结构基本相似图.,主要由孢子 壁、孢原质、发芽装置和孢子细胞器等组成【。孢子壁通常分为层,孢子外壁为 致密的淀粉纤维状的蛋白质组成,孢子内壁为几丁质和蛋白组成和原生质膜。极 胞、极丝和后极泡组成发芽装置,为微孢子虫所特有的侵染装置。极丝由膜和糖 蛋白组成,直径为.到. ,长到 ,螺旋线圈形式盘绕,并通过锚 定盘固定在孢子的顶端。另外,孢原质中含有一个或紧密排列的两个细胞核、核 糖体和内质网,但不具有线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、鞭毛和的微管 结构等典型真核细胞特征【】。 酋 图.蝗虫微孢子虫的微分干涉显微观察图 图.微孢子虫的超微结构示意图 引自等,】 引自,】.. ..两南大学博十学位论文 .微孢子虫的分类与进化地位 年法国学者 首次在家蚕微粒子病病体鉴定家蚕微孢子虫,并把家蚕 微孢子被描述为类似酵母的真菌归为裂殖纲:年 首次提出“微孢子虫目”的名称,把微孢子虫目归为原生动物的 一个类群:孢子虫纲【;年把微孢二子虫目,粘孢子 ,和一起归为丝孢子虫亚纲 。微孢子虫、贾第虫、毛滴虫和内阿米巴原虫不具有典型真核细 胞特征:不具有线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、鞭毛和的微管结构等特 点,年?提出源真核生物假说,把微孢子虫、贾第虫、毛滴虫和 内阿米巴原虫归为“源真核生物”,认为它们是起源于内共生事件之前的原 始的 的 真核生物【。等对纳卡变形微孢子虫 的系统进化分析进一步支持微孢子虫早期分化的真核生斗勿?。另外,对 等同本学者对转录延伸因子?,.、异亮氨酸.合成酶的系统进化 分析结果也表明微孢子虫是古老的真核生物的一个早期分支。等在纳 卡变形微孢子虫中发现了微孢子虫存在线粒体的分子痕迹热激蛋;,与其他 真核生物的线粒体型热激蛋圭极为相似,认为微孢子虫并非一不始就没有 线粒体,而是后来丢失的。等以完整的蝗虫微孢子虫和纳卡变形微孢为基础, 重新 子虫勺聚合酶大亚基 基因中 分析微孢子虫的其他蛋白基因,发现微孢子虫的 含有的插入序列为动物和真菌所特有,而且肌动蛋白、和微管蛋白与真菌的 极 为相似,认为微孢子虫与真菌具有很近的亲缘关系。尽管微孢子虫的进化地 位还 存在争议,但越来越多的研究表明,微孢子虫与真菌的亲缘关系较近 。目前, 微孢子虫已被『式归类为真菌图.。 :。涮僦 ‰‰。 图.微孢子虫进化地位引巨,‘ ..第一章文献综述 家蚕微孢子虫是人类鉴定的第一种微孢子虫,寄生于经济昆虫家蚕,卵圆形, 具有高度折光性,.~. ~. 】图.,目前在分类学上分类为微 孢子虫门,双单倍期纲,离异双单倍期目 ,微孢子虫科微孢子虫总科 ,微孢子虫属,学名家蚕微孢子虫 ,由于它专性寄生于经济昆虫家蚕,并引起家蚕微粒子病,特别是它 引起的蚕病能够经卵垂直传播,给养蚕业带来巨大的经济损失,因此家蚕微 孢子 虫被列为蚕种生产的唯一检疫对象。 图.家蚕微孢子虫的超微结构 引自吴正理,】 .. 妙/ ;: ;: : ;:;: ;:;: . ;: .纺锤剩体的研究 线粒体是真核细胞能量代谢的细胞器,生化研究和线粒体基因组的系统发育 分析表明线粒体起源于【.变形细菌与宿主细胞的内共生作用【 。线粒体的进化与 真核细胞的起源有着内在的联系。根据真核生物进化理论,线粒体内共生事件是 发生在第一个真核细胞形成时或者在真核细胞早期分化之后大约亿年前。需氧 的线粒体是真核生物典型的特征,有氧呼吸过程中,氧气是作为电子的最终受体 伴随着产生、和。