RP-HPLC测定腺苷蛋氨酸注射用溶剂中赖氨酸的含量及有关物质

RP-HPLC测定腺苷蛋氨酸注射用溶剂中赖氨酸的含量及有关物质 RP-HPLC测定腺苷蛋氨酸注射用溶剂中赖 氨酸的含量及有关物质 RIP.HPLC测定腺苷蛋氨酸注射用溶剂中赖氨酸的含量及有关物质 赵鹏,王东凯卜,庄润,薛梅妍,王丽君,黎玲(1沈阳药科大学药学院,沈阳110016;2.沈阳沃森药物研究所,沈阳 110016) 摘要:目的建立测定腺苷蛋氨酸注射用溶剂中赖氨酸含量及有关物质的方法.方法 采用Di糊ns.1瑚(钻石)C18ODS柱(4.6 mmX250nlnl,5pan);流动相为甲醇.水.三乙胺(250:750:0.1),流速为0.8mL?min_.,紫 外波长为210nln,柱温为30?.结 果在本色谱务件下L.赖氨酸与辅料及溶剂峰分离度符合要求,在300,700rag?L内线性良好(r=0.9997).结论测定 方法简便,准确,灵敏度高,方法可靠,可作为质量控制方法. 关键词:赖氨酸;反相高效液相色谱法;含量测定;有关物质 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1001—2494(2006)13—1023—04 DeterminationofLysineandRelatedCompoundsbyRP-HPLC ZHA0Peng,WANGDong.kai,ZHUANGRun2,XUEMei.yan,WANGLi.ju.,LILing(1.Sc hoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,Ch/na;2.ShenyangWatsonPhar maceuticalInstitute,110016,Ch/aa) ABSrRACr:OBJECTIVEToestablishaHPLEmethodforthedeterminationofLysineandre latedcompounds.?TH0 separationwasperformedwithaDiamons.dC180lDScolumon(4.6mln× 250mm,5tnn)at30oC,andthemobilephaseconsistedof methano1.water-triethylamine(250:750:0.1)attheflowrateof0.8mL?min,.UVdetectionwavelengthwas,at210nrn.RJI腮Agood linearitywasobtainedover山erangeof300,700哗?L(r=0.9997).C0NCII 『s10NThismethodissimple,accurate,sensitiveand applicableforthequalitycontrolofthispreparation. KEY?r0RDS:Lysine;RP.瑚,;determination;relatedcompounds 腺苷蛋氨酸是存在于组织和体液中的一种生理 活性因子,主要用于治疗肝硬化前和肝硬化所致的 肝内胆汁淤积及妊娠期肝内胆汁淤积等.目前已有 进口的冻干制剂,国内尚无生产厂家.赖氨酸是人 体必须的八种氨基酸之一,能促进人体发育,提高免 疫功能,并有提高中枢神经组织的功能,临床上多用 于由于赖氨酸缺乏所致发育不良,食欲不振,老年痴 呆,记忆力减退等.本品是以盐酸赖氨酸为主药的 灭菌溶液,作为腺苷蛋氨酸的注射用溶剂,每支5 mL,标示量为每支417.5IIlg(以.赖氨酸计),是参 考中国药品生物制品检定所复核的意大利进口的注 射用腺苷蛋氨酸(思美泰)中注射用溶剂的标准所独 立研制的.国内HPI_E测定赖氨酸含量,一般是将 赖氨酸进行衍生化反应后再进行HPLC测定.本实 验用m,Lc直接测定赖氨酸含量,具体研究报道如 下. 1仪器与试药 岛津LC一10A高效液相色谱仪(岛津LC一10A 泵,SPD一10A紫外检测器,7725i进样阀[岛津仪器 (苏州)有限公司];微量进样器(上海安亭微量进样 器厂);L-赖氨酸对照品(上海康达氨基酸厂);赖氨 酸盐酸盐(天津市化学试剂公司);色谱柱:Diamon. silTM(钻石)C18ODS柱(4.6laln×250ialn,5/nn);pH 计(PHS一2C数显型酸度计,上海宇隆仪器有限公 司). 