【论文范文】滇藏荨麻提取物的5α还原酶抑制活性的研究

【论文范文】滇藏荨麻提取物的5α还原酶抑制活性的研究 论文范文 目:滇藏荨麻提取物的还原酶抑制 活性的研究 编辑:司马小 作者:王炜 冀保全 唐玲 史丽颖 冯宝民 王永奇 【摘要】 目的研究滇藏荨麻提取物各极性部位的5α-还原酶抑制活性。方法基于酶联免疫方法～建立抑制5α-还原酶体外模型～从大鼠前列腺组织中提取5α-还原酶～与底物睾酮以及供氢体NADPH共同组成了一种微量反应体系。利用酶标仪检测双氢睾酮(DHT)的含量。以DHT的含量来判断5α-还原酶的活性～用非那雄胺做阳性对照药。结果滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物具有显著的抑制5α-还原酶的活性。结论滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物为抗BPH的有效部位。 【关键词】 5α-还原酶 滇藏荨麻 双氢睾酮 前列腺肥大 酶联免疫 Abstract:ObjectiveTo study the inhibitory effect of all kinds of constituents in Untica mairei Levl's extract on 5α- reductase activity. MethodsThe 5α-reductase inhibitor's model in vitro was established which were composed of the 5α-reductase extracted from the prostates of male rats, testosterone (as a substrate) and NADPH (as a hydrogen supplier). The concentration of DHT which measured by ELISA could show the activity of enzyme. The specificity of 5α- reductase was judged with finasteride as a positive control. ResultsThe result showed the n-butanol extractant in the extract of Untica mairei Levl's roots which extract by 95% alcohol could inhibit the activity of the 5α-redutase remarkably.Conclusionn-butanol extractant in the extract of Untica mairei Levl's roots which extracted by 95% alcohol is the effective part, which can resist BPH. Key words:5α-reductase, Untica mairei Levl, Dihydrotestosterone(DHT), Benige prostaticHyperplasia, Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 良性前列腺肥大症(Benign Prostatic Hyperp lasia, BPH)属于 常见男性疾病之一。据临床医学统计数字表明BPH为多发病之一。50 岁以上的男性中BPH的发病率约为40%，50%～65岁以上男性中BPH的 发病率高达60%，65%,而70岁以上约90%,1,2,。患有BPH症的病人, 因肥大的前列腺组织压迫尿道而引起小便不畅,排尿困难,尿频尿急,尿 液残留等症状～更严重者甚至会引起尿潴留,必须进行插管导尿术,病 人十分痛苦。 目前,荨麻制剂在国外,特别是在德国已被广泛应用。大荨麻 Untica dioica L.根提取物不仅用于BPH的治疗,也用于预防,3,。 大荨麻作为天然药物治疗BPH～为避免手术及西药的副作用提供了新的 安全可靠的途径,4～5,。 我们曾对国产的8种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗BPH的 筛选～结果表明滇藏荨麻Untica mairei Levl.和荨麻Untica fissa Pritz.根的20%和95%乙醇提取物具有强的抗BPH的作用,3,。为了进一步明确其有效部位～我们以5α-还原酶为作用靶点～采用酶联免疫法(ELISA)～对滇藏荨麻根的95%乙醇提取物进行了梯度极性溶媒萃取～并对不同极性组分进行了抑制5α-还原酶的活性研究。 甾体5α-还原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白～依赖还原型辅酶II(NADPH)作为供氢体～不可逆地催化睾酮,T,转化为生理活性更强的双氢睾酮,DHT,,6,～DHT被认为是BPH的主要病因。抑制酶活性～减少DHT的生成～已成为非手术治疗BPH的主要途径。 本次实验首先建立反应体系～利用生成的DHT与HRP(辣根过氧化物酶)标记的DHT竞争结合酶标板上的抗DHT抗体～通过颜色反应所测定的吸光值～最终换算为DHT的浓度～从而考察不同组分对5α-还原酶活性的影响。 1 材料 1.1 药品与试剂非那雄胺,保列治,～Merck Sharp & Dohme(U.K.) Ltd～批号J20050041,睾酮～上海久邦化工公司～批号20051106,NADPH～Biosharp 公司～批号041939,DHT双氢睾酮试剂盒 ADL公司～批号10-9031,其他化学试剂都为国产分析纯。 1.2 仪器 酶标仪(型号:RT-2100C～深圳雷社生命科学股份有限公司),数显不锈钢电热培养箱,型号:HPX-9272MBE～上海博迅实业有限公司医疗设备厂,,台式高速冷冻离心机,型号:Biofuge prime～R Heraeus 公司,,ALPHA1-4型冷冻干燥机,CHRIST公司,,微量振荡器,型号:MODEL MM-1 上海无线电仪器厂,,数显恒温水浴锅,型号:HH-2 常州国华电器公司,。 2 方法 2.1 还原酶的制备雄性SD大鼠3只～体重,200〒10,g～大连医科大学实验动物中心提供,～禁食不禁水过夜处死～迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎～用预冷的匀浆液,蔗糖0.73 mol〃L-1氯化钙1.91 mmol〃L-1,在玻璃匀浆器中匀浆,7,～在4?