母婴人乳头状瘤病毒亚临床感染的检测

母婴人乳头状瘤病毒亚临床感染的检测 中华妇产科杂志 2000年第9期第35卷 论著 作者:彭萍 翁霞云 谷志远 李琦 单位:彭萍(510010 广州军区广州总医院妇产科);翁霞云(解放军总医院妇产科);谷志 远(解放军总医院妇产科);李琦(解放军总医院妇产科) 关键词: 乳头状瘤病毒，人;乳多空病毒感染;肿瘤病毒感染;聚合酶链反应 【摘要】 目的 探讨孕期、产褥期妇女及其新生儿的人乳头状瘤病毒(HPV)亚临床 感染状况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术检测103例孕产妇(观察组)宫颈及阴道 分泌物、外周静脉血标本中HPV-6、11、16、18型DNA，其中孕早期30例、孕中期42例、 孕晚期31例，孕晚期妇女监测到产褥期;以同期门诊要求带宫内节育器妇女30例为对照组， 同时检测孕晚期妇女分娩的新生儿咽部分泌物标本。结果 孕早、中、晚期、产褥期、对照 组妇女的宫颈及阴道分泌物HPV总阳性率分别为:16.7%、28.6% 、74.2%、25.8%、26.7%; 外周静脉血HPV总阳性率分别为23.3%、26.2%、58.1%、22.6%、20.0%;各组均以HPV-16/18 型感染为主，其次为HPV-6/11+16/18型，而无单独的HPV-6/11型阳性。动态检测31例妇 女在孕晚期、分娩前、产后6周宫颈及阴道分泌物中HPV 阳性例数分别为17例、21例、8 例，其中有6例在孕期的检测中有波动;外周静脉血的HPV阳性例数分别为14例、13例、 7例，其中有7例在孕期的检测中有波动;动态检测31例新生儿在出生时、出生后48,72 h、 出生后6周咽部分泌物中HPV阳性例数分别为13例、6例、1例。结论 整个孕期以孕晚 期HPV感染明显，而孕早期、孕中期、产褥期与非孕期的HPV感染率差异无显著性;部分 HPV感染的孕妇，产后可自然转为阴性，且孕期HPV达有一自然波动;新生儿随生后时 间的延长，咽部HPV感染率呈下降趋势。 Detection of the Asymptomatic Infection by Human Papillomavirus in Pregnant Women and Neonates PENG Ping (Department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital, Guangzhou Military Area, Guangzhou 510010, China) WENG Xiayun, GU Zhiyuan, et al. 【Abstract】 Objective To investigate the state of human papillomavirus (HPV) infection in similar average-aged pregnant women of different gestational periods, in the puerperium and neonates. Methods Polymerase chain reaction (PCR) assay was employed to detect HPV-6, 11, 16 and 18 DNA in 30 pregnant women in the first trimester, 42 in the second and 31 in the third (who were followed up to their puerperium), and 30 non-pregnant women asking for intrauterine device in our out-patient clinic were taken as controls. Average age in the four groups showed no significant difference (P,0.05). Samples from cervical, vaginal exfoliated cells, maternal peripheral blood and nasopharyngeal secretion of the newborns were examined respectively. Results (1) In the first trimester, HPV-DNA was detected in the cervical, vaginal exfoliated cells of 5 cases and in the maternal peripheral blood of 7 cases. (2) In the second trimester, HPV-DNA was detected in the cervical, vaginal exfoliated cells of 12 cases and in the maternal peripheral blood of 11 cases. (3) In the