2方法与结果 2.1溶液的配制 对照品溶液的制备:精密称取赖氨酸对照品 25.0mg,置50mL量瓶中,用水溶解并稀释至刻度, 摇匀,即得. 供试品溶液的制备:取本品5瓶,混匀,精密量 取3mL置50mL量瓶中,用水溶解并稀释至刻度, 摇匀,用移液管精密量取此溶液1瑚L置10瑚L量瓶 中,摇匀,即得. 2.2测定波长的选择 取"2.1"项下的对照品溶液,以蒸馏水作空白, 在200—400nln波长内进行紫外扫描,取"2.1"项下 的供试品溶液,以蒸馏水作空白,用DAD检测器扫 作者简介:赵鹏,男,硕士研究生通讯作者:王东凯,男,副教授,硕士研究生导师 Tel:(024)23986127E-mail:wangdksy@126.c0ln 中国药学杂志2006年7月第41卷第13期nP—ha—rm,,_JI__?1023? 描. 结果明,,,赖氨酸在240nln波长以后基本没 有吸收,在接近200nm处,有机溶剂存在自身吸收 干扰测定,在接近240nln波长处吸光度低,测定时 峰面积小,影响测定的准确性.二极管阵列检测器 扫描图谱表明,在赖氨酸保留时间,保留时间前后 0.1min的扫描图谱一致,说明主峰为单一成分,有 关物质保留时间约为12.6min,此时间的扫描图谱 在210nln左右有最大吸收,说明有关物质的最大吸 收波长在210nln左右,故确定210nnl为含量及有 关物质的测定波长. 2.3色谱条件 色谱柱:DiamonsilTM(钻石)C】8ODS柱(4.6mlTlX 250lnln,5);流动相:甲醇.水.三乙胺(250:750: 0.1);柱温30oC;紫外检测波长210nm;进样量:20 ,用外标法进行定量,色谱图见图1. ——lr——一 '..1..1'—.f——'r...r..1..一 024681012l4 ,/mm — r'————一 团 t/min 图1HPLC图谱 A一供试品溶液;B一对照品溶液;C一水;D—NaCI溶液;1一赖氨酸 Fig1HPLCchromatograms A—samplesolution~B—standa/dsolution;C—water;D—NaC1solution;1一lysiee 2.4耐用性实验 根据《中国药典>>2005年版药品质量标准 方法验证指导原则,考察了系统的耐用性,使用本研 究室现有的仪器及设备,照已确定的色谱条件进行 实验,结果显示在测定条件(流动相比例,色谱柱,柱 温及流速)有较小的变动时,样品测定结果不受影 响.理论板数按赖氨酸计算为196. 2.5专属性实验 分别精密称取4份赖氨酸盐酸盐,每份25, 其中两份分别置于50mL量瓶中,一份加1tool?L 盐酸溶液1mL,置室温避光处放置10min,第2份加 40%氢氧化钠溶液1mL,加水溶解并稀释至刻度, 摇匀,于水浴中煮沸30min,两份溶液分别调pH至 7.0左右,作为本品的酸中降解和碱中降解的供试 品溶液.另两份中一份于(4500?500)lx光照之下 放置1d,另一份直火加热10min,分别配制成一定 浓度的溶液.分别精密量取上述4份供试品溶液各 20,注入液相色谱仪,记录色谱图.结果表明,本 品经酸,碱,光照处理后均无明显降解,在直火加热 熔融状态下极易降解且降解物明显,其主要杂质峰 均能与盐酸赖氨酸主峰达到有效分离,表明该方法 . 1024.ChinPharmJ,2006July,Vo1.41No.13 的专属性好. 2.6线性关系考察 精密称取,,赖氨酸对照品50.1mg置10mL量 瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,再用移液管精 密量取此溶液0.6,0.8,1.0,1.2,1.4mL分别置1O l1lL量瓶中,使成约为0.3,0.4,0.5,0.6,0.7g?L的 溶液,精密吸取此5种溶液各20分别注入液相 色谱仪,并记录色谱图,以质量浓度(|D)为横坐标, 峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,并进行线性回 归,得回归方程:Y=7454.6p一5297.2,r=0.9997, 结果表明,,,赖氨酸对照品在300,700mg?L内线 性良好. 2.7定量限 取,,赖氨酸对照品,精密称定,加水溶解并稀 释制成一系列浓度,取20注入液相色谱仪,当主 成分峰高为最大噪音峰高的10倍时,进样量即为定 量限,结果为10. 