MTT法测定细胞生长曲线

MTT法测定细胞生长曲线 取生长状况良好的细胞，常规消化制成单细胞悬液，计数，调整细胞成六个浓度梯度，依次为:5×103，1×104，2×104，3×104，4×104，5×104/ml，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200 μl，每个浓度组设六个复孔，共接种七块培养板， 37?，5% CO2浓度，饱和湿度培养箱中连续孵育 , 继续孵育4h后终止培养，快速翻转培养板，24/48/72/96/120/148/172小时后，每孔加入20 μl MTT溶液 弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于490 nm处检测各孔的吸光值(OD值)，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取六孔平均值，实验重复三次。以培养时间为横轴，吸光值为纵轴，绘制生长曲线。 做MTT时，最好先将培养板中的培养液去掉，再加入MTT和PBS孵育4小时，后再加入DMSO溶解颗粒就行了。我做的时候因为没有平板离心机，就用手甩板，力量要掌握好，不重不轻，虽然会损失一部分细胞，但由于细胞本身的重力原因大多数都保存下来了。 下面我把我的方法写出来，仅作参考: 1.液体培养实验 将处于对数生长期的细胞以每毫升5×104个加入培养体系，处理组分别加入药物，未处理组加入等量的培养基，种1ml于24孔板中，每个浓度平行接种3孔，培养5d，每天计数活细胞数(台盼蓝拒染)，实验重复3次。 2. 四唑盐(MTT)比色试验 使用96孔板培养细胞，细胞密度为每毫升5×104个，处理组分别加不同浓度的药物，对照组加入等量培养基，每个浓度平行接种3孔, 5d后离心，去上清，每孔加入5mg/ml MTT 10µl及PBS 100µl,37?,5%CO2,饱和湿度培养4h后离心去除上清，加入200µl DMSO，充分振荡溶解甲瓒颗粒后用酶标仪(波长570nm或540nm)测定各孔的OD值, 实验重复3次。