下以10 000 r〃mim-1低温高速离心20 min～取上清液再以16 000 r〃mim-1低温 高速离心30 min～即为5α-还原酶提取物。采用lowry法测定蛋白含量～以酶提物中的总蛋白含量表示5α-还原酶提取物的含量～将提取物放入小离心管在-70?下保存～备用。 2.2 样品制备取滇藏荨麻根100 g,粉碎～95%乙醇回流提取3次～1 h/次。将提取液浓缩至干浸膏。将95%乙醇提取物分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取～得石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层部分。另取滇藏荨麻根50 g,粉碎～20%乙醇冷浸～第1次24 h～第2～3次12 h。将提取液浓缩至干浸膏。 将各组分分别用50%乙醇配臵成4 mg〃ml-1工作溶液。按照“2.3”项中的操作向酶反应体系中加入。酶促反应后测定其OD值。 2.3 酶促反应体系的建立及DHT的定量测定5α-还原酶活性测定方法参照文献,7~9,～并参照对荧光法测定5α-还原酶反应的底物、NADPH和反应酶的浓度以及反应温度和反应时间等摸索的条件略加修改。操作分两部分完成～即?将反应成分依照先后顺序,缓冲液～37?恒温,睾酮,样品及阳性对照药,NADPH,酶组织液,加入96孔板内～使之微量化～设臵不同反应孔和对照孔板。反应温度为37?,相对饱和湿度,～反应时间为60 min,?采用ELISA法定量测定产物DHT～以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受试样品管中DHT的含量低于酶反应管中DHT含量时～则视为具有抑制5α-还原酶的活性。检测方法及计算参照试剂盒使用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上～辅酶NADPH浓度为1 mmol〃L-1～睾酮浓度为0.5 μmol〃L-1～结合试剂盒微量测定的特点～将整个反应体系的总量定为200μl。反应体系中各组分的比例见表1。 酶反应体系中各组分的原始浓度分别为:缓冲溶液,PBS 20 mmol〃L-1～蔗糖0.2 mol〃L-1～EDTANa2 1 mmol〃L-1,pH值6.8,,NADPH浓度,20 mmol〃L-1,;粗酶浓度,4.3 mg〃ml-1,,睾酮浓度,20 μmol〃L-1,;非那雄胺,1.3 mmol〃L-1,。 表1 5α-还原酶反应体系的组成,略, 3 结果 3.1 ELISA显色反应双氢睾酮,DHT,系列标准品的浓度分别为:0～2.5～5～10～25～50 ng〃ml-1酶标板读取的OD值依次为:0.199～0.726～1.085～1.713～2.561～2.832以OD值为纵坐标～以标准品的浓度为横坐标～绘制标准曲线。结果见图1。 图1 ELISA显色反应标准曲线,略, 3.2 对5α-还原酶活性的影响将样品测得的OD值代入回归方程～计算所得的DHT的含量。结果见图2。 从图2可以看出滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物有明显的抑制5α-还原酶的活性～而石油醚萃取物及20%乙醇提取物表现出弱的活性～其他受试样品则均未表现出抑制作用。 图2 滇藏荨麻提取物对5α-还原酶活性的影响,略, 4 讨论 我们选取5α-还原酶的抑制作用为指标～是因为5α-还原酶是睾酮向双氢睾酮转化的关键酶～而双氢睾酮是导致前列腺肥大症的重要因素。在老年人体内血清睾酮明显下降～但前列腺内雄激素仍然很高。其中90%为双氢睾酮,DHT,～为睾酮在前列腺内经5α-还原酶作用的代谢产物。人类前列腺的生长和发育有赖于双氢睾酮～因此阻断睾酮向双氢睾酮转化～降低血清中双氢睾酮水平～可抑制前列腺增生～缩小前列腺体积～增加尿流量～改善梗阻症状。 通过以上实验得出～滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物有明显的抑制5α-还原酶的活性～与阳性对照药对比分析～确认滇藏荨麻根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物为抗BPH的有效部位～其有效成分的研究仍在进行中。 【参考文献】 ,1, 李 飞. 良性前列腺增生治疗药研究进展,J,.药学进展～ 1995, 19 (4) : 193. ,2, 徐积恩. 良性前列腺增生治疗药普甾胺,J,.国外医学〃合成药〃生化药制剂分册～1995～16(4):240. ,3, 王永奇.荨麻属植物治疗BPH研究概况,J,.大连大学学 报～2005～26(2):54. ,4, 翁玲玲. 国外正在研制的甾体药,J,.中国药学杂志～ 1994～29(3):174. ,5, 解红武. 良性前列腺增生的药物治疗,J,.天津药学～ 2002～14(3):15. ,6, Metcalf B W～Holt D A～Levy MA. et al. Potent inhibition of human steroid 5α-reductase(EC 1.3,1.30)by 3- androstene-3-carboxylic acids,J,.Bioorg Chen～1989～17:372. ,7, Fvredrick W, Gveorge, Androgen. Metabolism in the Prostate of the Finasteride Treated Adult Rat:A Possible Explanation for the Differential Action of Testosterone and 5α-Dihydrotestosterone during Development of the Male Urogenita Tract,J,. Endocrinology～1997～138(3):871. ,8, Xin J,Tian W Sh. The screening and anti-prostatic hyperplasia activity assessment of novel steroid 5α- reductase inhibitors LTZ.8 and others,J,.Chin J Pharmacol Toxicol～2003～17(5):395. ,9, Kenneth S. Hirsch.LY 19704: A selective,nonsteroidal inhibitor of human steroid 5α- reductase type 1,J,.Pharmacolog～1993～90:5277.