脊柱融合动物模型的研究进展

脊柱融合动物模型的研究进展 脊柱融合动物模型的研究进展 158中国脊柱脊髓杂志2006年第16卷第2期 ChineeJournalofSpineandSpinalCord,2006,Vo1.16,No.2 脊柱融合动物模型的研究进展 董智勇,邝冠明,郑召民 (中山大学附属第一医院骨科510080广州市) 中图分类号:R681.5文献标识码:A文章编号:1004-406X(2006)加2—0158—03 随着对脊柱融合机理及其并发症的进一步认识以及研 究逐渐深入.动物模型在脊柱外科领域的应用越来越广泛. 尤其是近年,骨组织工程和基因治疗受到了极大的关注,脊 柱融合实验动物模型在评价这些新兴技术方面的作用日益 显着.为相关的基础与临床前期研究做出了巨大贡献.现就 有关内容做一综述. 1实验动物模型的优势 融合手术已成为脊柱外科领域的一种常规治疗手段,但 是其存在的大量问题尚未解决,如自体骨来源有限,取骨区 并发症,假关节形成等.为了解决这些问题,人们进行了大量 的研究.这些研究按研究对象不同可以分为临床研究和动物 实验研究.临床研究存在很大的局限性.通常在实验中存在 很多非控制性因素.干扰实验因素对研究结果的作用.产生 偏倚【1I.动物模型可以很好地克服上述缺点,有效地控制非实 验因素.保留实验因素,进行随机可控的对照研究.实验动物 一 般采用相同的动物种类.取自同一饲养环境,并对年龄,性 别,体重等影响研究结果的因素进行控制,个体间的差异较 小.研究者可以有效地控制外科技术.保持局部环境的一致 性,能够准确评价疗效的改变. 另外.动物实验还可以通过组织学方法对实验中取得的 生物学结果进行定性和定量评价.并且可以通过破坏性的生 物力学实验评估其机械完整性,而上述评价方法均无法在人 体实施.目前基因治疗还处在起始阶段,人们对其安全性尚 无法进行有效的评估,因而不适合直接应用于人体.需要进 行动物实验评价并改进其生物安全性. 2实验动物模型的分类 实验动物广泛应用于脊柱融合的各个领域.研究者用其 评价新型的骨移植材料:选择不同的骨移植部位.评价内固 定器械和外科技术的改进对临床疗效的影响;比较不同的生 长因子和基因治疗的优缺点以及临床应用前景.因此,选择 合适的动物模型是实验设计中最重要和确保实验成功的主 要因素之一. 根据研究的目的不同,实验动物模型主要分为两类:生 物力学模型和生物学模型.生物力学模型是研究脊柱的生物 力学情况或脊柱器械的应用情况.宜选择较大的实验动物, 因为大动物脊柱的骨性解剖结构与人类相近.获得的数据更 第一作者简介:男(1975一),在读硕士,研究方向:脊柱外科,骨组 织工程 电话:(020)87332200E-mail:zhiyongzsy@163.conl 加可靠,实用.生物学模型主要用来研究脊柱融合的生物愈 合过程和愈合机制.利用较多数量的较小动物模型可以获得 大量的数据,比用较少数量的大动物所获得的少量实验数据 更有价值. 3常用的实验动物模型 研究者采用了多种不同的实验动物模型来进行脊柱融 合的研究.不同融合部位所采用的实验动物模型也各不相 同.下面分述目前常用的实验动物模型及其在脊柱融合发展 中的作用. 3.1前路融合动物模型 3.1.1颈,胸椎前路融合动物模型山羊是颈椎前路椎间融 合研究中最理想的实验动物.山羊具有头部直立,颈椎垂直 负重等特点,脊柱融合的生物力学环境与人体相似,而且山 羊的椎间盘和椎体的大小也与人类似,能够有效地比较植入 物在人体的情况.人们利用山羊进行了多方面的研究,如检 测各种生长因子对融合的作用,比较不同的骨移植材料以及 不同的椎间融合器械在促进脊柱融合方面的作用.Zdeblick 等I31比较了rhBMP一2与自体骨在山羊颈椎前路减压融合中的 作用效果.结果显示rhBMP一2组的融合率要明显优于自体骨 组及羟基磷灰石组.为生长因子在颈椎前路融合的应用提供 了实验基础.Kandziora等I呵应用这一模型评价联合应用IGF— l,IGF—Bl促进融合的生物学效应.Takahashi等151及Sachs等的 研究小组也分别采用该动物模型进行了rhBMP一2及rhBMP一 7促进颈椎前路融合的实验研究.得出了积极的结论.上述研 究促进了颈椎前路融合的发展.并且有效地验证了山羊动物 模型在颈椎前路融合研究中的作用,对后继研究者具有指导 意义. 