尽管许多真核生物包括单细胞真菌、眼虫、贝 类、叶状软体蜗牛和疥虫在特定的生活阶段不需要氧气,但它们的线粒体在无 氧和有氧条件下都能发挥功能以适应他们的生活方式【 。这些兼性厌氧生物的线 粒体在有氧或缺氧的情况下,以无机物的或有机物的电子作为供体,通过质子泵 产生,这种兼性能量代谢以及线粒体是单源起源 观 点均表明:兼性厌氧生物的线粒体是线粒体内共生经减缩进化而来的,减缩进化 很可能是伴随着产生新的细胞功能,产生新的细胞功能主要通过适应性重排已有 的蛋白功能域或者直接从宿主或外界获得一些基因表达产物【,】。西南大学博士学位论文 氢化酶体研 年等对厌氧纤毛虫卵形肠肾虫 究表明,真核生物减缩的进化将导致线粒体不再通过电子传递链和氧化磷酸化而 是利用底物水平磷酸化来产生,其氢化酶体中残余基因组的编码基因系统进 化发育分析也证明了卵形肠肾虫的氢化酶体是修饰的线粒体 但线粒体到底可以减缩到什么程度近年来,许多寄生原虫发 , ?? 现纺锤剩体,, 另一线粒体相关细胞器,为线粒体减缩进化提供了线索。纺锤剩体形态和功能上 与线粒体、氢化酶体不同,不能进行合成生物能量以及尿素循环和脂肪酸代谢等 线粒体行使的功能,仅保留铁硫簇合成的功能。 ..纺锤剩体的发现和形态 线粒体、细胞核、高尔基体、内质网是真核生物区别于原核生物的主要特征, 其中线粒体是能量合成、有氧呼吸以及许多代谢途径的场所。然而真核微生物存 在许多特别类群:它们虽为真核细胞,但却具有似乎介于原核细胞和真核细胞之 间的特点,如不具线粒体等典型细胞器,这些生物主要生存在厌氧或微量氧环境, 有双滴虫类、副基体类、内变形虫 和微孢子虫等,被称为“无线粒体”真核生物】。年著名进化 原生生物学家.把无线粒体真核生物单独列为真核生物中的一个亚 界,统称为“源真核生物”。“源真核生物”假说认为它们是在线粒体产 生之前即已分化的极原始真核生物,处在原核生物向真核生物过渡阶段。基于核 糖体小亚基 和翻译延伸因子 的系统进化分析都支 持“源真核生物”假说。 年对溶组织内阿米巴 进行系统进化分析,结果表明溶组织内阿米巴原虫不是原始真核生物 ,不属于“源真核生物”,而是属于有线粒体真核生物的类群,这就暗示 了内阿米巴的祖先曾经拥有线粒体,但后来由于某种原因线粒体丢失】。微孢 子虫齐聚合酶大亚基与真菌聚为一类,“源真核生物”假说受到了挑 战。 年和在溶组织内阿米巴核基因组中发现编码分子伴侣 ,和吡啶核苷酸转氢酶 , 基因【 ,真核生物中它们都定位在线粒体上。和蛋白都具有线粒 体型的一端导肽,对进行系统进化分析表明,与其他真核生物的线粒 体相应蛋白质聚为一类,具有共同的起源。之后,又在双滴虫类、副基体类、微 孢子虫类和内变形虫类的核基因组中都发现有来源于线粒体的基因??线粒体型 的,系统发育分析表明这些线粒体来源的基因并不是最近由其他生物水平基 第一章文献综述 因转移而来,而它们的祖先中就已经存在,线粒体来源基因的发现至少使人们有 理由相信这些“无线粒体”真核生物曾经拥有过线粒体,现在“无线粒体”现象是因 ,因此“源真核生物”假说进一步受到 为在进化中发生第二次丢失 冲击。 “无线粒体”真核生物中线粒体来源基因的发现促使科学家对它们的亚细胞定 位进行研究。 年和两个研究小组首次几乎同时发现溶组织内阿米 巴中存在纺锤剩体】,研究小组在溶组织内阿米巴中表达融合.标签 基因,采用间接免疫荧光方法证实定位于纺锤剩体,而且缺失线粒 体型导肽的会在溶组织内阿米巴的细胞质中积累,缺失线粒体型导肽的 其.端融合锥虫线粒体的导肽后又恢复原来的亚细胞定位定 位于纺锤剩体。等【采用透射电镜观察到溶组织内阿米巴的纺锤剩体由双 层膜包裹,暗示了纺锤剩体是继发现氢化酶体后的又一线粒体相关细胞器,溶组 织内阿米巴是“无线粒体”的原始真核生物??