细胞凋亡检测

细胞凋亡检测 Hoechst 法: 原理:Hoechst是与DNA特异性结合的活性染料～为膜通透性荧光染料～主要结合在DNA的A-T碱基区～紫外光激发时发明亮的蓝色荧光。正常细胞Hoechst着色形态呈圆形～淡蓝色。早期凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色边集～晚期凋亡细胞核呈分叶、碎片状～并产生凋亡小体。 步骤: 1(在24孔板中预先加入盖玻片 2(细胞消化后加入24孔板中～培养24 h后加入药物～继续放入培养箱培养。 3(药物作用完成后～取出24孔板～去掉培养基～用PBS清洗两次。 4( 加入固定液,甲醇:冰醋酸为3:1～现配,1 mL/孔～固定15 min～重复固定一次。 5( 吸掉固定液待其自然干燥～加入Hoechst,Hoechst储备液用PBS稀释～浓度为1 %～现配～搅拌半小时后使用,～避光染色45 min。 6( 吸掉染液用PBS洗三次～待其干燥～用荧光显微镜镜检～拍照。 TUNEL染色法:,CALBIOCHEM公司, 原理:细胞凋亡时～核酸内切酶被激活～染色质或DNA被切割～出现单链或双链缺口～产生与DNA断点相同的3’-OH末端～在一定缓冲液体系下TdT将结合有荧光素dUTP不需要标记到缺口3’-OH末端～发绿色荧光。一旦细胞发生凋亡～细胞染色体发生断裂～经TUNEL染色～细胞在荧光显微镜下观察～能看到绿色荧光。 步骤: 1(细胞消化后加入6孔板中～培养24 h后加入药物～继续放入培养箱培养。 2(药物作用完成后～取出6孔板～吸取细胞悬液～1500 rmp离心10 min～并用胰酶消化贴壁细胞～1500 rmp离心10 min～PBS清洗3次。 3( 按照TUNEL试剂盒要求操作～对细胞DNA进行染色～具体过程如下: 3.1加入固定液(4 %甲醛溶解在PBS中～pH 7.4,现配)～在室温固 定10min。 3.2 4?, 1000 rpm 离心5 min～弃甲醛/PBS。 3.3 加入80%乙醇～4?固定细胞,固定的细胞可保存2-6个月,。 3.4 1000 rpm 离心5 min～弃乙醇。加入200 µL TBS, 室温10, 15 min。1000 rpm 离心5 min～弃TBS。 3.5 用10mM Tris pH8 以1:100稀释2mg/ml 蛋白激酶K。200 µL 20 µg/ml 蛋白激酶K孵育细胞5 min(不要孵育过度)。1000 rpm 离心5 min～弃蛋白激酶K。 3.6 dHO稀释5×TdT 平衡缓冲液。100µL 1×TdT 平衡缓冲液2 室温下孵育细胞10,30min。1000 rpm 离心5 min～弃1× TdT 平衡缓冲液。 TM3.7 准备TdT 标记反应液:57µL Fluorescein-FragEL TdT标记 混合液+3µL TdT酶。37 ? 60µL TdT 标记反应液避光孵育 细胞1,1.5h。 3.8 TBS洗～细胞悬液涂片～专用Hoechst封片剂封片随机选 取3个视眼分别在荧光显微镜观察拍照～计数～根据 计算凋亡率(AR)。 AR,凋亡细胞数,荧光显微镜下所观察的绿色荧光细胞,/总细胞数,荧光显微镜下所观察的蓝色荧光细胞, 流式细胞仪测细胞凋亡,BD公司的Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒, 原理:PS是一种带负电荷的磷脂～正常主要存在于细胞膜的内面～在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破 2+坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca依赖的磷脂结合蛋白～具有易于结合到磷脂类如PS的特性～对PS有高度的亲和性。但PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的～也可发生在细胞坏死中。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性～坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光～而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此～在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上～左下象限显示活细胞～为,FITC-/PI-,,右上象限是晚期凋亡或坏死细胞～即坏死细胞～为,FITC+/PI+,,而右下象限为早期凋亡细胞～显现,FITC+/PI-,。 步骤: 1(细胞消化后加入6孔板中～培养24 h后加入药物～继续放入培养箱培养。 2(药物作用完成后～取出6孔板～吸取细胞悬液～1500 rmp离心10 min～并用胰酶消化贴壁细胞～1500 rmp离心10 min～冷PBS清洗3次。 3(具体方法参照Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒要求操作: 61(加入1× binding buffer～使其再悬浮～制成细胞浓度为1×10个/ml的悬浮液～加入5 µL的Annexin V-FITC 和5 µL PI～轻轻地混匀细胞～室温黑暗孵育15 min。 2(在每管中加入500 µL的1× binding buffer, 1 h内用流式细胞仪分析。 结果分析: 流式结果图左下象LL表示活细胞分布的区域～右下象LR表示早期凋亡细胞分布的区域～左上象UL坏死的细胞分布的区域,右上象UR表示晚期凋亡或坏死的细胞分布的区域。