甘油醛_3_磷酸脱氢酶结构的保守性

甘油醛_3_磷酸脱氢酶结构的保守性 生物物理学报 第十四卷 第三期一九九八年九月 ACTA BIO P HYS ICA S I NICA Vol . 14 No . 3 Se . 1998p 甘油醛 -3 - 磷酸脱氢酶结构的保守性 宋时英 郭 剑李 军林政炯 ( ) 中国科学院生物物理所生物大分子国家重点实验室 北京 100101 摘要 对中国南海龙虾等五种种属的甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶晶体结构进行了比较 , 结果显示该酶三维结构的高度保守性 。结构类似性包括酶活性中心 、与辅酶结合部位 、二级结构 、结构域组织 、亚基 排列以及许多有序水结构 。位于分子中心的 S - loo区存在两种略有差别的构象 ,分别对应于耐热 p 酶与不耐热酶 。对其它细小的结构差别也进行了分析与讨论 。 关键词 : 甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶晶体结构结构保守性 ( ) GA 甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶 PD H是生物体内糖酵解过程中的一个重要酶 , 其生理功能是催化甘油醛 - 3 - 磷酸氧化磷酸化 , 生成 1 , 3 - 二磷酸甘油酸 。 由于该酶在生物体内含量 丰富 ,提取方法简便 ,以及它与辅酶结合的别构方式 ,因此被广泛研究 。 GA PD H 存在于各种不同种属的生物体内 。目前 , 已经测定出一百多种种属 GA PD H 的 一级序列 。不同种属来源酶的氨基酸序列有明显差别 。 三维结构研究亦已有不少结果 。2. 5 ! () B S , 1. 8 ! ; B aci l l us s tea rot he r m o h i l usT he r m ot oam a r i t i m a 分辨率以上的结构有 : p g ( ) ( TM , 2. 5 ! ; ) ( TA , 2. 5 ! ; Esc he r i c h i a col i EC , wil d -t eT he r m us a u a t i c usyp q 1 - 8 ) ) ( 2. 17 ! 。 本实验室研究中国南海 Pal i n u r us v e rs icol o r 1. 8 ! 和 N 313 TPV 高分辨 9 - 12 率 GA PD H 系 列 晶 体 结 构, 2. 0 ! 分 辨 率 天 然 GA PD H 和 1. 88 ! 分 辨 率 羧 甲 基 化 ( ) GA PD H 结构分析结果已存入 B roo k ha ve n 蛋白质数据库 ID Co de 1SZJ 和 1D SS 。本文通 过比较这些不同种属酶的结构 ,探讨 GA PD H 三维结构的保守性 。 1 与方法 采 用 X - 射 线 衍 射 方 法 测 定 Pal i n u r us v e rs icol o r GA PD H 的 精 细 结 构 。PV 天 然 () ( ) GA PD H 简称 holo 酶晶体属 C2 空间群 , 结构修正最后的晶体学 R 因子为 0. 171 2. 0 ! , 立体化学合理 。 从 B roo ka ve n 蛋白质数据库获得其它 4 种种属来源的 GA PD H 的原子坐标 13 数据 , 采用 Q U A N TA , XPL O R 以及 TU RBO 中有关程序进行计算和结构比较。 2 结果与讨论 2. 1 总体结构 GA PD H 分子由四个序列等同的亚基组成 , 不同种属 GA PD H 亚基所含氨基酸残基数略 ( 有差别 ,一般是 330 到 333 个 。 比较已知 2. 5 ! 分辨率以上结构的五种种属 PV , EC , B S , ) TA , TM 的 GA PD H 一级结构 , 发现序列完全相同的有 109 个残基 , 另有 28 个残基分别对 () ( ) 耐热酶 B S , TA , TM 和不耐热酶 PV , EC保守 。耐热酶和不耐热酶一级结构差别达 50 %以 上 ,但总体结构仍然很类似 。GA PD H 四个亚基的空间排列呈现 222 对称 ,每个亚基可以分为 两个结构域 : 催化结构域和辅酶结合结构域 。这两个结构域二级结构的共同特点是中间为β αα 折叠层两侧分布着一些螺旋 。 图 1 为五种种属 GA PD H 的 C原子位置比较 , 可以看出 * ) α ( ( ) Ta bl e 1 R m s de viat io n s ! of Cato mic o si t io n bet wee n PV GA PD H Ga n d p GA PD H f ro m o t he r secie s .p ( )( )( )( )EC P B S R TA R TM R Subu ni t 0. 69 0. 82 0. 99 1. 12 Cat al t ic do mai n0. 33 0. 61 0. 68 0. 78 y + N AD bi n di ndo mai n0. 89 0. 