看来已难以成立。随后,应用线粒体 型蛋白的抗体,和等和间接免疫荧光方法,结合免疫电子显微 和兔脑炎微孢 镜技术在微孢子虫??人气管普孢虫 ,双滴类的肠贾第虫 和顶复 子虫 门的小球隐孢虫等寄生原生生物中鉴定了纺锤剩体图 】.。 ,图.线粒体、氢化酶体和纺锤剩体的透射电镜图引自 ,.. . :鸡小脑线粒体;,:和的氢化酶体; ,,:溶组 织内阿米巴、人气管普孢虫和肠贾第虫的纺锤剩体。 标尺: ~ : . 阳南大学博十学位论文 线粒体、氢化酶体和纺锤剩体形态有所区别,但都具有内共生起源细胞器 的共同特点??由层膜包裹。在电镜下观察到的溶组织内阿米巴、人气管普孢虫 和变形鞭毛虫的纺锤剩体双层膜内膜和外膜相邻紧密,没 有明显的膜问隙。纺锤剩体内膜不形成“嵴”,形态上类似厌氧条件下酵母线粒体和 疟原虫裂殖子的“无嵴”线粒体,以及厌氧寄生虫如阴道毛滴虫的氢化酶体,呈 椭圆形,一般小于.“,在不同物种其大小、数目和分布不一。人气管普孢虫和 肠贾第虫每个细胞分别含有平均矛个细胞器,透射电子显微镜照片显示其大 小分别是 × 是迄今为止发现的最小的线粒体相关细胞 器图.。透射电子显微镜下的溶组织内阿米巴纺锤剩体呈卵圆形,直径 .~.【 ,而共聚焦显微镜下观察到每个营养体存在多个纺锤剩体,大 部分纺锤剩体小于.“。一个小球隐孢虫仅发现一个椭圆的纺锤剩体,位于小球 。 隐孢虫后部的细胞核和晶样体 之间,其直径约为 纺锤剩体在细胞内的分布是不均匀的。例如,微孢子虫: 、 .、 .、 妇酐纺锤剩体堆积于纺锤体斑 ,二者一起位于凹陷的核膜,这可能是由于细胞分裂时纺锤体斑参与纺锤 剩体的分离【?。而人气管普孢虫的纺锤剩体随机分散在细胞质内。大多数 肠贾第 虫的纺锤剩体随机分布于其胞质中,通常是在其营养孢子后部 。然而有趣的是,几乎所有的肠贾第虫的两个细胞核之问都存 在纺锤剩体连接形成独特的棒状结构,位于鞭毛尾部轴丝之问,推测该棒状结构 与肠贾第虫纺锤剩体的分裂及形成有关【?。 影 ,、 图.人气管普孢虫的纺锤剩体引自等,/. .. .:纺锤剩体的功能 由于不同的生物体中从线粒体到纺锤剩体的过度受到选择压力是不同的,从 而形成相似但不同的细胞器,这些细胞器在减缩进化过程中丢失了能量代谢以及 典型线粒体的大部分功能。与线粒体和氢化酶体不同的是,纺锤剩体不能够合成 。纺锤剩体中未发现含有三羧酸循环,细胞色素依赖的呼吸链和氧化磷酸化, 并能通过丙酮酸脱氢酶复合体合成乙酰辅酶。氢化酶体含有氢化酶,而且能通过 :铁氧还蛋白氧化还原酶合成乙酰辅酶为底物水平磷酸化提供原料,这些 途径在纺锤剩体中也不存在。在纺锤剩体中也没有发现线粒体所具有的生物合成 途径,包括血红素、生物素和心磷脂的生物合成,以及尿素循环、脂肪酸一氧 化、 氨基酸和核苷酸代谢‘,。研究发现,纺锤剩体保留了线粒体铁硫簇 的生物合成。铁硫簇合成是线粒体,氢化酶体和纺锤剩体唯一共有的功能? 铁硫簇是普遍存在于生物体的最古老的辅基之一,最常见种形式是 .,它们在细胞的新陈代谢过程中起着非常重要的作用【,】。如铁硫蛋白 通过活性位点中的铁硫簇介导电子传递,氧化应激反应和调节铁 离子稳态;而在一些重要的酶,如循环中的顺乌头酸酶和延胡索酸酶.铁硫簇 是它们的活性中心。研究表明,细菌中至少存在个独立的系统来装配铁硫簇。 . 系统为许多“管家”铁硫蛋白成熟所需;固氮菌中 ?系统主要是用于固氮酶中铁硫簇组装的; 系统则是在氧化应激和缺铁条件下修复铁硫簇。有些细菌多个铁硫 簇装配系统如大肠杆菌含有系统矛系统,而有些细菌则仅含有其中的 一个系统。