third trimester, HPV-DNA was detected in the cervical, vaginal exfoliated cells of 23 cases and in the maternal peripheral blood of 18 cases. (4) In the puerperium, HPV-DNA was detected in samples of cervical, vaginal exfoliated cells of 8 cases and maternal peripheral blood of 7 cases. (5) In the control group, HPV-DNA was detected in the cervical, vaginal exfoliated cells of 8 cases and in the maternal peripheral blood of 6 cases. (6) Consecutive examinations were carried out in 31 pregnant women from the third trimester, Http://Www.Yaokuo.Com through labor to 6 weeks of postpartum. HPV-DNA was positive in the cervical, vaginal samples of 17, 21 and 8 cases, respectively, according to the perinatal periods, and in the maternal peripheral blood of 14, 13 and 7 cases, respectively. The result through the above gestational stages was fluctuated in the cervical, vaginal samples of 6 cases and in the maternal peripheral blood of 7 cases. (7) Successive examinations in infants at time of birth, 48,72 h and 6 weeks after birth showed positive HPV-DNA in the nasopharyngeal secretion of 13, 6 cases and 1 case with respect to the examining periods. (8) The positive cases were mainly infected by HPV-16, 18. Conclusions (1) Infective rate of HPV is statistically significant in the third trimester, but no significant difference exists among the first trimester, the second trimester, the puerperium or the non-pregnancies. (2) Examining consecutively, the HPV positive rate is found to be decreased after delivery, the positive expression of HPV during the gestational periods exhibited fluctuation. (3) Infective rate of HPV in the neonatal nasopharyngeal specimens tends to decrease with time after delivery. 【Key words】 Papillomavirus, human; Papovaviridae infections; Tumor virus infections; Polymerase chain reaction 人乳头状瘤病毒(human papillomavirus， HPV)是双链DNA病毒，目前已发现70多型， 在生殖道上皮的病灶中至少已发现13型，其中最常见的是HPV-6、11、16、18型。近年来， 育龄妇女生殖道 HPV感染率逐年上升，尤其是亚临床感染明显;而妊娠期妇女HPV感染 可通过母婴传播，引起婴幼儿肛门及生殖器部位的先天性尖锐湿疣、结膜乳头状瘤及青少年 喉乳头状瘤病(juvenile laryngeal papillomatosis, JLP)等相关性疾病。我们采用聚合酶链反应 (PCR)技术，对平均年龄相近的不同孕期、产褥期及非孕期妇女共133例的宫颈及阴道分泌 物、外周静脉血进行HPV-6、11、16、18型检测，并动态观察孕晚期、分娩前、产褥期妇 女的HPV感染情况及孕晚期孕妇分娩的新生儿在出生时、出生后48,72 h、出生后6周咽 部分泌物的HPV感染情况，旨在对 HPV的母婴亚临床感染状况进行直接、动态的观察， 现将结果报道如下。 