SC_T7218.3-2015指环虫病诊断规程第3部分：鳙指环虫病.doc

SC_T7218.3-2015指环虫病诊断规程第3部分：鳙指环虫病.doc ICS 65.020.30 B 50 中华人民共和国水产行业 SC/T 7218.3-2015 指环虫病诊断规程 第3部分:鳙指环虫病 Protocols for diagnosis of Da吻/ogjria沿一 Part 3: Infection with Dactylogyrus aristichthy 2015-02-09 发布 2015-05-01 实施 中华人民共和国农业部发布 刖 SC/T 7218《指环虫病诊断规程》为系列标准: ——第1部分:小鞘指环虫病; ——第2部分:页形指环虫病; ——第3部分:鳙指环虫病; ——第4部分:坏鳃指环虫病; 本部分是《指环虫病诊断规程》的第3部分。 本部分按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的。 本部分由农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口。 本部分起草单位:河北省水产养殖病害防治监测总站。 本部分主要起草人:曹杰英、张志华、刘文青、李全振、李凤超、康现江、赵宝华、申红旗、侯金良。 指环虫病诊断规程 第3部分:鳙指环虫病 1范围 本部分规定了鳙指环虫病的流行情况与临床症状,以及鳙指环虫采集 与固定、形态学鉴定和分子检测的。 本部分适用于鳙等淡水鱼类患鳙指环虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。 2性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103水生动物产地检疫采样技术规范 3试剂和材料 3. 1水:配置试剂用水应符合GB/T 6682中一级的规定。 3.2乙醇:分析纯。 3. 3 Taq酶:一20?C保存,不得反复冻融或温度剧烈变化。 3. 4 dNTPs:含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP各 10 mmol/L 的混合物。 3. 5 上游引物 F:5'_ TTATGTGGACCTCTGT- 3、 3.6 下游引物 R:5'- AGCCGAGTGATCCACCA - 3'。 3. 7 DNA Marker:2 000 bp、l 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 3.8其他试剂见附录A。 4仪器和设备 4. 1体视显微镜和生物显微镜。 4.2台微尺、目微尺、显微摄影设备。 4. 3 PCR扩增仪。 4.4紫外透射仪或凝胶成像仪。 4.5电泳仪。 4.6普通冰箱和超低温冰箱。 4. 7离心机和离心管。 4.8电子天平。 4.9恒温水浴箱和微波炉。 4. 10微量移液器及吸头。 4.11解剖,、剪刀、镊子、解剖针。 4. 12载玻片、盖玻片、橡皮泥、培养皿和吸管。 5流行情况与临床症状 5. 1流行情况 鳙指环虫能感染鳙(Ah边c&A,《知7^)等。全国各地均可发生,发病高峰水温为20?C?25?C。 〇 5.2临床症状 鳙指环虫主要寄生于鱼的鳃部。病鱼鳃组织损伤,鳃丝肿胀、贫血,有斑点状淤血,鳃上有大量黏 液。重度感染时,鳃丝显著肿胀,鳃盖张开,病鱼极度不安、窜动、狂游,或游动缓慢、呼吸困难、上浮水面 而死。 6指环虫采集与固定 6. 1病鱼采集 捞取具有典型症状的鱼。如果现场无病原分离条件,将采集的病鱼用80%乙醇固定。样品封存和 运输应符合SC/T H03的规定。 6.2指环虫样品的采集 用针刺鱼脑,将鱼杀死。完整的取下全鳃,用小剪刀将鳃片分离,取一片鳃置于培养皿中,洒水少 许。用解剖针将虫体从總丝上剥离,用吸管吸出,放在载玻片上。在盖玻片的四角涂少量橡皮泥避免盖 玻片将虫体直接压碎,用镊子轻压盖玻片,显微镜下观察。 6.3指环虫样品的固定与保存 加一滴清水到载玻片上,用吸管吸取一个虫体置于水滴中,轻轻地盖上盖玻片,用一张滤纸在盖玻 片边缘缓慢吸水,直到水基本吸干为止。加上一滴APG溶液(见A. 1)到盖玻片边缘,直到浸满盖玻片 与载玻片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样品用70%乙醇保存,用于分子检测的虫体样品用95% 乙醇保存。 7鳙指环虫的鉴定 7.1鳙指环虫的形态学鉴定 显微镜下指环虫前端有2对头器、2对黑色眼点,呈方形排列,此为判断指环虫的简易特征。微调 焦距即可观察到指环虫后吸器的中央大钩、联结片和边缘小钩,指环虫靠近头部端可观察到交接器,后 吸器与交接器是指环虫鉴定的重要特征。根据需要用镊子轻压盖玻片以凸显几丁质结构进行拍照。 鳙指环虫虫体小型,体长0• 34 mm?0. 48 mm,宽0• 08 mm?0• 10 mm。中央大钩的内突、外突均极 发达,基部宽区很宽,但随即转成较长的狭窄区,钩尖较短。联结片发达,略呈倒“山”字形,中部弯向后 方,两端亦向后伸出二略尖的突起。