真核生物铁硫簇仅在线粒体进行中装配,其组装过程与细菌的系 统 类似,系统发育分析表明与线粒体的内共生起源一致,线粒体中的系统起源 于 内共生体??变形细菌。在质体和顶复门的恶性疟原虫的项体 中存在系统,推测其起源于质体的祖先??蓝细菌【】。仅内阿 米巴及与其近缘的寄生真核生物存在系统, 。 目前,真核生物中主要以酵母模式研究铁硫簇组装过程图.,。酵母 线粒体中发现有个蛋白参与铁硫簇生物合成,过程主要分为步:首先,半胱氨 酸脱硫酶复合体作为硫的供体,作为铁离子供体,电子 通过曲复合体中输入,在支架蛋白组装成铁硫簇;第二,铁硫簇在专一 的伴侣分子线粒体、辅助分子伴侣、线粒体型单巯基谷氧还蛋白 ?和核苷酸交换因子作用下,释放出铁硫簇并转移入脱辅基蛋白 ;然而,还有许多蛋白参与铁硫簇的组装,它们所扮演的角色目前 仍未确定。酿酒酵母和布氏锥虫参与铁硫簇装配途径相关基因的缺失突变株研究表明,线粒体中铁硫簇的组装对细胞质和细胞核的铁硫蛋白的形成具有重要的作 用。目前,在线粒体中已经发现种线粒体膜蛋白对线粒体外的铁硫蛋白形成必不 司少:,线粒体内膜转运蛋白;,位于线粒体膜间隙的巯基氧化酶;和 谷胱甘肽三肽,,是线粒体主要的自由巯基库。但是,铁硫簇 从线粒体往细胞质具体运输机制仍未知。除了线粒体中铁硫簇组装相关蛋白,酵 母细胞质中还有种蛋白参与线粒体外铁硫蛋白的成熟:、、和 图.线粒体中铁硫蛋白生物合成途径引自“和,【刮 .. 铁硫簇运出线粒体后,被和复合体接收,临时铁硫簇就在该复合体 上形成,最后在的辅助下把预组装好的铁硫簇传递给目的铁硫蛋白。单细 胞真核生物铁硫簇合成在线粒体中完成,而多细胞动物系统并非都在线粒体 中。研究发现,系统的许多关键组分包括、币,不仅定位于 线粒体,而且在细胞质和细胞核中也存在,从而参与线粒体外铁硫簇从头合成【?。 系统在真核生物进化的哪个阶段转移到线粒体外,并在线粒体外执行何种功能, 还有待于进一步研究。 年,报道了“无线粒体”真核生物肠贾第虫的基因,为肠贾第虫 存在系统提供证据,系统发育分析表明肠贾第虫的口其他真核生物线粒体 。然而, 型的源,与线粒体型不同的是,肠贾第虫拘缺一端导肽 肠贾第虫中并非所有系统的蛋白都不具有导肽,分别对肠贾第虫 驹矛分析发现,二者.端都具有导肽序列,等进一步采 用间接免疫荧光和免疫电子显微镜方法,发现和这两个铁硫簇装配的关键 蛋白共定位于肠贾第虫的纺锤剩体而且具有装配铁硫簇的功能,从而首次证明了第一苹文献综述 纺锤剩体所具有的首个功能【。最新研究显示,通过密度梯度离心方法分离肠贾 第虫的纺锤剩体,结合蛋白质组学技术,在富含纺锤剩体的组分 中鉴定了参与铁硫簇组装的蛋白: ,和 。总之,肠贾第虫的纺锤剩体含有铁硫簇组装的关键组分,而且分离 的肠贾第虫纺锤剩体能够使脱辅基蛋白获得铁硫簇【。尽管肠贾 第虫纺锤剩体中存在铁硫簇组装的一些关键蛋白,但是缺乏、矛 还原酶等介导线粒体铁硫簇装配的同系物。有趣的是迄今 为止,未发现肠贾第虫纺锤剩体具有系统提供还原当量 和合成的途径,这是因为对纺锤剩体相关代谢信息了解的不完整还是因为二者 由胞质转运而来,有待于进一步研究。除此之外,在肠贾第虫基因组中也不存在 线粒体膜转运蛋白矛的同系物,及谷胱甘肽合成途径,但含有线粒 体外铁硫蛋白成熟的胞质组分。所以,纺锤剩体铁硫簇组装是否为胞质铁硫蛋白 成熟所需仍不清楚,另外,哪些蛋白把纺锤剩体组装好的铁硫簇转运至细胞质还 有待于鉴定。 年等【】完成兔脑炎微孢子虫基因组测序,兔脑炎微孢子虫基因组 中有个基因参与铁硫簇装配:核心组分禾,伴侣分子线粒体型,铁 离子伴侣分子, 电子转运体『, ,内膜转运蛋兰。这些基因与酿酒酵母同系物具 有很高相似性,而且有个基因的系统进化分析显示和【.