96 1. 10 1. 22 g Ho mo se ue nce 66 % 54 % 49 % 48 % q * The subu ni t na me s a re i n dicat e d i n t he a re nt he si s .:p 190CA 190CA 196CA 187CA α of t he mai n - c hai n Sue ro si t io n Fi. 2Sue ro si t io np p Fi. 1of Cbac k2g p p g bo ne of PV GA PD H a n d o t he r st r uct ure s of GA PD H i n S - loo p re gio n . EC ( ) ( ) ( ) GA PD Hs bro ke n li ne s. t hi n bro ke n li ne , PV t hic k bro ke n li ne , ( ) ( ) TA t hi n li ne , TM t hic k li ne . 不同种属 GA PD H 亚基结构十分相似 。表 1 给出 PV GA PD H 与另外四种高分辨率 GA PD H α( ) 的同源度以及其 C原子位置均方根偏差 r msd值 。最大的 r msd 值仅为 1. 12 ! ,说明结构保 守性很好 。另外可以看出 ,同源程度越大 ,r msd 值越小 ,表明不同种属 GA PD H 酶三维结构的 细微差别与一级结构的差异密切相关 。从表 1 中还可以发现催化结构域的结构相似程度明显 + 高于辅酶结合结构域 。不同种属 GA PD H 的辅酶 N AD 分子的构象亦很类似 , 均为 S 型构 象 。 2. 2 活性中心的结构 αGA PD H 活性中心 Cs149 处于折叠与螺旋的连结区 , 在已知三维结构的几个种属酶 yβ 中 , 146 - 152 的一级序列完全相同 , 该区域结构稳定 。选择与催化作用有关的残基 Se r 148 , 计算其原子平均温度因子 , 结果表明活性中T h r 208 和 A r 231 , Cs149 ,Hi s176 , T h r 179 , g y ( ) 心的平均温度因子明显低于整个亚基平均温度因子 见表 2, 提示精确的活性部位构象是 GA PD H 催化功能发挥的必要条件 。活性中心构象比较表明 , PV 酶与 EC , B S , TA 酶构象很 403 - 3 - 磷酸脱氢酶结构的保守性 甘油醛 第 3 期 Ta bl e 2 si t e of GA PD H . A ve ra e B - f acto r s i n t he act i veg ( )( )( )( )( )PV G EC P B S R TA R TM R ()B1 act i ve si t e 20. 89 20. 51 10. 23 21. 10 12. 93 ( )25. 52 24. 65 16. 91 31. 17 22. 41 B2 subu ni t B1 / B2 81. 8 % 83. 2 % 60. 5 % 67. 7 % 57. 7 % ( ) 类似 ,只有 TM 酶的构象与其它四种酶有差别 ,即 208 - 215 以及 SO4 501 Pi 的位置变化 。+ 位于活性中心的辅酶 N AD 分子 ,主要通过 O 7N , O 4’ N , O 1 PN , O 2 PA , O 3’ A , O 2’ A 以 () 及 N 6A 等原子与酶蛋白原子之间的氢键与酶蛋白相结合 表 3, 这些氢键中的大多数是保守 的 。由于 77 ,119 和 180 位的残基种类不同或侧链位置的差别 ,在有些种属酶中此三个残基未 + 能形成氢键 。 三个耐热酶的 180 位为 A sn ,形成 N AD O 2 PA A sn 180 N D 2 氢键 ,而不耐热 酶为 Ala ,所以无类似氢键 。 + Ta bl e 3 Hdro e n bo n ds bet wee n N AD molec ule a n d e nz me ro t ei n .ygy p *A to m 2 A to m 1 )( Di st a nce ! ( )( )( )( )( )PV G EC P B S R TA R TM R 3. 09 2. 91 3. 10 3. 39 2. 92 N AD O 7N A sn 313 N D 2 - N AD O 4’ N Se r 119 O G 3. 21 3. 23 - 3. 15 2. 88 N AD O 1 PN Ile 11 N 2. 79 2. 85 2. 76 2. 90 3. 14 3. 21 3. 08 3. 14 3. 15 N AD O 1 PN A r 10 N g 3. 06 A r 10 N2. 95 3. 27 3. 10 3. 19 N AD O 2 PA g A sn 180 N D 2 - - 2. 88 3. 24 2. 98 N AD O 2 PA A s32 OD 22. 92 2. 86 2. 61 2. 53 3. 04 N AD O 3’ A p N AD O 2’ A A s32 OD 12. 