资料与方法 一、研究对象 1997年5月,1997年11月期间，按来院就诊日期随机选取103例孕妇(观察组)，其中 孕早期30例(孕6,12周;平均年龄26.4?5.4岁)、孕中期42例(孕13,28周;平均年 龄26.0?5.2岁)、孕晚期31例(孕28,41周;平均年龄27.4?4.6岁;孕晚期与产褥期为 同一组病人)、非孕妇女30例为对照组(有过1次以上妊娠史，要求带宫内节育器者;平均 年龄28.3?4.2岁)，无内、外科疾病，无梅毒、淋病、尖锐湿疣病史，无外阴瘙痒，白带常 规检查无异常。 二、方法 1.标本采集: (1)5 ml生理盐水冲洗宫颈外口及阴道穹窿，留取冲洗液，孕晚期妇女分 别于孕28,32周、分娩前(破膜前)及产后6周各取1次;出生时吸取新生儿咽部分泌物， 出生后 48,72 h及出生后 6周均于停喂奶4,6 h后用消毒棉签擦拭咽部，于5 ml生理盐 水中反复涮洗;上述两种标本于4?下离心(1 200 r/min, 10 min)，收取沉淀细胞，混悬于1 ml 磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol, pH 7.2)中。(2)抽取观察组及对照组妇女的外周静脉血1, 2 ml，肝素抗凝，孕晚期妇女分别于孕28,32周、分娩前及产后6周各取1次。以上标本 均置-20?冰箱保存。 2. DNA提取:(1)宫颈阴道冲洗液、新生儿咽部抽吸物用 50,100 μl裂解液(蛋白酶 K终浓度为100 μg/ml)混悬细胞沉淀，于 55?水浴消化1 h;95?处理10 min，4?下离 心(11 000 r/min, 5 min)，取上清液作为PCR扩增的。(2)全血标本:先反复用TE液除 Http://Www.Yaokuo.Com 去红细胞成分，其余步骤同(1)。 3. PCR扩增:引物、扩增程序、扩增产物见参考文献,1,。每次扩增均同时设阳性和阴性对照，阳性对照为解放军总医院分子生物实验室提取的HPV-6、11、16、18型质粒DNA，阴性对照为蒸馏水。经2%琼脂糖凝胶电泳判定结果。 三、统计学处理 应用SAS软件，计数资料比较采用χ2 检验;如频数有特别小值时，两组资料采用Fisher精确检验;多组资料采用拟然比χ2检验。 结果 一、妊娠妇女HPV亚临床感染情况 不同孕期及产褥期妇女宫颈及阴道分泌物、外周静脉血的HPV感染率比较，差异均有极显著性(P均,0.01)，见表1;以孕晚期宫颈及阴道分泌物、外周静脉血的HPV感染率最高，其与孕早期、孕中期、产褥期及对照组分别比较，差异均有极显著性(P,0.01);而孕早期、孕中期、产褥期及对照组分别比较，差异均无显著性(P,0.05)。所检测的各组标本中，主要为HPV16/18型阳性，约为HPV6/11+16/18型阳性的3,5倍。 动态检测31例孕妇在孕晚期(28,32周)、分娩前(37,41周)及产后6周的HPV感染情况，发现在宫颈及阴道分泌物中，不同时期共有23例HPV阳性，分娩前HPV感染率(67.7%)较孕晚期(54.8%)稍高，但差异无显著性(P,0.05 )，其中经重复实验，排除实验误差，有5例在孕晚期为阴性，而在分娩前转为阳性，有1例在孕晚期为阳性，而在分娩前转为阴性，共占总数的19.4%;在外周静脉血检测中，不同时期共有18例HPV阳性，分娩前HPV感染率(41.9%)较孕晚期(45.2%)稍低，但差异也无显著性(P,0.05)，其中同样经重复实验，有3例在孕晚期为阴性，而在分娩前转为阳性，有4例在孕晚期为阳性，而在分娩前转为阴性，共占总数的22.6%。而产褥期的宫颈及阴道分泌物、外周静脉血的HPV感染率(25.8%;22.6%)与孕晚期(54.8%;45.2%)及分娩前(67.7%;41.9%)相比，均有明显下降，其中宫颈及阴道分泌物HPV感染率的差异有显著性(P,0.05)，但外周静脉血HPV感染率的差异无显著性(P,0.05)。另在宫颈及阴道分泌物、外周静脉血的检测中，各有1例仅在产褥期阳性，而在孕晚期及分娩前均为阴性。 表1 两组妇女宫颈及阴道分泌物、外周静脉血HPV感染情况 组别例数宫颈及阴道分泌物外周静脉血HPV16/18型(+)HPV6/11+16/18型(+)HPV16/18型(+)HPV6/11+16/18型(+)例数百分率(%)例数百分率(%)例数百分率(%)例数百分率(%)观察组 孕早期30 4 13.31 3.3620.0 1 3.3 孕中期42 9 21.4 3 7.1716.7 4 9.5 孕晚期31 1858.1516.1 1238.7619.4 产褥期 316 19.4 2 6.5 412.939.7对照组30 7 23.31 3.3 516.7 1 3.3 二、新生儿HPV亚临床感染情况 动态观察31例新生儿出生时、出生后48,72 h及出生后 6周的咽部分泌物HPV感染情况，出生时HPV阳性率为41.9%(13/31)，出生后48,72 h降低为19.4%(6/31)，出生后6周仅为3.2%(1/31)，经总χ2检验，差异有极显著性(P,0.01)。 