变形细菌线粒体的祖先 同源,推测兔脑炎微孢子虫含有纺锤剩体,并描绘了一张纺锤剩体的代谢通路图 .。年等对人气管普孢虫线粒体型进行定位和系统进化分析, 为内共生体发生第二次丢失提供了证据,也从实验上首次证明微孢子虫存在 纺锤 剩体口。等分析了兔脑炎微孢子虫和人气管普孢虫两种微孢子虫,其中在 兔脑炎微孢子虫中,参与铁硫簇装配的主要组分:,和与 共定位于微孢子虫的纺锤剩体,从实验上首次揭示了微孢子虫纺锤剩体 具有铁硫簇组装的功能图.【,。在兔脑炎微孢子虫基因组不存在线粒体转 运蛋白家族,但含有个核苷转运体/ ,年等 进一步研究揭示兔脑炎微孢子纺锤剩体执行功能铁硫簇组装等功能时所需 的能量 如线粒体型扮演分子伴侣所需,拘正是依赖于其中的一个核苷转运体 ??,该蛋白定位于纺锤剩体并把细胞质中的能量分子转运进入纺锤剩 体,另外三个核苷转运体则定位于细胞质膜获取宿主细胞的能量分子图.【】。 与微孢子虫类似,小球隐孢虫的基因组中存在编码和的基因,虽然没有直 接证据表明和定位于纺锤剩体,但是二者存在.端导肽,在酵母中表达可 以定位于酿酒酵母的线粒体,该研究暗示二者在纺锤剩体中行使功能。曲南 穴学尊十学位论文 等 在蝗虫微孢子虫 和人气管普孢虫发现纺锤剩体 中存在交替氧化酶 ,,陔蛋白与磷酸甘油穿梭偶联把糖 酵解产生‘氧化为图. ,这有可能是某些微孢子虫纺锤剩体具 有的一个新功能,而交替氧化酶在许多微孢子虫如兔脑炎微孢予虫中发生丢 失图.【 。与其他“无线粒体”真核生物不同的是,溶组织内阿米巴含有 与 一变形菌的同系物相近,不含有线粒体型导肽,推测这两个基因通过水平 基因转移而来,而且系统发育分析表明和来源于非固氮的 .变形细菌 . 一,而且是与肠弯曲菌 和幽螺旋菌 】。进一步分析内阿米巴属的其 近缘的物种 他物种 , 和.等基因组具有编码系统的组分, 该水平基因转移事件可能发生在内阿米巴属发生分化之前 。特别是溶组织 内阿 米巴的可以互补缺失系统的大肠杆菌,说明这两个组分能够 催化铁硫簇的装配【 。 ?等通过两次不连续梯度离心 分离到溶组织内阿米巴的纺锤剩体,结合质谱分析鉴定至个纺锤剩体蛋白但 发现和砌主要存在于胞质组分,溶组织内阿米巴纺锤剩体主要参与硫活化 途径,其中有个蛋白 、 :乖 参与 硫活化;以及/ 参与硫的摄取【’ 唧 \/ 尹 吲。‘ 。. 訾 ? 【 池? 。,斋?。、\\?帆 ‰一 啊?饽拙曲“州”“\\~一、【曼到 ? ““他“”小.””叩“ 渊。胃岫 丐州辜 黜四。?品, 。 图.兔脑炎微孢子虫纺锤剩体代谢示意幽引白等,‘ 。 .“胛 。 .. 塑竺堂 一一?旦坚 丁 阳 图.免脑炎微孢子虫核苷转运体的定位引自等,.. .图.微孢子虫交替呼吸途 径引自 图.基因在微孢子虫中的分布 等, 引自等,.. .. ..纺锤剩体的起源与进化 线粒体相关细胞器如何起源,以及它们是如何进化一直是』“受争议的科学问 题。氢化酶体和纺锤剩体存在于不同类群暗示了它们由于经历若干独立事件 演化 而来。线粒体和叶绿体基因组系统发育分析表明线粒体和叶绿体起源于独立 的内 共生体。然而至今未能在大多数线粒体相关细胞器中发现,使研究学者很难 从分子进化上证实它们的祖先。然而,等在发现厌氧纤毛虫卵形肠肾虫氢 化酶含有,无疑为线粒体相关细胞器确实是修饰的线粒体提供证据【 。最新 研究表明,在人芽囊原虫的线粒体相关细胞器中发现使研究 人员从分子遗传水平上探索纺锤剩体的进化历程【。 目前,科学界存在两种假说解释线粒体相关细胞器的起源图.。第一种 于原始的线粒体内 假说认为,线粒体相关细胞器直接垂直传递 共生体 。