2.8检测限 取,,赖氨酸对照品,精密称定,加水溶解并稀 释制成一系列浓度,取20注入液相色谱仪,当主 成分峰高为最大噪音峰高的3倍时,进样量即为检 测限,结果为4. 2.9精密度实验 精密称取盐酸赖氨酸24.9mg置50l1lL量瓶 中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取此溶液 20注入液相色谱仪,连续进样6次,并记录色谱 图,平均峰面积为3749620,RSD为0.43%,结果表 明,本方法精密度良好. 2.10重复性实验 取同一批号样品配制成供试品溶液,精密量取 对照品溶液与供试品溶液各20注入液相色谱 仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,平行测定 6次,平均含量为99.52%,RSD为0.64%,结果表明 重现性良好. 2.11加样回收率实验 按处方量的80%,100%和120%精密称取盐酸 赖氨酸,配制成溶液,稀释制成相应浓度的溶液,进 行测定,每份平行测定3次,计算回收率及RSD值, 结果见表1. 2.12溶液的稳定性考察 按"2.1"项下的方法配置供试品溶液,室温下放 置,分别于0,1,2,4,6h取此溶液进样,测定峰面 积,平均峰面积为37200379,RSD为0.29%,结果表 明溶液6h内稳定性较好. 中国药学杂志20o6年7第4醪再_3期 表1回收率测定结果 Tab1Recoveryoftheassay 2.13赖氨酸有关物质的测定 取"2.1"项下的供试品溶液适量,以流动相稀释 至0.5g?L作为对照品溶液.取对照液20,注 入色谱仪,调节仪器灵敏度,使对照液中主成分色谱 峰面积满足准确测量要求.再取供试品溶液20, 注入色谱仪,记录色谱图至主成分保留时间的2倍, 按自身对照法计算有关物质的含量,规定本品的有 关物质含量应不超过0.5g?L,,注射用溶剂中有关 物质的测定结果见表2. 表2有关物质的测定结果 Tab2Determinationofrelatedcompounds 结果表明本品具有较高的化学纯度,有关物质 含量较低(<1.0%). 2.14赖氨酸含量测定 分别取3批样品按"2.1"项下的方法配制成供 试品溶液,精密量取对照品溶液与供试品溶液各20 注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面 积计算赖氨酸含量,结果见表3. 表3赖氨酸含量测定结果 Tab3DeterminationofLysinecontent 3讨论 3.1《中国药典>>20o5年版中只收载了盐酸赖氨酸 原料药的标准,含量测定采用的是非水电位滴定 法L1j,没有注射液的标准.在中国新药数据库中查 到有赖氨酸注射液的标准,含量测定采用的也是非 水电位滴定法,但本品本身是一种水溶液,若采用非 水电位滴定则首先要除去水分,这一步很困难,故此 笔者考虑采用RP-HPLC进行测定.赖氨酸为一种 中国药学杂志2oo6年7月第4l卷第l3期 碱性氨基酸,在240nm波长以上没有吸收,只在240 niYl波长以下有末端吸收,采用柱前衍生化法可以在 赖氨酸的分子上连接共轭基团,通过在特定波长下 测定此共轭基团的吸光度来测定赖氨酸的含量,目 前已有一些相关的报道,用不同的衍生化试剂与赖 氨酸衍生化测定赖氨酸的含量,如2,4.二硝基氟 苯2,邻苯二醛[3]等.但用衍生化法测定有很多困 难,如衍生化试剂一般都比较昂贵,衍生化反应影响 因素很多,如反应温度,反应时间,pH值,不同衍生 化试剂的选择和用量等,衍生化试剂的共轭基团通 常是与赖氨酸的氨基相连,而赖氨酸分子含有2个 氨基,这就可能生成多种衍生化产物,且衍生化试剂 自身也存在紫外吸收,这些都给用该法进行含量测 定带来了困难,所以我们采用在紫外吸收波长末端 用I-[PLC测定赖氨酸的含量. 