【doc】胎牛骨髓多肽对小鼠骨髓细胞CFUF—GM增殖的实验研究

【doc】胎牛骨髓多肽对小鼠骨髓细胞CFUF—GM增殖的实验研究 胎牛骨髓多肽对小鼠骨髓细胞CFUF—GM 增殖的实验研究 , t 中国生化药物杂志ChineseJourn~ofBiochemi~Pb丑rm?咖岫1996年第17卷第5期 胎牛骨髓多肽对小鼠骨髓细胞 CFUF—GM增殖的实验研究 . 罗 ._ 新 -- 青-- 余宙耀陈阳避张宜傻 一 弓 中国人民解放军第四五八医院肝病研究所(广卅f510602) /盯摘赛通过特定工艺将胎牛骨髓进行分离提取,发现其中古有对小鼠造血系统具有调节作 用的中分子多驮.甩体外半固体琼脂培养及M1T法分别观察其对小鼠骨髓细胞cFu—oM增殖和骨 髓细胞DNA合成的影哺,结果明,胎牛骨髓小分子多驮(BGF)对骨髓单按粒系统细咆的增殖具有 朝搬作用. 物活性物质可影响粒单系集落形成单位 (CFU—GM形成集落.我们从眙牛骨髓中提 取到一种小分子多肽物质,发现其对小鼠造 血具有调控作用.能刺激粒单系统的增殖.本 实验初步探讨了眙牛骨髓中造血活性物质在 造血活动中的作用.为进一步研究该物质的 造血调节及应用提供一些实验数据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1动物:纯种N1H雌性小白鼠.体重l8 , 22g广东省卫生厅医用动物实验场提供 (批号:93022).每次实验取2只小鼠股骨.用 RPMI1640冲洗出全部骨髓,用6号针头反 复吹打,过4号针头制成单细胞悬液.计数骨 髓有核细胞.并调整至所需细胞浓度. 1.1.2试荆:马血清由军事医学科学院二所 提供{小鼠肌条件培养液按葛氏方法制备m; RPMI1640,MTT及二甲亚砜均购白美国sig— ma公司}琼脂粉为上海化学试剂厂分装的日 本产品.MTT在使用前用RPMI1640稀释为 收稿日嘲1996—0424 用. 1.1.3实验用药物;眙牛骨髓活性物质由本 所自制,批号941001,为冻干粉针剂,每支含 多肽5mg.实验时用RPMI1640稀释成下列 浓度;5mg/m1.2.5mg/m1.0.5mg/m1.0.25 mg/ml,0.05mg/ml等. 1.2方击 1.2.1CFU?GM半固体琼脂培养体系[ RPMJ伟4O培养液4m1.马血清2m1.小鼠肌 浸液0.6ml,小鼠骨髓有核细胞悬液0.4ml (内含5×10.个有核细胞),实验组分别加 BGF20,对照组加等量生理盐水,混合后 37c水浴10rain.加入煮沸的5琼脂0.4 叫,快速混匀,再加入事先加有0.1ml小鼠 肌条件培养液的培养皿中,每皿1ml.待凝后 置饱和湿度,5c培养箱内37C培养7 d.低倍镜下计数集落数. 12.2MTT比色法j曼I定骨髓细胞DNA合 成在1ml培养体系中含RPMI1640培 养液0.55ml,马血清0.3m1.小鼠肌条件培 养液0.1ml,小鼠骨髓有核细胞悬液0.05ml (内含1×10个有校细胞)及不同浓度的 2O9 . 吖/ 中国生化药物杂志Clune~eJouraalofBiochemicalpl~rmaceutics1996年第l7卷第5 期 BGF,对照组只加生理盐水.混合后在96孔 板上按每孔lo0加入,在饱和湿度,5 CO孵箱内培养72h,离心,去上清,加MTT 溶液50,振荡Lm,于培养箱内反应2h, 离心后去上清液,每孔加入二甲亚砜l20l, 振荡30s.在酶标仪570nlTI处读OD值. 1.2.3统计处理所有结果的显着性差异 均采用成组资料z检验进行处理 2结果 2.1BGF对1鼠骨髓细胞CFU,GM增殖的 刺激作用 EGF在浓度为l0,l000pg/ml时对小 鼠骨髓细胞CFU—GM增殖有刺激作用,集落 形成效比对照组增多,经统计学处理有显着 性差异(P<0.O1). I 邑I I ? ? :丑————,.m卸和 F) s2…4o 瑁IBOF对小曩骨髓细胞CFU-GM增殖时髟响 2.2BGF对1鼠骨髓蛔跑DNA合成群响 用MTT法测定各实验组及对照组小鼠 骨髓细胞线粒体内氧化酶活性以OD值表 示,结果发现实验组在加入一定量BGF(终 浓度为20~g/m1)时.其OD值明显高于对照 裘jBGF对小鼠BMC增殖的影响(i士--l2) 一 2】0 组,OD值与BGF浓度呈正相关.证明BGF 可以提高小鼠骨髓有核细胞内线粒体氧化酶 活性,促进其增殖分化.其OD值的变化与 CFU-GM形成的变化相一致(表1). 3讨论 血细胞发生是多功能造血干细胞在特定 造血微环境和一些特定造血生长因子作用下 增殖分化为各种成熟血细胞的过程.粒细胞 和单核巨噬细胞起源于粒单系祖细胞(CFU. GM),CFU—GM膜表面有对粒采集落刺激因 子(GM—CSF)等发生反应的受体.GM—CSF是 粒系统增殖的生理性调控因子,它能使Q期 的CFU—GM进入S期,并能提高集落产率. 体外培养加入BGF能使CFU—GM增殖,说明 BGF中含有CSF样活性物质. 用MTT法间接测定细胞增殖水平是因 为细胞内能量代谢水平与DNA合成水平相 平行,MTT进入细胞后作为反应底物,在细 胞内线粒体氧化酶作用下被氧化成蓝色的甲 膳.沉积于细胞内或周围,用酶标仪直接测定 各孔的OD值.即甲膳的含量.由此判断细胞 内线粒体氧化酶活性,间接反映细胞增殖水 平.体外培养小鼠骨髓细胞时加入BGF,对 CFU—GM增殖有较高的刺激活性.其作用机 理可能是促进细胞内DNA合成.所以,用 MTT法测得的OD值的变化与CFU—GM形 成的变化是一致的. 参考文献 1葛忠良.应甩肌浸液培养小鼠骨髓巨嘘细晤的研究. 军事压学科学腕院刊.1984.2l】87 2莉秀珍主编.造血细胞培养技术手册.北京t北京出 腹牡,1993{l】e,133 3慷掇云主缩.药理实验方挂学.北京:^民卫生出版 社.$994t1221,]222