胸椎前路融合中常用的实验动物为绵羊.CunninghaIll等 将l2只绵羊分别在T5/6,1-7/8,"1"9/10应用胸腔镜技术进行融 合.移植材料分别采用BAK,自体骨,BAK加自体骨,以及 BAK加rhOP—l.术后4个月观察结果,BAK加rhOP—l组的 融合率最高.作者认为在椎间融合中rhOp-l可以取代白体骨 移植.有效避免了供骨区并发症. 3.1.2腰椎前路融合动物模型人们利用多种动物进行了 腰椎前路融合的实验研究.Musehik等171将24只兔随机分为3 组,椎间分别注入不同剂量的牛BMP.研究BMP一2在前路椎 间融合中的作用.取得了极好的实验结果.作者认为该动物 模型可以有效地应用于相关的实验研究.但兔的椎间隙较 小,椎间植入困难,限制了其进一步应甩.Sandhu等l珂认为绵 羊是一种能够有效控制的动物模型,他们利用绵羊进行的研 中国脊柱脊髓杂志2006年第l6卷第2期 ChineseJournalofspineandspinolc0rd,2006,Vo1.16,No.2159 究证实了重组人BMP一2因子在脊柱融合中的作用,为绵羊在 腰椎前路融合研究中的应用奠定了实验基础.Boden等[91应用 灵长类动物进行了相似的实验,探讨rhBMP一2在椎间融合中 的有效剂量.椎间融合器中填充胶原,胶原分别在不同剂量 的rhBMP一2液中浸泡.各实验组均获得了融合,而空白组未 获得坚固融合.组织学检查证实在填充BMP一2的cage周围, 有正常的成熟骨小梁环绕生长.他认为包含rhBMP-2因子的 钛cage可以作为骨移植替代物. 3.2后路融合动物模型 腰椎后外侧融合模型是后路融合中研究最多的一种.其 应用的实验动物也最多.从裸鼠直至灵长类动物均可见到大 量报告,但在此类研究中,羊的应用非常少见,仅见到个别报 告.目前人们主要是采用背部正中或双侧切口,沿最长肌与 多裂肌间进入,暴露横突,去除皮质后完成植骨床准备,植入 骨移植材料,观察其促进融合的作用.随着微创技术的发展, 很多微创技术也开始应用于此模型.Boden等I'q首先尝试在 兔和猴的动物模型中应用电视内窥镜技术进行植骨,实验动 物术中创伤小,恢复快.取得了良好的实验效果.研究者认为 微创融合技术与骨诱导性移植材料联合应用.可以最大限度 地减少或避免传统手术的三大主要缺陷:肌肉去血供和去神 经支配,供区并发症以及假关节形成. 3.2.1小鼠模型小鼠模型过去常用来评价药物对脊柱融合 的整体作用.近年来随着组织工程和基因治疗的发展.此模 型更多用在概念验证策略方面,评价新兴的治疗方法.由于 裸鼠无免疫原性,在组织工程骨的研究中更为常用.Borden 等…】应用这一模型介绍了局部基因治疗的概念.并验证了一 种新的骨诱导蛋白基因LMP—l在脊柱融合中的作用和可行 性.研究者采用LMP-l基因转染骨髓细胞.复合无骨诱导性 的脱钙骨基质(DBM),行腰椎单节段后外侧融合,4周后实验 组融合率为100%,对照组为O.该实验充分验证了基因治疗在 脊柱融合中的作用和有效性.成骨性外源基因转入细胞后可 以在局部高效表达,促进融合,为今后基因治疗应用于免疫 原性动物及其在临床前期中的应用指明了研究方向.Peterson 等【l21应用这一模型验证了3种不同类型的DBM在脊柱融合 中的作用,为人们选择更佳的骨诱导性移植材料提供了实验 基础. 3.2.2兔兔是腰椎解剖与人类相似的最小动物之一.其骨 性解剖部位可以提供足够的空间进行移植物植入.同时能够 提供足够的髂骨进行自体骨移植对照;而且兔的融合率与人 相似,可以有效地比较不同诱导材料的成骨活性.因兔是腰 椎后外侧融合实验研究中最常用的动物模型.这一模型目前 广泛应用于评价不同形式的DBM,各种重组生长因子以及组 织工程高分子聚合材料在脊柱融合中的作用.Riew等?用腺 病毒载体携带BMP一2基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞. 复合明胶海绵,植入兔L5/6横突间.术后7周.实验组横突间 可见明显的成熟骨小梁,而对照组无新生骨形成.Cheng等1141 利用该模型首次证实了rhBMP一4因子在促进脊柱融合中的 作用,其研究表明脊柱融合的几率和rhBMP一4的剂量呈正相 关,为BMP--4因子在脊柱融合中的广泛应用奠定了实验基 础. 3.2.3犬人们应用犬来研究生长因子在促进腰椎后外侧融 合中的有效作用剂量及其生物安全性.