测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力标准方法的建立

测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力方法的建立 测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力标准方 法的建立 2010年第46卷第3期AnimNProduction?掏燕 测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和 活力标准方法的建立 侯启瑞,王金玉,谢凯舟,戴国俊,刘大林 (扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009) 摘要:研究测定鸡蛋蛋清中溶茵酶含量和活力的标准方法.在比浊法的基础上,用紫外一可见分光光度计测定 鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量和活力,并对该方法的精密度,准确度,灵敏度和可重复性进行验证.结果表明:本方法 的精密度(RSD<4%),准确度(R>95%),灵敏度(LOq5txg/mL,LOD0.3txg/mL), 可重复性(RSD<7%)均符合 方法评估实验要求,所测鸡蛋蛋清溶茵酶含量为2.93,4.07mg/mL,活力为13832.54,20842.74U/mg.研究证明, 本方法能科学地估计蛋清中的溶茵酶含量和活力,是一种操作性强,易于掌握,结果可靠稳定的测定方法,可以作 为测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的标准方法. 关键词:蛋清;溶菌酶;溶壁微球菌;酶活力 中图分类号:$831.5;TS201.2+5文献标识码:B文章编号:0258—7033(2010)03—0049—04 溶菌酶(1ysozyme)是一种能够水解细胞壁成分 中N一乙酰胞壁酸与N一乙酰葡萄糖胺之间的一1, 4糖苷键的酶,被广泛应用于医药,食品工业,生物 工程等方面,现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工 业化生产水平【".蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活 力越强,越有利于鸡蛋的保存,因此测定鸡蛋蛋清 中的溶菌酶对我国溶菌酶生产,禽蛋产品加工有 重要的指导作用,也为蛋品质评定提供了一个重 要参数.对溶菌酶的研究始于20世纪初,英国细菌 学家弗莱明[2]在1922年发现人的鼻涕,唾液,眼泪有 强大的溶菌活性,并把其溶菌作用的因子命名为溶 菌酶.此后研究者在人和动物的多种组织,分泌液及 某些植物,微生物中也发现了溶菌酶的存在,其中鸡 蛋蛋清的溶菌酶含量最高(约含0.3%)l3J.鸡蛋蛋清 已成为溶菌酶生产的主要原料,但是蛋清中溶菌酶 的定量测定还没有一个较便捷的方法,传统的方法 是先提取蛋清中的溶菌酶【4】,再测定提取液中的蛋 白含量I5J.由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶, 这种方法计算出的蛋清溶菌酶含量往往比实际的数 值小.溶菌酶活力的测定方法很多,目前,国内常用 的有琼脂板扩散法,比色法,高效液相色谱法等,而 收稿!El期:2009—03—05;修回日期:2009—08—28 基金项目:国家标准(20079762一T一326) 作者简介:侯启瑞(1983一),女,河南开封人,博士研究生 通讯作者 国外多用比浊法测定溶菌酶活力.本研究在比浊法 的基础上,针对鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量和活力设 计出一套系统的测定方法,为蛋清中的溶菌酶测定 提供一个标准方法,我国禽蛋中溶菌酶的测定. l材料与方法 1.1材料鸡蛋蛋清溶菌酶(20000U/mg)购自美 国Sigma公司;溶壁微球菌(M.Lysodeikticus)购自中 国科学院微生物研究所,菌种编号1.634;其他试剂 均为纯级. 1.2溶菌酶含量的测定 1.2.1标准曲线的制备溶菌酶用0.9%氯化钠稀 释成不同梯度浓度(0,0.2,0.4,0.8,1mg/mL),以溶 菌酶工作液浓度为横坐标,281Dm波长处吸光度为 纵坐标绘制标准曲线,并求出回归方程. 1.2.1蛋清溶液的测定蛋清用0.9%氯化钠稀释, 乙酸调溶液至pH4.5,77?水浴10min后取出,静 置1h.离心取上清,按照标准曲线绘制的操作测得 OD丝值,由标准曲线回归方程计算蛋清溶液中溶菌 酶的含量(C),再乘以稀释倍数即为蛋清中溶菌酶 的含量(P). 1.3溶菌酶活力的测定 1.3.1底物的制备溶壁微球菌用0.2mol/LpH 6.2磷酸盐缓冲液悬浮,调至OD4m在1.3左右, 2,8?放置. 中固荔教系葱《》 瀚?AnimalProduction 1.3.2蛋清溶液的测定将蛋清溶液,菌液于25? 水浴中保温,反应体系见表1.记下反应15s和75S 时的读数A,A.按每分钟0D45o值下降0.001为1 个活力单位(U)的定义l6l,蛋清中每毫克溶菌酶的活 力用以下公式计算: ~JJ(U/mg)丽 式中,?E伽为450nm波长处吸光度A,A:之差;C 为蛋清溶液中溶菌酶的含量(~zg/mL). 表1蛋清溶液测定反应体系mL 1.4精密度,准确度和灵敏度试验参照文献[7】. 1.5重复性试验蛋清重复样5个,按照1.2和 1.3的测定方法分别测定. 1.6伊萨鸡蛋和京海黄鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 伊萨鸡蛋30枚,京海黄鸡蛋30枚,按照1.2和 1.3的方法分别测定. 