第二种假说认为,线粒体相关细胞器起源 涉及两个连续的内共生事件:先是形成原始的线粒体内共生体,后该原始的 线粒 体内共生体丢失,另一嵌合细胞器 通过内共生形成并演化 】。 为氢化酶体或纺锤剩体【 第一种假说被目前实验结果所支持,直接由线粒体内共生体起源解释了线粒 体相关细胞器由双层膜包裹,而且在功能上,线粒体,氢化酶体和纺锤剩体的蛋第 草文献综述 。该假说也解释了线粒体和线粒体相关细 臼质运输机制保守性也证实这一观点【 胞器不能存在同一个生物,以及说明了线粒体相关细胞器在许多真核生物中独立 进化而产生的。第:种假说,尽管能够解释氢化酶体中为什么存在氢化酶和内酮 酸:铁氧还蛋白氧化还原酶以及’:者的系统进化关系,但无法说明线粒体相关细 胞器在彳同真核生物的多源性。第二种假说需要两个前提: 在不同的地质时 期,原始线粒体内共生体在不同的真核生物发生丢失; 不同的厌氧真细蔺内 共生体随后形成,并演化成各种不同线粒体相关细胞器。 面 憾匿.争 萎 蒜怒包囱 掣? 。。删。。 ,别 霎驷犁 高 图.线粒体,氢化酶体和纺锤剩体的进化引自 年,.. . :纺锤剩体和氢化酶体直接垂直传递于原始的线粒体内共生体::纺锤剩体和氢化酶体由于连续共生事件 起源于嵌合细胞器。蓝色表示线粒体/一变形细菌:红色表示氢化酶体,黄绿色表示纺锤剩体:浅蓝色表示厌 氧真细菌;表示细胞核。言 第二章引 .研究背景 微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物。可以感染几乎所有的无 脊椎和脊椎动物,包括许多重要经济昆虫如蜜蜂和家蚕,还能感染人类,因此备 受关注。早期研究中,微孢子虫,肠贾第虫和溶组织阿米巴原虫不具有线粒体而 被认为是一种无线粒体’真核生物。但并非如此,越来越多研究表明微孢子虫与真 菌具有较近的亲缘关系。与其他典型的真菌相比,微孢子虫基因组、生物代谢和 细胞器等出现高度减缩,特别是微孢子虫的线粒体已经减缩成结构简单的纺 锤剩 体。年等首次在人气管普孢虫中发现微孢子虫纺锤剩体,随后又在 兔脑炎微孢子虫和蝗虫微孢子虫中也鉴定了纺锤剩体。经过十年对的研究,已经 对微孢子虫的纺锤剩体有了一定程度的认识。家蚕微孢子虫能够寄生于家蚕引起 家蚕微粒子病,造成养蚕业的毁灭性危害,是微孢子虫属的典型种。年本研 究小组已经开始对家蚕微孢子虫纺锤剩体的研究,已经报道、 、、和等个基因。但由于基因组数 据的还不完善使其他纺锤剩体相关基因如不完整,还未能对这些基因 序列和蛋白的定位进行深入的分析,也尚未发现家蚕微孢子虫纺锤剩体。 .研究目的和意义 纺锤剩体形态结构简单,由双层膜包裹,但双层膜不能形成“嵴”。而且自身不 含有,所有的纺锤剩体蛋白由细胞核内的基因组编码,在细胞核内转录,运输 至细胞质中翻译,然后转运入纺锤剩体行使功能。然而,纺锤剩体蛋白的一端导 肽大部分都已丢失,纺锤剩体的膜上存在的蛋白转运系统也高度减缩,仅发现 、、、、和,但这些蛋白的体内定位还未 完全证实。在生物代谢方面,纺锤剩体已经丢失与三羧酸循环,呼吸链和氧化磷 酸化代谢相关酶类,不能自身合成能量分子,纺锤剩体所需的能量,通过核 苷转运体或线粒体转运蛋白家族从细胞质中转运获得能量,值得注意的是核苷转 运体可能是从衣原体或立克次氏体通过水平基因转移获得。尽管微孢子虫纺锤剩 体高度减缩,通过免疫定位和功能实验,表明微孢子虫纺锤剩体能够组装铁硫簇。 最近研究发现某些微孢子虫含有交替氧化酶,微孢子虫纺锤剩体保留交替氧化途 径,能够氧化糖酵解产生的还原当量。然而,对纺锤剩体的研究还远远不够,随 着越来越多微孢子虫基因组测序的完成,探索微孢子虫纺锤剩体的相关基因功能, 从而阐明纺锤剩体参与的生物学功能,为微孢子虫的进化和起源提供细胞生物学 水平的理论依据。