也有人应用犬观察生 长因子在融合中的剂量应答关系.Sandhu等【l51进行了两个实 验,分别应用不同剂量的rhBMP一2因子复合聚乳酸(OPLA) 支架.植入L4/5双侧横突间,观察其促进脊柱融合的作用.在 应用58g以上剂量BMP的各组中,动物均在术后3个月出 现成功的横突间融合.而在自体骨移植组和单纯移植OPLA 组中却不能融合.5间融合物的横截面积和机械稳定性并 非呈剂量依赖关系.组织学的变化也和rhBMP一2的剂量无 关.这一研究首次揭示了BMP-2剂量与作用强度的关系,为 后继的研究者提供了研究思路及方向.Meyer等【l唰应用犬对 BMP-2因子的安全性进行了有益的探讨.20只成熟猎犬均行 L5双侧椎板切除术,并刺破硬膜,使脑脊液外漏;实验动物随 机分为两组,分别植入自体骨及复合rhBMP一2的骨移植材 料;研究者发现BMP一2组可以促进椎板切除处骨愈合.并且 在鞘膜囊及脊髓处无异常矿化.研究者认为rhBMP-2可以促 进骨生长,对动物无毒副作用. 3.2.4猴灵长类动物在进化上最接近人.具有与人相似的 很多特点,其基因和人类有98%的同源性;脊柱的解剖结构, 形态,毗邻关系以及承受的负荷也与人类似.由于物种进化 的复杂性和多样性,在低等动物身上证实有效的骨移植物并 非都能成功应用于较高级的动物.因而,在某一新的骨移植 材料及器械应用于人体之前,应使用灵长类动物来检验其功 效. Boden等于1995年提出了的猴横突间融合模型.以 后的研究均以此为基础开展.随着微创技术的发展,Boden等【lq 于1996年将微创的概念和技术引入此动物模型.取得了极好 的实验效果.Martin等旧分别采用不同剂量的rhBMP一2与不 同载体复合,植入恒河猴L4/5横突间融合模型中.发现在灵 长类动物脊柱中,如果填充的时间足够长,对组织压缩采取 相应的机械保护,即使较低剂量的rhBMP一2亦可以有效地促 进骨诱导. Boden等【'81在灵长类动物实验的基础上.探讨了生长因子 应用于人体的可能性及安全性.他采用Ne—Osteo骨生长因 子,应用于恒河猴双侧横突间融合模型.按剂量不同分组.在 25mg组实验动物均获得坚固融合.在此基础上.对22名患者 分别进行了3期临床实验.实验设计为患者自身对照.一侧 采用自体骨,另一侧使用Ne—Osteo骨生长因子;l2个月后. 除一名吸烟患者外,双侧均取得融合.他认为每侧采用25mg 以上的Ne—Osteo所取得的融合率和自体骨移植相同.这项研 究为自体骨移植找到了一种良好的替代材料.极大地促进了 骨组织工程的发展及临床应用.但是目前在灵长类模型中所 进行的研究还刚刚起步,尚未见到基因水平上成功融合的报 告.基于基因治疗的组织工程骨完全取代自体骨尚有一段很 长的路,需要研究者不断地进行探索. 总之,为了有效地促进脊柱融合,提高临床疗效,人们进 行了很多尝试,组织工程和基因治疗的兴起为人们提供了一 种全新的思路.为了使组织工程骨早日进入临床.人们采用 160中国脊柱脊髓杂志2006年第l6卷第2期 ChineseJournalofSpineandSpinalco,2006,Vo1.16,No.2 了多种不同的动物融合模型来检验其效果.由于动物实验可 以有效地控制非实验因素,取得准确的实验结果,并可以验 证不同的骨移植材料以及不同生长因子的有效性与可靠性, 为人们寻找一种最佳的移植材料提供了可能.目前在这一领 域已经取得了可喜的进展.如在大量动物实验的基础上, rhBMP一2应用于人体的临床实验已经见到报告.其极好的实 验结果预示着临床大规模应用的时代即将来临. 一 种新的骨移植材料成功应用于人体之前必须进行四 个方面的实验:概念验证研究,可行性研究,安全性及毒性研 究以及功效研究.在上述每个研究阶段,人们都离不开实验 动物『I91.但是目前实验动物模型还存在着很多不足之处,不同 的研究者采用的动物模型以及动物实验方法不甚相同.所取 得的实验结果缺乏有效对比.如何建立一套标准的动物实验 模型以及标准的动物实验流程.逐次验证上述四个阶段.仍 是一个尚待解决的问题.另外.动物选择涉及的问题亦较多. 除实验性质要求外.动物饲养条件,死亡率,经济与否等.