92 2. 70 2. 64 2. 93 2. 74 p N AD N 6A A r 77 O 3. 26 3. 19 3. 44 - 3. 34 g * The re si due na me s a re f ro m B S. : 一般认为 GA PD H 催化机制为在催化甘油醛 - 3 - 磷酸氧化磷酸化反应过程中 , Cs149 y + 巯基与底物醛基加成 , 形成半缩醛 , 然后脱氢生成一个酰化酶 , 底物脱下的氢则被 N AD 接 6 受 。前人曾提出过几种不同的催化反应中间物模型 ,在 Emile D uee 等提出的中间物的模型 中 ,C () 上的 O 与 149 的 N 形成氢键 ,而 Se r 148 的 O G 与 Th r 151 的 N 和 O G1 作用 , C () 的2 1 + O 与 Hi s176 的 N E2 和 N AD 的 O 7N 作用 。我们比较了五种属酶中 Cs149 的 S 原子与y + Emile D uee 模型相关原子 N AD O 7N , CHi s176 s149N , N E2 , Th r 179O G1 等原子之间距y 离 , 发现这些原子间距离在各种属酶中很近似 。这进一步说明了 GA PD H 活性部位结构的相似性 。另外 ,耐热酶的这些距离总和略小于不耐热酶 , 表明耐热酶结构更紧密 ,这可能与耐热 酶具有更好的热稳定性有关 。 S - L oo 区的结构2. 3 p S - L oo区处在分子中心 、两个亚基的接触面 ,对整个分子结构的稳定性至关重要 。由于 p ( ) 该区域是一段二级结构含量较低的自由卷曲 。表 4 给出五种酶 170 - 210的序列比较 , 从表 ( ) ( 178 - 201的序列等同度可以分为两类 : 一类是耐热酶 B S ,中看出这五种酶 S - Loo区 p ( ) Ta bl e 4 Pa r t ial a mi no aci d 170 - 210of GA PD H f ro m f i ve se ue nce ssecie s .q p Ξ :Co n se r vat i ve re si due s i n all GA PD H . * :Co n se r vat i ve re si due s fo r t he r mo hilic a n d me sohilic secie s re sect i vel .p p p p y ) ( ) TA , TM ,另一类是不耐热酶 PV , EC,类内序列等同度均为 87. 5 % ,类间序列等同度仅为33. 3 % 。 三个耐热酶均缺少 189 位残基 。与此类似 ,该区域存在两种构象分别对应于耐热酶 () 和不耐热酶 图 2。同时发现在该区域中 ,耐热酶的氢键明显多于不耐热酶 ,提示 S - Loo区 p 的氢键可能与耐热酶的热稳定性有关 。 2. 4 结构域间的氢键 GA PD H 亚基包含两个结构域 。在所比较的五种种属的酶中 ,催化结构域和辅酶结合结构 α域之间均不存在盐键 ,而有数量不等的氢键联系。 从表 5 中看出 ,很多氢键是保守的。 螺旋3 ( ) 312 - 332中的 312 , 313 和 320 是连接两个结构域的主要残基 ,它们分别和催化结构域的 Ta bl e 5 Int e r do mai n h dro e nbo n ds . y g **)( Do mai n 1 Do mai n 2 Di st a nce ! ( )( )( )( )( )PV G EC P B S R TA R TM Q - 3. 16 - - Th r 49 O A sn 284 N D 2 - A sn 146 O A sn 152 N D 2 2. 90 2. 88 - 2. 85 - - - 2. 96 - V al 49 O - A sn 284 N D 2 2. 92 2. 67 2. 68 2. 68 A s312 OD 1Gl 285 N2. 61 p y Ξ3. 10 2. 94 3. 30 3. 20 - A s312 OD 1A sn 236 N D 2 p A sn 236 N D 2 2. 66 - 2. 85 - - A s312 OD 2p A sn 313 OD 1 Se r 238 O G 2. 91 2. 94 3. 03 2. 76 2. 87 3. 01 2. 96 2. 89 2. 80 2. 98 A sn 313 OD 1 V al 237 N 3. 06 3. 27 3. 24 - 3. 22 A sn 313 N D 2 A sn 236 OD 1 A r 320 N H13. 14 - 3. 01 3. 01 2. 88 Se r 289 O G g 2. 73 2. 85 2. 83 2. 85 A r 320 N H1A sn 287 O 2. 99 g 3. 07 - 3. 12 3. 27 3. 12 A r 320 N H2A sn 287 O g - 3. 29 - - - Gl 316 NGl u 268 O y L s320 N ZGl 269 O- 2. 