1.7统计分析用软件SPSS11.0统计各指标均值 和方差,并运用GLM程序的方差分析对伊萨鸡蛋和 京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶含量和活力进行比较. 2结果与分析 2.1溶菌酶标准曲线溶菌酶溶解后经紫外一可 见分光光度计,在281nm波长处出现峰值.配 制不同梯度浓度溶菌酶溶液,每毫升溶液中的溶菌 酶含量与281nm波长处吸光度呈线性关系,标准曲 线图形见图1,标准曲线回归方程为Y=2.4429X+ 0.0149.R2=O.9998. 溶茼酶浓度long?mL) 图1溶菌酶标准曲线 2.2精密度,准确度和灵敏度试验结果 2.2.1精密度精密度一般用相对标准差RSD(即 变异系数CV)表示,RSD越低,则表示方法精密度 @鸯绶臻志 2010霉藕46卷黎3期 越好.低,中,高3种浓度(3种浓度蛋清溶液是依据 稀释倍数不同,本研究低浓度蛋清稀释了70倍, 中浓度蛋清稀释了20倍,高浓度蛋清稀释了1O 倍)的蛋清溶液中溶菌酶含量的日内(上午,下午和 晚上)和日间(不同日的同一时间)测定结果见表2 和表3,其中日内RSD<3%(2.01%,2.08%,0.80%), 日间RSD<4%(3.18%,2.36%,1.46%),3种浓度蛋 清溶液的溶菌酶含量测定值日内RSD均小于日间 RSD 表2日内精密度(n=3)I.Lg?mL 2.2.2准确度通过已知量溶菌酶标准品在蛋清 溶液中的加样回收试验,用溶菌酶的回收率(R= (M—P)/A×100%其中,M为测得溶菌酶量;M—P为 回收溶菌酶量)表示方法的准确度,回收率越接近 100%,表示方法准确度越高.以蛋清溶液(由1.2测 得P为197.35p~g/mL)为溶剂配制200,400,600~g/mL 溶菌酶溶液,添加回收率计算结果见表4,3种浓度 溶菌酶的添加回收率都在95%以上. 表4溶菌酶添加回收率 2.2.3灵敏度灵敏度用最低定量浓度(定量限 LOQ)和最低检测浓度(检测限LOD)2项指标表示. 配制一系列低溶菌酶浓度溶液,对每种浓度取样4 2010每瓣嬉6卷第3 次进行测定,定量限测定结果见表5,当酶浓度降低 到4g/mL时,相对误差E>20%,囚此本方法测定 溶菌酶含量的定量限为5咖L.以蛋清溶液为溶 剂配制一系列低浓度的溶菌酶溶液,蛋清溶液为空 白调零,检测限测定结果见表6,当溶菌酶浓度低于 0.3咖L时,吸光度值不稳定,因此本方法测定溶 菌酶含量的检测限为0.3咖L. 表5最低定量浓度P.g?mL 注:表不测定吸光厦值稳定 2.3重复性检验结果测定方法是否稳定用重复 样的相对标准差来表示,RSD越小,测定结果越一 致,证明测定方法越稳定.蛋清重复样1,5的溶菌酶 含量和活力测定结果见表7.重复样的溶菌酶含量 RSD为3.03%,活力RSD为6.17%,即本方法所测蛋 清溶菌酶含量和活力的RSD都小于7%. 表7蛋清重复样的溶菌酶含量和活力测定结果 2.4伊萨鸡蛋和京海黄鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 结果2个品种鸡蛋蛋清溶菌酶含量和活力的测定 结果见表8.本试验所测伊萨鸡蛋和京海黄鸡蛋蛋清 溶菌酶平均含量分别为3.47,3.71mg/mL,蛋清溶菌酶 平均活力分别为16183.74,15689.35U/mg.伊萨鸡蛋 较重(P<0.O1),蛋清溶菌酶含量显着低于京海黄鸡 Anima{Production? 蛋蛋清溶菌酶含量(P<0.05);伊萨鸡蛋蛋清溶菌酶 活力略高于京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶活力,(P>0.05). 表8伊萨鸡蛋和京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶含量和活力测定结果 注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显着(P<O.05),不同大写 字母表示极显着(P<O.叭) 3讨论 3.1溶菌酶含量的测定测定鸡蛋蛋清中的溶菌 酶含量的传统途径是先提取再测定,从蛋清中分离 纯化溶菌酶已有不少报道,虽然正交试验的酶回 收率可达94%,但是再精确的提取途径也无法完全 提取出蛋清中的溶菌酶[1o].本方法测定蛋清中的溶 菌酶含量精密度(RSD<4%),准确度(R>95%),灵敏 度(LOQ5g/mL,LOD0.3g/mL),可重复性(RSD< 7%)均符合方法评估实验要求,所测2个品种鸡蛋 蛋清溶菌酶含量(2.93,4.07mg/mL)与相关研究结果 基本一致_11],且本方法测定过程不涉及提取,测定周 期短,对酶的活力影响小. 3.2溶菌酶活力的测定酶的活力表示为特定条 件下单位时间内转化底物的速度,试验过程中,每5S 1次测定管的吸光度值,在15s至75S之间测 定管吸光度值以稳定速度下降,因此单位时间选择为 15S至75S,该时间段的选择在文献l12]中亦有描述. 2个品种鸡蛋蛋清溶菌酶活力测定结果(13 832.54,20842.74U/rag)与以往研究一致【l0_1.溶菌 酶活力的测定方法很多,其中比浊法是一直沿用至 今的经典方法J,本方法借鉴了前人在比浊法上的 研究成果,改进酶活力的测定条件,缩短了测定时间 (1min),运用本方法大批量,不定时测定蛋清中的 溶菌酶活力时,为了节省每次测定培养溶壁微球菌 的时间,可以把培养好的溶壁微球菌用20%的甘油 作为保护剂,放人冰箱一20?下保存,每次测定时称 取少许菌和甘油的混合物制成底物即可使用. 4结论 本方法用紫外一可见分光光度计,在不需要提 中固亳东忿@ ? AnimNProd~mtion 取溶菌酶的情况下直接测定蛋清中的溶菌酶含量. 