尚 无统一的评价标准.需要综合考虑. 基因治疗在脊柱融合中的作用日益受到重视.但其研究 目前仍停留在较低的水平上.缺乏高等动物的相关研究.能 够上调生长类因子表达的逆转录因子也已经进入了研究者 的视线.在裸鼠腰椎融合模型中.此因子可以高效影响其它 生长因子及细胞成骨.但其安全性尚待进一步验证.此外.人 们对于生长因子尚存很多争议.如在其安全性,有效剂量,费 效比等相关问题上仍存在分歧.限制了其进一步应用『删.上述 问题的提出和解决都将极大地扩大脊柱融合的研究范围.并 且需要在大量动物实验的基础上取得成果.这也必将对动物 融合模型的改进和发展产生积极的影响 4参考文献 1.SandhuHS,BodenSD.Biologicenhancementofspinalfusion 【J】.OrthopClinNorthAm,1998,29:621—631. 2.KhanSN,LaneJM.Spinalfusionsurgery:animalmodelsfortis— sue-engineeredboneconstructs【J】.Biomaterials,2004,25(9): 1475-1485. 3.ZdeblickTA,GhanayemAJ,RapoffAJ,eta1.Cervicalinterbody fusioncages:a/ianimalmodelwithandwithoutbonemorpho. geneticprotein[J1.Spine,1998,23(7):758—765. 4.KandizoraF,SchmidmaierG,SchollmeierG,eta1.IGF—Iand TGF—betaIapplicationbyapoly一(d,1-lactide)一coatedcage promotesintervertebralbonematrixformationinthesheep cervicalspine[J].Spine,2002,27(16):1710-1723. 5.TakahashiT,TominagaT,WatanabeN.eta1.Useofporoushy— droxyapatitegraftcontainingrecombinanthumanbonemor- phogeneticprotein一2forcervicalfusioninacaprinemodel[J]. JNeurosurg,1999,90(Suppl2):224—230. 6.CunninghamBW,KanayamaM,ParkerLM,eta1.Osteogenic proteinversusautologousinterbodyarthrodesisinthesheep thoracicspine:acomparativeendoscopicstudyusingtheBag- byandKuslichinterbodyfusiondevice[J].Spine,1999,24(6): 509-5l8. 7.MuschikM,SchlenzkaD,RitsliaV,eta1.Experimentalanterior spinefusionusingbovinebonemorphogeneticprotein:astudy inrabbits[J].JOrthopSci,2000,5(2):165—170. 8.SandhuHS.T0thJM,DiwanAD,eta1.Histologicevaluationof theef.cacyofrhBMP-2comparedwithautograftbonein sheepspinalanteriorinterbodyfusion【J】.Spine,2002,27(6): 567-575. 9.BodenSD,MartinJrGJ,HortonWC,eta1.Laparuscopicanteri— orspinalarthrodesiswithrhBMP一2inatitaniuminterbody threadedcage[J1.JSpinalDisord,1998,ll(2):95—101. 