曲雨大学博士学位论文 本实验室完成的家蚕微孢子虫全基因组框架图,为研究家蚕微孢子虫纺锤剩 体基因提供了可靠的数据信息和分析平台。我们通过比较基因纰学分析,鉴定了 一些候选的纺锤剩体相关基因。本研究旨在鉴定家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因, 比较分析含有纺锤剩体的原虫的差异,从而阐述含纺锤剩体的原虫的进化历 程; 探索研究纺锤剩体相关蛋白的定位,鉴定家蚕微孢子虫纺锤剩体,阐明家蚕微孢 子虫纺锤剩体参与的生物学功能;筛选家蚕微孢子虫纺锤剩体的标记分子,为家 蚕微孢子虫纺锤剩体分离和纯化及其蛋白质组学的研究奠定基础。 .主要研究内容 本论文研究的主要内容如下: 家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定与转录特征分析 基于家蚕微孢子虫基因组数据,鉴定家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因,比较 家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因与其他含纺锤剩体的原虫的差异,比较不同微孢 子虫纺锤剩体相关基因的基因座位的关系,对鉴定的家蚕微孢子虫纺锤剩体相关 基因的转录特征分析。 家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的克隆分析 根据候选的家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的开放阅读框,设计引物对其中 个基因进行克隆,并对其中个蛋白:、、和 进行序列分析。 家蚕微孢子虫纺锤剩体相关蛋白的体外定位研究 构建个蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的酵母表达载体,转化酿酒酵母,诱 导表达后染色观察,采用酿酒酵母表达系统对纺锤剩体相关蛋白的定位进行 分析。 家蚕微孢子虫纺锤剩体相关蛋白在家蚕微孢子虫孢予中的定位研究 对、、、、和进行原核 表达,采用组氨酸亲和层析获得重组蛋白、、和 ..,并免疫小鼠制备多克隆抗体;采用间接免疫荧光和免疫胶 体金方法,对、、和在家蚕微孢子虫孢子中的 亚细胞定位进行分析。 古一 , 一.??.二...』圣二二釜兰』?曼曼苎 一 曼曼曼蔓曼曼苎曼曼苎曼???一。 .研究技术路线西南大学博:学位论文 曼曼曼曼曼第三章 家蚕微孢了二虫纺锤剩体相关基因的鉴定及转录特征 第三章家蚕微孢子虫纺锤剩体相关基因的鉴定及转录特征 本章以家蚕微孢子虫基因组数据和报道的纺锤剩体相关基因为基础,对家蚕 微孢子虫纺锤剩体相关基因进行鉴定,采用确定鉴定的纺锤剩体相关基因 的转录特征,我们又比较了不同进化地位的原虫纺锤剩体蛋的差异,主要比 较 的是参与铁硫簇组装的蛋白和转运蛋白的差异,初步了解家蚕微孢子虫纺锤 剩体 的代谢途径和生物学功能。 .材料与方法 ..基因组序列 家蚕微孢子虫 ,基因组数据库由本实验室提供,包括 的文库 . 的 序列.倍全基因组覆盖度、约 序列.倍覆盖度,约倍物理覆盖度以及倍覆盖度的测序数据, 预测基因组大小为. ,含有个编码基因。由西南大学家蚕基因组生物 学国家重点实验室与北京华大共同测序完成。 从://.//下载几种含有纺锤剩体真核生物 的基因组数据: 小球隐孢子虫 , ,、 ://.//、溶组织内阿米巴 , ://.//、肠贾第虫 , ://.