讨论 一、妊娠妇女HPV亚临床感染的特点 至今为止，孕期HPV的确切感染率不详，多数研究表明，孕期的HPV亚临床感染明显，且以HPV-16、18型感染为主，孕期高于非孕期，孕晚期高于孕早期，并且产后有一定的自然阴转率,2-6,。少数研究结果表明，孕期与非孕期、产后及不同孕期的HPV感染率并无差别,7，8,，甚至非孕期反而比孕期高,9,，且认为年龄是一个主要影响因素，,30岁者的HPV感染率明显高于,30岁组者,8，9,。 本研究选取的观察组及对照组的平均年龄相近，检测结果表明，随着孕期的增长，宫颈及阴道分泌物、外周静脉血的HPV感染率确呈升高趋势，孕晚期明显高于孕早期、孕中期、 Http://Www.Yaokuo.Com 产褥期及对照组，并且HPV-16/18型感染占优势;但孕早、中期与产褥期、非孕期的HPV 感染率相近。本研究结果显示:孕晚期及分娩前的HPV感染率相近，但产褥期的HPV感染 率较孕晚期及分娩前有明显下降，有35.5%,48.4%的自然阴转率，近似非孕期的感染率; 且孕晚期到分娩前HPV的检出有19.4%,22.6%的波动;这与国外有关文献的结果一致,2， 3,。 孕期HPV感染率升高的原因，多认为与孕期免疫功能尤其是细胞免疫功能受抑制、 激素水平升高以及孕期生殖道血流丰富密切相关。据Sridama等,10,报道，孕早、中、晚 期、产后0,2个月的辅助性T细胞与抑制性T细胞之比分别为1.21?1、1.48?1、0.93?1、 1.42?1，而非孕期为1.89?1，可见与非孕期相比，孕晚期下降明显，而孕早期、孕中期及 产褥期无明显下降。另外，妊娠后期激素水平持续升高，而性激素及糖皮质激素能增强HPV 基因非编码区的转录活性,11,。至于孕晚期到分娩前HPV检出率有波动，Pao等,12,认 为与激素水平的波动有关。这提示我们，应慎重对待单次HPV的检出结果，对可疑者应重 复检查。 二、新生儿HPV亚临床感染的特点 孕期HPV感染的危害主要是引起JLP，其具有多发、极易复发、需反复手术、难根治 的特点，对婴幼儿造成极大的危害。近年来，多数学者在出生时立即检测新生儿咽部分泌物， 发现其感染率较高，为33.3%,73.0%，母婴传播率也高达44.0%,87.5%,4，6， 13-15,。 还有学者动态观察了新生儿出生后最长达11.6年时间的HPV感染情况，发现HPV感染率 不但高而且可持续长时间,4，13，15, 。Smith等,16,在出生后24,72 h检测新生儿咽 部分泌物，发现感染率极低，仅为1.0%(2/20)，母婴传播率仅为8%(2/25);Watts等,17, 动态检测372例新生儿在出生时、出生后6周、 6月、1岁、2岁及3岁时鼻咽分泌物标本 中，竟无1例阳性，分析其原因，这些学者认为，此结果与检测时的新生儿出生后时间长短 相关，并提出多数方法检测出的出生时新生儿的高感染率，确有大部分只是暂时的污染，而 不是真正的感染,16，17,。 综上所述，孕晚期HPV感染率及产时母婴垂直传播率均较高，但临床上JLP 的发病率 甚低，探求其原因:(1) JLP主要与HPV-6、11型的感染有关，而如大多数文献报道及本研 究结果所示，孕期以HPV-16、18型感染为主;(2) 新生儿出生时咽部的高感染率有部分是 暂时污染而不是持续的感染;(3) 胎婴儿有可能从受感染的母亲得到保护性抗体,18,。 参考文献 1，郑鹏生,崔满生,李守柔.应用多重聚合酶链反应技术检测人类乳头瘤病毒DNA(中华 妇产科杂志, 1993, 28: 266-267. 2，Rando RF, Lindhein S, Hasty L, et al. Increased frequency of detection of human papillomavirus deoxyribonucleic acid in exfoliated cervical cells during pregnancy. Am J Obstet Gynecol,1989,161: 50-55. 3，Czegledy J, Gergely L，Endrodi I. Detection of human papillomavirus deoxyribonucleic acid by filter in situ hybrdization during pregnancy. J Med Virol, 1989,28:250-254. 4，Cason J,Kaye JN, Jewers RJ, et al. Perinatal infection and persistence of human papillo-mavirus types 16 and 18 in infants. J Med Virol,1995,47:209-218. 5，File KH,Katz BP,Roush J,et al.Cancer-associated human papillomavirus types are selectively increased in the cervix of women in the first trimester of pregnancy. Am J Obstet Gynecol,1996,174: 1487-1493. 