78 - - - y y To t al 10 10 10 8 7 * + : Do mai n 1 = N AD do mai n ; Do mai n 2 = do mai n . bi n di n Cat al t icg y Ξ The Th r 236 O G1 :h dro e n bo n d i s A s312 OD 1y gp 405 - 3 - 磷酸脱氢酶结构的保守性 甘油醛 第 3 期 236 - 238 , 285 - 289 等残基形成氢键 。另外 , B S 和 EC 酶还有 49 位残基的 O 原子与 284 位 残基的 N D 2 原子之间的氢键 ; PV , EC 和 TA 酶还有 A sn 146 O A sn 152 N D 2 氢键 。 TM + 酶两个结构域之间的氢键较少 , 相对其它种属酶来说 , 其 N AD 结合结构域有一个明显的转 动 。 2. 5 亚基间的氢 不同种属 GA PD H 晶体晶型不同 , 分子在晶胞中的堆积方式不同 。但分子中 4 个亚基 () 排列均为 222 对称 。亚基之间的结合主要通过氢键 包括盐键和疏水作用 。亚基之间结合稳 定程度直接与分子的稳定性相关 。我们比较了五种酶亚基间的氢键 , 发现其中 50 %以上的 Th r 173 , A s186 , A r 194 , A r 197 ,Ile 203 , Se r 280 , 氢键是相当保守的 , 主要涉及 Se r 48 , p g g 约 25 %氢 键 是 较 保 守 的 ,A s282 , A s293 等 残 基 ; 涉 及 A sn 202 , A s276 , L s306 等 残 p p p y 基 ; 其余氢键随着种属不同而变化 。 在五个种属酶中亚基间氢键总数随着耐热性增加而减() 少 表 6, 每个种属酶均有两个主链间氢键分布在 P 轴接触面 ; 不同种属酶间的盐键数量不 等 , P 轴接触面盐键较多 , Q 轴接触面的盐键很少 , R 轴接触面无盐键存在 。此外 , 亚基间 还有通过水桥形成的氢键 。亚基间的疏水作用可能对耐热性贡献更大 。 Ta bl e 6 Int e r subu ni t bo n ds . h dro e ny g PV EC B S TA TM ( )( )( )( )( )22 8 24 8 28 7 24 10 22 6 P - a xi s i nt e rf ace ( )( )Q - a xi s i nt e rf ace 4 8 4 1 6 3 1 R - a xi s i nt e rf ace 22 22 10 9 10 to t al 48 54 42 39 35 * The di st a nce of t he h dro e n:! . bo n d c ut s off at 3. 4 y g * * The n u m be r s of :sal t bri d e s a re sho we d i n t he a re nt he si s .gp 2. 6 有序水结构 有序水分子对于蛋白质的构象以及生理功能的发挥具有很重要的作用 。在 PV GA PD H 分子四个亚基中 , 有相当一部分有序水分子位置是基本对称的 , 这些对称水大都在分子内部 , + PV 酶中有 80 %约有一半分布在 N AD 结合部位和 S - loo区域 。 与 B S 酶的水结构比较 , p 的对称水在 B S 酶中存在 , 而且也表现出对称性 , 这表明有序水分子是相当保守的 , 其中一些 + 水分子可能参与了催化反应 。 有一些通过有序水分子形成的间接氢键也很保守 , 如 : N AD N 7N Wa t O Gl u 314 O E2 氢键在另外 4 种酶中也存在 , 这可能由于此种氢键是发挥其催 化功能所必须的 。 参考文献 1 Ska rzn ski , T . , Moo d, P . C . E . , & Wo naco t t , A . J . :S t r uct u re ohol o - l ce r al de hde - 3 - hos h at eyy f gyy p p 1 . 8A resol u t i o n . J . M ol . B i ol . 1987 , 193 : 131 - 187. de h d roe n ase o r m B aci l l us s t ea rot he r m ohi l us aty gf p 2 Ska rzn ski , T . , Moo d, P . C . E . , & Wo naco t t , A . J . :Coe n z m e i n d uce d co no r m at i o n al c h n es i n D -yy y f g J . M ol . B i ol . 1988 , 203 : l ce r al de hde - hos h at e de hd roe n ase o r m B aci l l us s t ea rot he r m ohi l us .gyy 3 - p p y gf p 1097 - 1118. 