小鼠胚胎成纤维细胞培养实验[技巧]
0234091班 81人 灾害毒理学实验
实验一 小鼠胚胎成纤维细胞培养实验 一(实验目的
明确细胞培养室的建设与日常管理规定,了解细胞培养实验中常用的仪器设备的使用方法、
和保养方法。
二(实验器材与试剂
1. 主要仪器
高压蒸汽灭菌器;超净台;电热干燥箱;自动双重纯水蒸馏器;CO2培养箱;电热恒温培养箱;液氮罐;低温冰箱;超低温冰箱;倒置显微镜(Olympus,Japan); 100ml的玻璃
每孔直径为3.5cm);Eppendroff管;1ml,2ml,5ml的玻璃滴培养瓶;6孔培养板(COSTAR,
管各30支;5ml冻存管;10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿;解剖器械;离心机;漏斗和量筒;培养皿;酒精灯等。
2.主要试剂及配制
? MEF(mouse embryo fibroblast,小鼠胚胎成纤维细胞)培养液
?低糖DMEM母液
用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水;
将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中,同时轻轻搅拌,并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。
每升培养基中添加3.7gNaHCO3。
搅拌直至完全溶解。
用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3,调好PH后,将容器密封(在该实验中用1NHCl调PH至7.3)。
立即用0.22um的滤器过滤除菌,装入高压过的盐水瓶中, 4?保存(1个月内用完)。
?MEF培养液
取100ml上述配好的低糖DMEM液体,加入10000IU青霉素钠(6.25mg)和10mg链霉素,溶解后再次调节PH至7.3,经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中,再添加10ml分装好的新生牛血清(Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56?,30min灭活过),4?保存至使用。
PBS缓冲溶液
? PPS------含0.05%吐温,20的pH7.4的磷酸盐缓冲液的配置 在500ml超纯水中依次溶入
NaCl 4.0g
KCl 0.1g
Na2HPO4.12HO2 1.445g
KH2PO4 0.1g
于121?高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中,再放入4?冰箱中保存备用。
? 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液的配置
在100ml超纯水中分别溶解
胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g
EDTA 0.02g
NaCl 0.7g
NaHPO.12HO 0.024g 242
KHPO 0.024g 24
KCl 0.037g
Tris 0.3g
D-葡萄糖 0.1g
酚红 1mg
于4?过夜,使之充分溶解,用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌,在–10,30?下冻存备用。
?0.1%的明胶水溶液
称明胶0.1g (Sigma, G—9391)溶于100ml超纯水中,先加热溶解,再分装入20ml的血清瓶中于121?高压灭菌45min,于4?保存。
? 10ug/ml的丝裂霉素C工作液----刺激成纤维细胞生长的物质 三( 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液
在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS,用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。
注:此步应在胶卷暗盒内操作,然后于4?避光保存。 ? 10ug/ml的丝裂霉素C工作液
在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液,并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制,并在37?的CO2培养箱中预温30min.。
? 冻存液
取2支1.5ml Eppendroff管,每管均加入0.9ml DMEM(低糖型)培养液和0.1ml二甲基亚砜(DMSO,AR纯,中国医药集团上海化学试剂公司),置40C冰箱中预冷60min。
3.动物
性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠,领自福建医科大学实验动物中心。
三(实验步骤
? 获取小鼠胚胎
将8周龄的?鼠和12周龄的?鼠按1:1比例合笼。
次日晨10:00前观察?鼠阴道口,有乳白色或蛋黄色胶冻状物(阴道栓)即定为怀孕0.5天。
实验时断颈处死孕13.5天的母鼠,置于蜡盘上。
75,酒精消毒后,用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤,并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。
用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔,暴露出子宫。
用眼科弯镊夹住一侧子宫,分离子宫系膜,眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈,将整个子宫分离下来(注意勿使子宫滑落到腹腔外,避免污染)。
将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。
在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中,洗涤数次。
将子宫移入另一盛有PBS的平皿中,用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫,取出带有胎膜的胎鼠,并用两把眼科镊子剔除胎膜,取出胎鼠(一般有12只)。
将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中,用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏,得鼠胚躯干。
将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中,用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
? 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养(组织块培养法)