3.2本实验室曾选用多种品牌色谱柱[Kromasil ODS(4.6mill×200113111,5tan),SpherigelVP—ODS (4.6mill×250toni,5tnn),BatasilODS(4.6mln×250 lnl/l,5tnn)],经比较柱压,保留时间,拖尾因子等因 素,最终采用本实验所用色谱柱. 3.3赖氨酸含有2个伯氨基和1个羧基,为极 性分子,反相高效液相色谱柱的填料十八烷基键合 硅胶为非极性填料,流动相为极性流动相,适合分离 非极性和中等极性的组分,这就给赖氨酸的分离 测定带来了一定的困难.故此笔者考虑极性较大的 流动相,这样可以增加赖氨酸在固定相上的保 留,使溶剂峰与赖氨酸的主峰达到较好的分离, 配制流动相常用的有机溶剂有甲醇,乙醇等.由于 甲醇比乙醇多了一个碳原子,故甲醇极性大于乙醇, 且甲醇黏度小于乙醇,柱压较低,所以采用甲醇.水 (25:75)作为流动相,在此流动相中,赖氨酸的保 留时间约为7.3min,但主峰有些拖尾,加入一定比 例的三乙胺可改变峰形,防止拖尾,流动相定为甲 醇.水.三乙胺(250:750:0.1). 3.4甲醇自身也存在末端吸收也可能给含量测定 造成影响,且使基线不稳,故此需要用较长时间来平 衡基线.本品是用盐酸赖氨酸制备的水溶液,且辅 料中还含有氢氧化钠,在制备过程中盐酸赖氨酸分 子将分解为,.赖氨酸分子和盐酸分子,大部分分解 下来的盐酸分子将会与辅料中的氢氧化钠发生中和 反应生成NaC1和水.溶剂峰中有两个倒峰和一个 正峰,第1个倒峰和正峰是NaC1的溶剂峰,第2个 倒峰是水的溶剂峰.二者均可与赖氨酸主峰达到有 效分离. ChinPharmJ,2006July,Vo1.41No.13?1025? HPLC.MS测定癃闭康泰片中贝母素甲,贝母素乙的含量 俞滢,朱亚尔(1.杭州师范学院生命科学院,杭州310012;2.浙江大学分析测试中心,杭州310029) 摘要:目的建立癃闭康泰中贝母素甲,贝母素乙的高效液相色谱一质谱联用含量测定法.方法癃闭康秦片经碱化,用氯仿一 甲醇(4:1)提取生物碱有效部位,提取液浓缩,残渣用甲醇溶解后,进行高效液相色谱一质谱测定.色谱柱为AgilentZorbaxex— tendClR(2.1mln×100mln,5/an);流动相为乙腈和10mmol?L甲酸铵(pH8.0),梯度洗脱(0—15min:乙腈30%一55%;15—25 min乙腈55%);流速0.2mL?min;柱温30?.质谱条件为电喷雾电离源(ESI),以选择性正离子方式检测,贝母素甲和贝母 素乙的选择性检测离子分别为m/z432.4和m/z430.4.结果贝母素甲和贝母素乙的的线性范围均为0.01—10mg?L,,相 关系数均大于0.999,检测限均为0.45?L,,方法回收率均大于95%,日内日间精密 度(RSD)均小于5%.结论本方法专 属性强,灵敏度高,线性关系良好,操作简便,适用于癃闭康泰中贝母素甲,贝母素乙 的含量测定. 关键词:高效液相色谱一质谱联用;贝母素甲;贝母素乙;癃闭康泰片 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1001—2494(2006)13—1026—03 SimultaneousDeterminationofPeimineandPeiminineinLongbikangtaiTabletbyLiquidChromatogram-Mass Spectrometry YUYing., ZHUYa-er2(1. HangzhoHTeachersCollege,Ha,,ga~oH310012,Ch/na;2.CenterofAnalysisandMe? ul"ementng