副联结片颇长,做波浪状弯折数次,呈矮W形。边缘小钩可明显区 分出柄、柄轴及钩尖基突三部分。交接管为弧形尖管,基部呈半圆形膨大。支持器端部似贝壳状,覆盖 于交接管,基部略呈三角形。支持器基部由一细小的几丁质片与管基部相接,约于管长度1/3处形成一 环,于环基部一侧着生一成半桶状的骨片,此外更向前延伸成一倒三角形锥体,其底部与环相接,两侧由 二薄片合成,中间留有一窝状空隙,交接管先穿过环孔,然后变细穿入二薄片间空隙内,而终于支持器端 部下方。400倍显微镜下对鳙指环虫进行形态学鉴定,其中央大钩、联结片、交接器的形态特征参见图 B. 1、图B. 2、图B. 3、图B. 4。鳙指环虫的形态学测量特征指标见表1。 表1鳙指环虫形态学测量特征指标 单位为微米 测量的特征 变动范围 中央大钩全长 38. 0?44. 5 中央大钩基部长 35. 2?40. 0 表1 (续) 测量的特征 变动范围 中央大钩外突长 4. 5?7. 5 中央大钩内突长 8. 5 ?10. 5 中央大钩钩尖长 5. 0?7_ 0 边缘小钩全长 28. 5?35. 5 联结片长 3.0?5. 5 联结片宽 26. 4?30. 6 副联结片长 2. 0?3. 0 副联结片宽 34. 5 ?40. 5 交接管长 26. 5?34. 5 支持器长 26. 5?37. 5 7.2鳙指环虫的分子检测 7. 2. 1虫体DNA的提取 用吸管吸取乙醇固定的虫体标本1个,充分干燥以除去多余的乙醇后,转移至〇. 2 mL离心管中。 用100 pL TE缓冲液(见A. 2)浸洗2 h?3 h,离心后弃上清,加入9 juL裂解液(见A. 3),未经乙醇固定 保存的虫体则直接加裂解液。65?C水浴30 min后,95?C处理10 min,该裂解产物不需要进一步纯化就 可直接作为PCR的模板。也可用同等效用的试剂盒提取虫体DNA。 7.2. 2 PCR 扩增 42反应在50/xL体系中进行:10倍浓缩缓冲液(见A. ) 5 L,dNTPs ^L,引物(10 ml/L)各2 pL, MM〇DNA 模板 2 pUTaq 酶 1 L,双蒸水 36 。反应程序为:94?C 5 min;94?C 30 s,54?C 30 s,72?C 1 M min, 共25个循环;最后72?C 10 min。PCR反应应设置阴性对照和阳性对照。 7.2. 3 PCR产物的电泳和测序 用1XTAE电泳缓冲液(见A. 5)配成1%琼脂糖凝胶溶液,微波炉加热使琼脂糖完全溶解,待冷却 至60?C左右加人核酸染料GoldView(见A. 6)至终浓度为3 pL/100 mL?4 yL/100 mL,混勻后倒入封 固好的制胶板中,凝胶厚度在3 mm?5 mm,插人宽度适当的梳子。待凝胶完全凝固后,小心拔出梳子, 拆去封条,将凝胶放入装有1XTAE电泳缓冲液的电泳槽中,使电泳缓冲液刚好没过胶面:约1 mm)。 然后取5斗PCR产物与1斗的6倍上样缓冲液(见A. 7)混匀,用微量加样器将混合样品加到胶孔中, 以5 V/cm的电压电泳。当溴酚蓝电泳至适当位置后,用紫外观察灯或凝胶成像仪观察并记录结果。 PCR阳性产物会出现一条与鳙指环虫(1 133 bp)ITS1基因扩增片段一致的目的条带,空白对照没有该 目的条带。如存在目的条带,则取PCR扩增产物测序。 8综合判定 8. 1在显微镜下观察鳙等鱼类的鳃丝,如果观察到虫体,且符合7.1描述的鳙指环虫特征,则判断为鳙 指环虫。如果形态鉴定不能完全确定指环虫种类,可进一步用PCR方法扩增其ITS1序列,经测序后与 鳙指环虫的参考序列(参见附录C)进行对比,序列相似性在99%以上者,则判断为鳙指环虫。 8. 2鳙等鱼类感染鳙指环虫,且病鱼临床症状符合5. 2的描述,则判定为鳙指环虫病。 附录A (规范性附录: 试剂及其配制 A. 1 APG溶液 将饱和的苦味酸铵溶液和甘油按照1 : 1的比例混合即成。 A. 2 TE 缓冲液 pH 9.0 Tris-HCl 500 mmol/ L EDTA 200 mmol/ L NaCl 10 mmol/ L A. 3裂解液 50.45%NP-40、0.45%Tween-20、100mmol/LEDTA和100ug/mL蛋白酶K。蛋白酶K用0 mmol/L J-Tris HC1 (pH 8. 0)和 1. 5 mmol/L CaAc2配置。 A. 4 10 倍浓缩缓冲液:1〇Xbuffer)pH8. 8 Tris - HC1 100 mmol/ L 氯化钾(KC1) 500 mmol/L 氯化镁(MgCl2) 15 mmol/L A. 5 S 倍 TAE 电泳缓冲液(5 X TAE buffer) Tris 54. 0 g 硼酸 27. 5 g EDTA 2. 9 g 加双蒸水溶解到1 〇〇〇• 〇 mL,用5. 0 mol/L的盐酸(HC1)调pH到8. 0。 A. 6 核酸染料(Goldview) 用水配成l〇. 〇 mg/mL的浓缩缓冲液。用时每20. 0 mL电泳液或琼脂中加1. 5 pL。 