将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内(每6个鼠胚躯干装1瓶),用眼科直剪充分剪碎,剪成约1mm3以下的碎块(需剪约200下)。
用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS,混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。
室温下静置5min,用刻度吸管吸去上清液,留下鼠胚组织碎块。
向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液,轻轻吹吸30秒(可见组织块变得较为粘稠)。
再加入1 mlMEF培养液终止消化,室温下静置5min。
吸去上清液,留下鼠胚组织碎块沉淀。
每个离心管内加入5mlMEF培养液悬浮鼠胚组织块,并接种到100ml的螺口的培养瓶中(接种时应用滴管将组织块混匀)。
做好标记(如培养日期,细胞名称,编号),将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37?,5,CO2,100,RH的培养箱中培养。
培养的头两天不要晃动培养瓶,第三天可以观察,可见组织碎块附着于培养瓶底,周围细胞呈放射状生长,此时有多种细胞类型,有的是呈梭形的成纤维细胞,有的是呈圆形的上皮细胞。如果细胞已全部长满则可消化传代,如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。
? 小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养
用滴管吸弃培养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。
每瓶用滴管加入约3ml的PBS,轻轻前后晃动培养瓶,洗涤细胞一遍,吸弃PBS。
每瓶用滴管加入约2ml的0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液,能盖住培养瓶底,室温下静置作用30秒,吸弃消化液。
在倒置镜下观察,当细胞变圆时即可加入4—5mll MEF培养液终止消化,并用滴管吸培养液用力吹打整个瓶底(约30下)。
将培养物全部吸置尖底离心管内,静置5min,将上层细胞悬液吸置另一离心管内。
1000r/min(80-1离心机为80g)离心5min,吸弃上清液。
每瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块,并分装至3个100ml的培养瓶中。
每个培养瓶再补加4ml的MEF培养液,并吹打混匀细胞(吹打时勿产生气泡)。
将刚消化传代的细胞在倒置镜下观察,可见细胞呈大小不一的圆形。
将装有消化后细胞的培养瓶放入37?,5,CO2,100,RH的培养箱中培养。
约2天后,细胞可贴壁长满,继续按1:3消化传代(操作同前,省略步骤5中的静置和换管)。
饲养层制备
明胶预包被培养板:取1个6孔培养板(COSTAR ,每孔直径为3.5cm),先紫外照射30min,每孔用5ml刻度滴管加入3ml的 0.1%明胶水溶液,使其能覆盖孔的底部,室温下静置2h以上,用前吸弃明胶水溶液,并用2ml的PBS洗涤一遍。 丝裂霉素C作用2小时:将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的培养液吸弃,每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液,再放入37?、5%CO2、RH100%的培养箱中培养2h。
2小时后,吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液,用预温的PBS洗涤细胞5次,每次3ml(加样时滴管靠在培养瓶的上壁或侧壁,勿直接冲冲击底壁的细胞)。 消化:每瓶中加入2ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化液,室温下作用10秒,立即吸弃消化液,加入3mlMEF培养液终止消化,并吹打壁底细胞(应注意逐瓶操作,避免消化时间过长而使细胞丢失过多)。
离心:将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底离心管内,1000r/min离 心5min,弃上清,得细胞沉淀块,往一个离心管的沉淀块内加入3ml的MEF培养液混悬细胞,再吸至另一离心管中混悬沉淀块。
计数并调整密度:吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度,然后将细胞悬液吸至一培养瓶或血清瓶中,补加适量的MEF培养液调整细胞密度为3×105个/ml。
接种:每孔加3 ml密度为3×105个/ml的细胞悬液(因为培养孔的直径为3.5cm,故其底面积S=πr2=3.14×1.752=9.42 cm2,根据接种的细胞数为1×105个/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3×105个/ml的细胞悬液)。
培养:将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37?、5%CO2、RH(相对湿度)100%的培养箱中培养。
饲养层细胞的冻存和复苏实验
冻存
细胞:镜检,将处于对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞用于冻存实验。弃旧培养液,后以PBS或新鲜培养液漂洗细胞一次。
消化:常规0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA消化制备单细胞悬液。 离心重悬:80g离心10min,弃上清,以冻存液悬浮细胞,分装到冻存管中。
冻存:细胞逐级降温冷冻:4 ?冰箱40min -20? 冰箱40min -80? 冰箱保存备用。
复苏培养
冻融:从低温冰箱中取出冻存细胞,置于370C水浴锅内,不时振摇冻存管,使细胞快速融化。
洗涤:转移冻存管内细胞于离心管中,80g离心5min,弃上清,沉淀用含新鲜DMEM(低糖型)重新悬浮,制备单细胞悬液。
接种:接种细胞于培养瓶中,置370C、CO2培养箱内进行过夜培养,12,24小时后,更换培养基,按照细胞的生长状况进行相应处理。
四(实验准备
? 玻璃器皿的洗涤方法
?自来水冲洗 ? 烘箱烘干,5%稀盐酸浸泡12h; ?洗刷、烘干(自来水---洗涤剂---自来水); ? 泡酸、清洗(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000 ml混合配置的酸洗液浸泡12h;捞出后自来水冲洗15次---蒸馏水冲洗3,5次---二次蒸馏水冲洗3次); ?烘干、包装; ? 高压蒸汽灭菌器消毒----备用。
? 无菌室灭菌
紫外线灯照射灭菌
? 实验人员无菌准备
肥皂洗手----穿好隔离衣、戴好帽子口罩、拖鞋----75%酒精棉球擦拭双手。
四(实验结果与
五(
写实验报告
实验指导老师 刘章现 屈二军