niversity,Ha,~zhou310029,Ch/na) AIKqIRACT:OBJECI'PCETodevelopasensitiveandspecificIf_:-MSmethodfort}ledeterminationofpeimineandpeiminineinLong— bikangtaintablet.MEYI-IODSrI'hedrugwasextractedwithamixedsolutionofchloroform-methanol(4:1)afterbeingalkalined.rI'heLC—MS methodWasperformedonaAgilentZorbaxExtend-Cl8(2.1mill× 150mln,5/an).rI'hemobilephaseconsistedofCH3CNand10mmoL?L一 ammoniumformate(pH8.0)atagraaientelution.rI'heflowrateWasat0.2mL?min_..rI'hetemperatureofcolumnwas30oC.EsiWasapplied andoperatedinpositivemode.rI'hemonitorionswerem/z432.4(peimine)andm/z430.4(peiminine).RESULTSrI'helinearcalibration cnl'veofpeimineandpeimininewereobservedintheconcentrationrangeof0.01, 10mg?L-..rI'helowerlimitofquantificationofpeimineand peimininewere0.45ttg'L_..rI'herelativerecoveriesweremolethan95%.rI'heinter-andintra-dayprecision(RSDS)welebelow5.0%. CONCLUSIONrI'hemethodisprovedtobeconvenient,sensitiveandrapid.andsuitableforthedeterminationofpeimineandpeimininein Longbikangtaintablet. KEYW0RDS:LC-MS;peimine;peimine;peiminine;Longbikangtaintablet 慢性前列腺炎是成年男性的一种常见泌尿系统 疾病,该病的难以治愈和炎症的反复发作,一直是医 学界的难.癃闭康泰是用于治疗前列腺炎的中药 复方制剂,其中浙贝母在整个方剂中起佐药的作用. 浙贝母的主要成分为异甾体生物碱及其苷,药理研 究表明,贝母素甲和贝母素乙具有抗胆碱活性和对 支气管显着松弛作用,是浙贝母的主要活性成分[. 由于贝母素甲和贝母素乙无紫外吸收,其含量测定 方法常用TIC2J,但TLC方法的检测灵敏度和专属 性较差,《中国药典>>2005年版一部收载的浙贝母药 材中贝母素甲和贝母素乙的含量测定方法为HPLC— ELSD,但由于该制剂中所含成分复杂,采用该法干扰 3.5由于采用末端吸收,所以基线易漂移,在流动 相配比,进样量等其他条件不变的情况下,采用不同 的柱温进行考察,结果柱温恒定在30?时,基线稳 定,因此确定了柱温为30?. 口}ERENaES [13CHP(2005)Vol?(中国药典2005年版.二部)[s].2005:582. 583. LIUYB,MIAOHZ,LIUYE.HPLCdeterminationofLysinehv. drochlofideincompoundL-Lysinegramdes[J].ChinJPha/TnAnd (药物分析杂志),1999,19(6):410-412. LINGXM,LIUYQ,DUM,eta/.DeterminationofLysinecontent inaLysinehydrochlorideinjectionbyHPLC.uV[J].JShenyang PharmUniv(沈阳药科大学),2000,17(5):349.352. (收稿日期:2005.06-29) 作者简介:俞滢,女,讲师通讯作者:朱亚尔,女,副教授 Tel:(0571)86971871E-mail:zhuyaer@zju.edu.cn 1026'Ch/nPharmJ,2006July,Vo1.41No.13中国药学杂志2O06年7月第4匿丽