6，钱止维,张景华,吴广芹,等.子宫颈人乳头状瘤病毒16型感染的母儿传播. 中华妇产科 杂志, 1993,28:242-243. 7，Kemp EA,Hakenwerth AM,Laurent SI,et al. Human papillomvirus prevalence in Http://Www.Yaokuo.Com pregnancy. Obstet Gynecol,1992, 79: 649-656. 8，de Roda Husman AM, Walboomers JMM, Hopman E, et al. HPV prevalence in cytomorphologically normal cervical scrapes of pregnant women as determined by PCR: the age-related pattern. J Med Virol,1995,46: 97-102. 9，Tenti P，Zappatore R，Migliora P，et al. Latent human papillomavirus infection in pregnant women at term: a case-control study. J Infect Dis,1997,176: 277-280. 10，Sridama V,Pacini F,Yang SL, et al. Decreased levels of helper T cells: a possible cause of immunodeficiency in pregnancy. N Engl J Med,1982,307:352-356. 11，Mittal R,Tsutsumi K,Pater A, et al. Human papillomavirus type 16 expressionin cervical keratinocytes: role of progesterone and glucocorticoid hormones. Obstet Gynecol, 1993,81: 5-12. 12，Pao CC,Lin CY,Maa JS,et al. Detection of human papillomavirus in cervical cells using polymerase chain rection. J Infect Dis,1990,161:113-115. 13，Pakarian F,Kaye J,Cason J, et al. Cancer associated human papillomavirus: perinatal transmission and persistence. Br J Obstet Gynecol,1994 Jun, 101: 514-517. 14，Puranen MH,Yliskoski MH,Saarikoski SV, et al. Exposure of an infant to cer vical human papillomavirus infection of the mother is common. Am J Obstet Gynecol,1997,176: 1039-1045. 15，Puranen M,Syrijanen S,Syrijanen K,et al.Vertical transmission of human papillomavirus from infected mothers to their newborn babies and persistence of the virus in childhood. Am J Obstet Gynecol,1996,174: 694-699. 16，Smith EM,Johnson SR,Cripe T, et al. Perinatal transmission and maternal risks of human papillomavirus infection. Cancer Detect Prev,1995,19: 196-205. 17，Watts DH,Koutsky LA,Holmes KK,et al. Low risk of perinatal transmission of human papillomavirus: results from a prospective cohort study. Am J Obstet Gynecol,1998, 178: 365-373. 18，Osborne NG,Adelson MD. Herpes simplex and human papillomavirus genital infections: controversy over obstetric management. Clin Obstet Gynecol,1990,33: 801-811. Http://Www.Yaokuo.Com