测定周期短,对酶活力影响小,方法稳定可靠;改进 了经典比浊法酶活力的测定条件,缩短了测定时间, 尤其在大批量,不定时测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶活 力时,减少测定成本.本研究为家禽蛋清中溶菌酶 的测定提供了一套操作性强,易于掌握,结果可靠稳 定的方法,本测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的 方法已通过国家农业部和全国畜牧业标准化技术委 员会审定,作为国家推荐性标准编入国家标准目录. 参考文献: [1]Joll~sP,Joll~sJ.What'snewinlysozymeresearch?一Alwaysa modelsystem,todaya.syesterday[J].MolCellBiochem,1984,63: 165-189. [2]叶丹,连宾.溶菌酶及其应用『J1.贵州科学,2003,21(3):67—70. [3]张勇,温其标,胡飞.溶菌酶及其食品工业中的应用1.1J_粮油加 工与食品机械,2004,(3):64—65. [4]张文会,王艳辉,马润雨.离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶lJJ. 食品工业科技,2003,24(6):57—59. 『51BradfordMA.Arapidandsensitivemethodforquantitationof 20{0甄碡爵卷繁3 microgramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein dyebinding[J].AnalBoichem,1976,(72):248-254. [6】BezemerJM,RadersmaR,GrijpmaDW,eto1.Zero—orderre— leaseoflysozymefrompoly(ethyleneglyco1)/poly(butylenes terephthalate)matrices[J].JControlRelease,2000,64:I79-192. [7]曾经泽.生物药物分析(第二版)[M].北京:北京医科大学,中 国协和医科大学联合出版社出版,1998:228—231. 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EffectsofChineseHerbAdditivesonGrowthPerformanceandIntestinalMicrofloraofWeanedPiglets WUChao,ZhangLi,WUYue—nfing,LIUJian-xin,LICai—yan,HuaWei-dong2 (1.Keylaboratoryformolecularanimalnutritionofministryofeducation,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029; 2.InstituteofAnimalSciencesandVeterinaryMedicine,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021) Abstract:TostudytheeffectsofChineseherbsasfeedadditivesongrowthperformanceandintestinalbacterialdiversity onpiglets.135weanedpigletsfDuroc×Landrace× Yorkshire)wereusedina28-daygrowthtria1.Thepigletswere allocatedtofivedietarytreatmentsinarandomizedcompleteblockdesign.Thedietarytreatmentswerecontrolgroup (basaldiets);treatmentsofI,1I,m,adding0.5%,1.0%and2.0%ofherbextractintothebasaldiets;antibioticgroup, adding20mg/kgColistinSulfateand100mg/kgBacitracinZincintothebasaldiet.Theresultsshowedthat:comparing tothecontrolgroup,supplemenfationwithherbadditivesdecreasedthediarrheaby47.6%,51.2%and45.2%(P< 0.05),andnosignificantdifferenceintheantibioticgroup(P>0.05).PCR-DGGEDNAprofilesoftheV6一V8region geneof16SrDNAofmicrobiotainrectumindicatethedegreeofsimilaritiesofChineseherbgr oupswereexceeding60%, thehighlevelsofdiversitywerefoundin0.5%herbgroup;Thesebandsindicatingwitha— cobservedinherbgroups showedexceeding90%similaritywithknownsequencesofGenbank. Keywords:Chineseherbadditives;growthperformance;diarrhea;intestinalmicroflora;weanedpiglet @中固毒奄恙