3 Mo ra s , D . , Ol se n K. W . , Sa be se n , M . N . , et al . : S t u d ies oas m m et ri n t he t h ree -d i m e nsi o n al s t r uct u re f y y J . B i ol . C he m . 1975 , 250 : 9137 - 9162. oL obs t e r D - l ce r al de hde - 3 - hos h at e de hd roe n ase .f gyy p p y g 4 M ur t h, M . R . N . , Ga ra vito , R . M . , J o h n so n , J . E .et al . : S t r uct u re oL obs t e r a o - D -y f p 3 . 0 ! resol u t i o n . J . M ol . B i ol . 1980 , 138 : 859 - 872. l ce r al de hde - 3 - hos h at e de hd roe n ase atgyy p p y g 5 Duee , E . , Oli vie r - Deri s , L . , Fa nc ho n , E . , et al . :Co m a riso n ot he s t r uct u re ow i l d - t e a n d ay p f f y p N 313 T m u t a n t oEsc he ri c hi a col i l ce r al de hde - 3 - hos h at e de hd roe n ase : i m l i cat i o n o r N A D bi n d i n f gyy p p y gp f g J . M ol . B i ol 1996 , 257 : 814 - 838. a n d cooe r at i v i t .py 6 Ko r n do rf e r , I . , St eie , B . , Hube r , R . , et al . :T he c rs t alhol o - l ce r al de hde - 3 - hos h at e de hd roe n asep y gyy p p y g 2 . 5 resol u t i o n . J . M ol . B i ol . 1995 , 246 : ro m t he he r t he r m ohi l i c bact e ri u m T he r m ot oa m a ri t i m a atf y pp g 511 - 521. 7 Ta n ne r , J . J . , Hec ht , R . M . & Kra use , K. L . : Det e r m i n a n ts oe n z m e t he r m os t abi l i t obse r v e d i n t hef y y 2 . 5 ! resol u t i o n . m olec u l a r s t r uct u re oT he r m us au at i c us D - l ce r al de hde - 3 - hos h at e de hd roe n ase atf q gyy p p y g 1996 , 35 : 2597 - 2609. B i oc he m is t ry 8 Vellie u x , F . M . L . M . J . , et al . : D . , Hadu , J . , Ve rli n de , C .S t r uct u re ol coso m al l ce r al de hde -3 - j f gygyy hos h at e de hd roe n ase ro m T r a noso m a b r ucei det e r m i ne d ro m L a ue d at a .P roc . N at l . A ca d . S ci . U SA , p p y gf y p f 1993 , 90 : 2355 - 2359. 9 So n, S . - Y. , Gao , Y. - G. , Zho u , J . - M . et al . :P rel i m i n a r c r s t al l or a hi c s t u d ies oL obs t e r D - g y yg p f l ce r al de hde - hos h at e de hd roe n ase a n d t he m o d i ie d e n z m e ca r ri n t he l uo resce n tgyy 3 - p p y gf y y g f de ri v at i v e . J . M ol . B i ol . ,1983 , 171 : 225 - 228. 