【word】 人轮状病毒的主要标志物与疫苗研究

【word】 人轮状病毒的主要标志物与疫苗研究 人轮状病毒的主要标志物与疫苗研究 热带病与寄生虫学2008年第6卷第4期 JournalofTropicalDiseasesandParasitology2008.Vol6.No4 人轮状病毒的主要标志物与疫苗研究 张诗海综述沈继龙审校 已知许多病毒,细菌,寄生虫可引起感染性腹 泻.轮状病毒(rotavirus.RV)被证实为发展中和发 达国家儿童胃肠炎的一种重要病原体.在美国, 1997~2000年问因腹泻而住院的5岁以下患者中, 18%,19%是由RV引起的….亚洲监测网最新报 告,45%的5岁以下儿童的急性腹泻住院病人,其 病因归咎于RV感染H.5岁以下的儿童几乎都罹 患过RV胃肠炎.其中1/5就医,1/65住院.大约 1/293死亡,82%的死亡病例在发展中国家[31. RV为无包膜的含双股RNA的呼肠病毒,直 径约70-75nm,呈球形,由11段基因片段组成,A 组R.V电泳时形成4—2—3—2分布模式.外被三层 蛋白,从内向外壳呈放射状排列,如车轮状条辐.电 镜下形态如车轮而得名.RV按习惯分为小儿 RV,成人RV和非典型RV,又按其抗原特性和核 酸电泳图形分为A~F6个组.小儿RV也称普通 RV,属于A组;成人RV又称成人腹泻RV.属B 组.小儿RV对理化因素抵抗力较强.能耐乙醚, 弱酸,在室温中传染性可保持7个月,一20?能长 期保存.RV的11个基因片段分别编码病毒的6 个结构蛋白(VP1一VP4,VP6.VP7)和5个非结构 蛋白(NSP1,5),目前研究多集中在VP6,VP4,VP7 和NSP4.根据面中和抗原VP7和VP4的抗原 性不同分G血清型和Pm清型.我国广州地区婴 幼儿RV肠炎G1占84.1%,从轮状病毒的GP分 布显示,广州婴幼儿轮状病毒主要为GIP8和 G2P4.兰州地区婴幼儿RV肠炎G3P1A占57.7%. G2P1B占23.1%,G1P1A占19.2%.马鞍山地区 G1P4占35.48%,苏州地区G3P4占优势(23.91%). 上海地区婴幼儿tLV肠炎G1占55,5%.G3占 27.6%,G2为9.4%,G4仅0.4%【卜7l.再结合对长春 基金项目:国家高技术研究发展资助项目(.’863” 计划.编号:2006AA02A251) 作者单位:230022合肥,安徽医科大学第一附医院检 验科(张诗海),安徽省立儿童医院检验科(张诗海),安徽 医科大学,安徽省人兽共患病晕点实验室,教育部省部共 建重要遗传病基因资源利用重点实验室(沈继龙) ? 233? ? 综述? 等8个城市获得的病原分型[81.我们不难看出我国 婴幼儿RV感染G血清以G1,G3,G2为主;P血 清型乃以P4,P8和P1占主导.1996年Ball等首次 提出NSP4是一种肠毒素以来,现在越来越受到 重视.RV的致病机制不是单一机制引起的BOl,目 前对其致病机制尚未明了.对病毒的治疗还没有 特效药物.新型疫苗仍是未来防治RV感染的有 效措施. 一 ,RV的主要标志物 1.RV的内衣壳蛋白VP6 VP6是RV的内衣壳蛋白.是RV中含量最多 的蛋白质.约占病毒总蛋白的51%.其分子量约为 45kDa.主要刺激机体产生黏膜免疫抗体slgA, Burns等人的研究结果VP6诱导的IgA抗体 可经m循环进入小肠上皮细胞,在穿过小肠上皮细 胞的过程中能与病毒形成复合物,抵抗病毒的原发 感染.肠内I水平高低与Rv的感染有关,而jffL 清中特异性的IgG对于免疫保护无明显作朋…l. VP6不仅是诊断中能够检测到的主要抗原,还 是病毒群特异性抗原.按VP6抗原性不同分为7 个组(A—G),感染人的仅有A,B,C三组.A组RV 是全球婴幼儿严重腹泻的最主要病因.B组RV由 我国学者洪涛在1983年首先发现,主要感染成人. 对其流行规律比较清楚:C组RV偶尔感染青壮 年,对人类威胁不大.