//和阴道毛滴虫 ://.//以及微孢子虫包括兔脑炎微孢子虫 ,、蜜蜂微孢子虫 ,和比氏肠胞微孢子虫 ,】基因组数据://.//。 ,基因组数据从网站 另外,蝗虫微孢子虫 :../?// 下载。 线粒体相关蛋白序列:酿酒酵母 括,、拟南芥 、人类 的线粒体蛋白,阴道毛滴虫的氢化 酶体蛋序列来自软件包://.. .//.从网站上下载://.... /数据库中所有基因的非冗余氨基酸序列数据库以及 ://..../程序包。 ..试剂和耗材 购自公司;酶抑制剂、、和. 曲丽入字博卜学位论文 反转录酶购白公司;酵母抽提物、胰蛋白胨和琼脂糖等购 公司: 异丙醇、无水乙醇、丙三醇、三氯甲烷、氯化钠和氯化钾等购自重庆化学试 剂厂; 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自公司;、、和溴化乙 锭购自海生工。. ..主要试剂及配制 .. . . ,用调值至.,定容到 ,高压灭菌,室温放 置备用。 . ×一.吗啉代丙磺酸 . . . ,。 ,. ,用 调值至.,水定容到 ,室温放置,避光,备用。 .× × ,加水 ,用时现配。 .× × .,甘油高压过 ,溴酚兰 ,甲醛% ,去离子甲酰氨 ,. .“, “,在?可 / 保持个月。 .变性电泳胶称取. 琼脂糖,加入. ,加热至琼脂糖熔化后,冷却至。 左右,加入. 甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。 .变性电泳缓冲液 。 在 容量瓶内加入 甲醛,用×定容至 ..主要的仪器和设备 仪北京六一 电泳仪和电泳槽 凝胶成相系统 金坛富华 恒温振荡器 脉冲场凝胶电泳仪 真空转膜仪 杂交仪 上海跃进 电热恒温培养箱 ..方法与步骤 ...家蚕微孢子虫蛋白在基因组范围的检索与鉴定 在家蚕微孢子虫基因组数据库中,以“”作为关键词搜索基 因组注释表;酿酒酵母、拟南芥和人类的线粒体蛋白;阴道毛滴虫氢化酶体蛋 白; 肠贾第虫、溶组织内阿米巴原虫、兔脑炎微孢子虫、蜜蜂微孢子虫和蝗虫微 孢子 虫的纺锤剩体蛋白序列作为检索序列,在家蚕微孢子虫本地数据库中进行 比对,采用水。作为检索。检索得到的纺锤剩体候选基因进 行手工校正,然后反向再与的库进行检索,进一步完成序列的 验证工作; 站载个线粒体蛋白转位相关的基因家族:、、 、罗、 、,,, ,、 、、、、、、、、、、 、 、.、、、、、、 和的蛋白质序列,采用对每个家族进行多重序列比对,然后采 用软件 ...中的转化为种子,最后用搜索不 同物种数据库,提取.的蛋白为候选纺锤剩体转运蛋白,结合检索结 果进一步验证微孢子虫中纺锤剩体转运蛋白序列; 采用在线网站://./预测家蚕微孢子虫纺锤剩体相 关基因开放阅读框,并翻译成蛋白质预测理论分子质量和等电点/。 ...纺锤剩体蛋白基因在种微孢子虫间的共线性分析 基于系统构建的种微孢子虫包括家蚕微孢子虫,蜜蜂微孢子虫和兔脑 炎微孢子虫数据库,利用程序鉴定直系同源基因在不同微孢子虫的座位 信息,利用自编的脚本 对进行共线性作图,以确定和比较纺锤剩体 蛋白基因在不同微孢子虫间基因座位的保守性特征。 ...家蚕微孢子虫添食、收集和纯化 家蚕微孢子虫以 个/涂布于桑叶上,自然晾干后添食三龄起蚕。于五龄 收集病蚕丝腺或中肠,用匀浆器研磨,加.%的生理盐水,层纱布过滤,滤 液在下 /和 /差速离心,多次重复得到粗提液。粗提液精制 采用细胞分离液法进行密度梯度离心, /, 离心进行进一 步纯化。纯化得到的微孢子虫经生理盐水充分离心洗涤,去除细胞分离液等介质, 最后收集底层沉淀即为家蚕微孢子虫,用.%的生理盐水悬浮,?保存。