10 L i n , Z. - J . , L i , J . , Zha n, F . - M . , et al . :S t r uct r ue oD - l ce r al de hde - 3 - hos h at e de hd roe n aseg f gyy p p y g N A D de ri v at i v es at 2 . 7 ! resol u t i o n . A rc h . B i oc he m . ro m Pal i n u r us v e rsi col o r ca r ri n t he l uo resce n tf y g f 1993 , 302 : 161 - 166. B i ohs .p y ( ) 11 宋时英 、林政炯 : 龙虾甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶结构中的氢键 , 生物物理学报 , 1997 , 13 3: 369 - 374. l ce r al de hde - hos h at e de hd roe n ase ro m12 Shi i nSo n, J u n L i & Zhe nio nL i n :S t r uct u re ohol o - gyy 3 - p p y gf yg g gjg f 2 ! resol u t i o n . Sect io n D . 1998. Pal i n u r us v e rsi col o r rei ne d atA ct a C rs t .f y ( ) 13 B r u ne r , A . T . : X PL O R M a n u al Ve r sio n 3. 0, 1992 , Yale U ni ve r sit , New Ha ve n , Co n nect ic ut , U SA .gy CO NS ERVATI VE O F 3 - D IM E NS IO NAL STRUCTURE O F D - GLY CERALD E HYD E - 3 - P HOSP HATE D E HYD RO GE NAS E So n Shi i nGuo J ia n L i J u n L i n Zhe n io ng yg gjg ( )N a t i o n a l L abo r a t o roB i o m ac ro m olec u les , I ns t i t u t e oB i oh s i cs , A ca de m i a S i n i ca , B eii n , 100101y f f p yj g ABSTRACT St r uct ural 3 - co ma ri so nha s bee n do ne fo r D - p ral de h de - ho sha t e de h 2lcegyyp p y co n2 dro e na sef ro m f i ve secie s i ncl udi n Pali n ur us ve r sicolo r . T he re sul t s re veal hi hg p g g se r va t i ve i n 3 - d st r uct ure fo r T he st r uct ural t he act i ve t hi s e nz me .si mila ri t i ncl ude sy y subu ni t a r2 coe nz me bi n di n seco n da r o r a niza t io n ,si t e , t he si t e , st r uct ure , do mai n y g y g diff e re nt co nfo r ma2 o r de re d wa t e r molec ule s . Two a s well a s ra n e me ntma n sli ht l g y g y w hic h loca t e s i n t he ce nt e r of t he molec ule , co r re 2 loo re io nt io n s e xi st i n t he S - p g so n di n to t he r mohilica n d me so t he r mo hilic e nzme s re sect i vel .So me mi no r pgp p y p y re io n sa nal ze dst r uct ural diff e re nce s i n o t he r a re al so a n d di sc usse d . gy Wor ds : Gl ral de h de - 3 - ho sha t e de h dro na sest r uct ure ceeKeCr st alyyp p y g y y St r uct ure co n se r va t i ve 本文于 1998 年 2 月 26 日收到 。