1O.BodenSD.MoskovitzPA.MoroneMA.eta1.Video—Assisted lateralintertransverseprocessarthrodesis:validationofanew minimallyinvasivelumbarspinalfusiontechniqueinthe rabbitandnonhumanprimate(rhesus)models[J].Spine,1996, 2l(22):2689—2697. 11.BodenSD.TitusL,HairG,eta1.Lumbarspinefusionby localgenetherapywithaeDNAencodinganovelosteoind— J】.Spine,1998,23(23):2486-2492. uctiveprotein(LMP-1)【 12.PetersonB,WhangPG,IglesiasR,eta1.Osteoinductivityof commerciallyavailabledemineralizedbonematrix.Preparations inaspinefusionmodel【J】.JBoneJointSurg(Am),2004,86 (10):2243—2250. 13.RiewKD,WrightNM,ChengS.eta1.Inductionofbonefor- mationusingarecombinantadenovialvectorcarryingthe humanBMP-2geneinrabbitspinalfusionmodel【J】.Calcif TissueInt.1998,63(4):357—360. 14.ChengJCY,GuoX,LawLP,eta1.Howdoserecombinant bonemorphogeneticprotein-4enhanceposteriorspinalfusion [J]?Spine,2002.27(5):467-474. 15.SandhuHS,KanimLE,KaboJM,eta1.Effectivedosesofre- combinanthumanbonemorphogeneticprotein-2inexpori. mentalspinalfusion[J].Spine,1996,2l(18):2l15-2122. 16.MeyerRAJr,GruberHE,HowardBA,eta1.Safetyofre— combinanthumanbonemorphogeneticprotein一2afterspinal Iamineetomyinthedog[J].Spine,1999,24(8):747-754. 17.MartinGJJr,BodenSD,MaloneMA.eta1.Posterolateralin— tertransverseprocessspinalarthrodesiswithrhBMP一2ina nonhumanprimate:importantlessonslearnedregardingdose, carrier,andsafety[J].JSpinalDisord.1999,12(3):179—186. 18.BodenSD.GrubD.DamienC.Ne—Osteobonegrowthfactor forposterolaterallumbarspinefusion:resultsfromanonhu— manprimatestudyandaprospectivehumanclinicalpilot study[J].Spine,2004,29(5):504-514. 19.SandhuHS.KhanS.Animalmodelsforpreclinicalassessment ofbonemorphogeneticproteinsinthespine[J].Spine,2002, 27(16s):$32—38. 2O.SandhuHS,KhanS,SuhD,eta1.Demineralizedbonematrix. bonemorphogeneticproteins,andanimalmodelsofspinefu— sion:anoverview[J].EurSpineJ,2001,10(Supp1):S122一S131. (收稿日期:2005—04一l8修回日期:2005—12—3) (本文编辑卢庆霞)