A. 7 6倍上样缓冲液(6 xbuffer) 溴酚蓝100 mg,加双蒸水5 mL,在室温下过夜,待溶解后再称取蔗糖25 g,加双蒸水溶解后移入溴 酸蓝溶液中,摇匀后定容至5〇 mL,加入氢氧化钠(NaOH)溶液一滴,调至蓝色。 附录B (资料性附录: 指环虫的中央大钩、联结片、交接器的测量特征 B 1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图 见图B. 1。 说明: 1?3 ——指环虫中央大钩的几种常见形式; c~~一外突长; i- - 小钩全长; ? 4 ——发育完全的边缘小钩; d—一内突长; j——交接管基座; 5 - ——雏形的边缘小钩; e—一钩尖长; k——交接管基部 6?7 ——指环虫交接器及其各部分; f—— 腱带; 1——交接管; - a -- 中央大钩全长; g—一钩尖; m- - 支持器。 b ? ——基部长; h—一钩柄; 图B. 1指环虫几种几丁质结构及测量方法示意图 B. 2常见指环虫联结片形态及测量方法示意图 说明: q -- 联结片的长; r -- 联结片的宽。 图B. 2常见指环虫联结片形态及测量方法示意图 B. 3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图 见图B. 3。 说明: 1~8——指环虫副联结片的几种常见形式; q ----- 副联结片的长; r ——副联结片的宽。 图B. 3指环虫副联结片的几种形态及测量方法示意图 B. 4鳙指环虫的后吸器、交接器形态特征 见图B. 4。 说明: 1— ~后吸器; 2— —交接器。 图B. 4鳙指环虫的后吸器、交接器形态特征 附录C (资料性附录: 鳙指环虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS1)扩增产物的参考序列 鳙指环虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS1)扩增产物的参考序列(1 133 bp),下划线为引物。 1 TTATGTGGAC CTCTGTTCAG GTACCTCTGG TGCTTGGATA GAACCACATA AGCAGGTGAA 61 ACTTCTTAGA GGAACTGGCG CTCGAAAAGG CGCACGAGAA AGAGCAATAA CAGGTCTGTG 121 ATGCCCTAAG ATGTCCGGGG CCGCACGCGT GCTACAATGA CGATGCTACT GAGCATGATT 181AACTTGTCCG AAAGGATCGG TGAAACTGTT CAATCATCGT CG 丁 GACTGGG ATTGGGGTTT 241 GCAATTGTCC CCCATGAACC AGGAATTCCT AGTAAGCACA AGTCATAAGC TTGTGCTGAC 301 TACGTCCCTG CCCTTTGTAC ACACCGCCCG TCGCTACTAC CGATTGAATG GTTTAGCAAG 361 GGCATTGGAT CGAGCCTTTG CGGTTCATAC TGCTTGGGTT TGAGAAGATG TCCGAACTTG 421 ATCATTTAGA GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC 481 ATTATCAAGT TCCTATTAAA ATGCACGGTT CAGTGCTTGT GTCGGCAGAG TGTATTGTGT 541 GCTCGACGCG GCAAAGCCTT ATGGCTGGTC GCGAGCGCGC ATTGCCTGTT TAGATACAAG 601 CCCTCCTGGG CTGCTGTGTT AGATCCTACC GAGGGGCTGC GCCCTCATGT GGATCATTGT 661 GGTACAGAAA TGTGCGTAGC AGGGACGGTT GTAACACTCT TACTCCGGCT ACTAGCTACG 721 TACATCCGCC TAGCTCTAAC TGGAGCGTCT GAATGGCTGC GTGCGGGTGG TAATGTGTCG 781 CACGTAGACT TTAGTCGCAA CGTATGTTCT TAAACCGCCA GTTATTGTGA AGGTACATTA 841 CAAACCITCT CCCTTCGGGT GAGTCCTGTT TGTGCTTTGA AAACTTAAAA ATTGGTCATT 901 ATGGCCGCTG AGTTGCCTGG TCTCCTCGGC ACGATCGCGC GTTCGCTGGT GTGAACTGGT 961 GGGCGTGCGT GTGTCTAATG TCGGGGGGTG TGGCCAGGTG ACGAGGTGAC TATCTAGACC 1021 GGGTATACGC CCGCTCAATG GCTCGGTGTT TGCGCTTAAC CGTGCGGACA TTGGACTGTT 1081 GGACGGTCTA CGTGTATCAA CCTATACAAC TGCAAGTGGT GGATCACTCG GCT