根据VP6抗原性不同,又将 A组RV进,步分为I,?,I+?和非I/?亚 群,I亚群相当于电泳型短型,II亚群相当于长电 泳型.因为大多数哺乳动物和部分人群的RV属 于I亚群,而大多数人和部分猪的RV则属于? 亚群.因此,亚群的分类可用于调查人和动物RV 之问的关系.目前已经成功将VP6基因在大肠 杆菌中表达出VP6蛋白】.对通过黏膜介导的免 疫有重要意义 2.RV的外衣壳蛋白VP7 VP7约占病毒蛋白含量的30%,主要南基因片 段9,7或8编码.VP7是病毒的主要外壳糖蛋白, 决定病毒的血清型,并可以诱导中和抗体.根据表 垫董量量生虫芏Q墨生箜鲞第4期 JournalofTropicalDiseasesandPamsito1o2008.Vo16.No4 面中和抗原VP7抗原性不同分14个G血清型 (G1,G2,G3,G4因最常见而被用于制备疫苗).天 然VP7是一个内质网糖蛋白,N一糖基化完成后停 留于内质网并在此参加病毒颗粒组装.从而限制 了它免疫原性的发挥.抑制VP7虽然没有影响其 他病毒蛋白的表达和分配,但聚集在内质网内的 包膜颗粒不能形成成熟的病毒颗粒.VP7在RV 形态发生的最后过程中,对去除病毒暂时获得的 包膜是必要的.基因疫苗中VP7常被作为研究的 首选对象.全长vP7在原核中表达比较困难.袁力 勇等?用包含了全部3个主要抗原性区域的184 个氨基酸的编码区(称为vP7TR,TR表示 truncated)在大肠杆菌中进行表达出的蛋白占菌体 总蛋白的30%.Perez等用重组的乳酸乳球菌诱导 产生了针对从肠道途径感染的RV的中和抗体【14】. 3.Rv的外衣壳蛋白VP4 VP4约占病毒蛋白含量的1.5%,VP4是RV的 血凝素,与病毒的毒力和致病性,细胞接触,病毒结 合,侵人及感染细胞有关.根据表面中和抗原VP4 的抗原性不同至少分有44个P血清型.VP4对 蛋白水解酶敏感,是非糖基化蛋白,由第4基因编 码的VP4基因全长2359bp.VP4经胰酶裂解后产 生VP5,VP8两个片段.VP8有240个氨基酸.分子 量为28kDa,其余部分构成VP5,VP5的分子量为 60kDa,胰酶裂解位点位于241和246位的精氨酸 处.VP5核心大部分有N末端修饰.这种修饰与病 毒穿入细胞有关.VP8拥有VP4蛋白的主要抗原 位点.Crawford等研究表明[15】.只有在蛋白水解酶 存在的环镜中vP才能裂解产生从冷冻电子显微镜 下观察到的在20面体重构图像中的穗状结构.该 穗状蛋白负责病毒穿入过程.这一机制已经确定. Andres用酵母表达的VP8融合蛋白对免疫的乳鼠 的保护力比未免疫的乳鼠的保护力高60%t61. 4.ILV的非结构蛋白NSP4 SP4是由基因10编码.含有一个开放读码框 架.编码一个175个氨基酸的蛋白质.NSP4被认 为有肠毒素样作用.NSP4引起Ca2+从内质网中 释放,而细胞内钙的增高导致了一系列的细胞病 变如微绒毛细胞支架网络的破坏,降低了双糖酶 和其他酶的表达.广泛抑制了Na+-溶质的共同转 运机制【171.也是RV水样腹泻的重要原因.另外, 受感染的细胞释放的NSP4与未受感染的细胞的 还不明确的受体结合,激活了磷脂酶c一肌醇三磷 酸(PLC—IP3),可以再引起细胞内质网内Ca2释 放.NSP4的两个功能区中的内层壳粒(irmer capsidparticle,ICP)结合区定位于161—175,在1CP 出芽进入内质网(ER)腔的过程中发挥辅助作用. 二,免疫预防 1.主动免疫应答 主动免疫中疫苗的制备被公认为公共卫生预 防中的一个有效策略.目前研发的RV疫苗主要 有两大类:口服RV活疫苗和非复制性疫苗.前者 包括口服重配疫苗和单价疫苗. 重配疫苗中较成功的为四价疫苗(Rhesus strainvaccine,RSV),包括G3,G1,G2,G4和五价 WC3(VP7,G1一G4;VP4,P),两者都得到了美国政 府的许可,但前者有发热等副反应,应用后还发生 了肠套叠,后退出美国市场,而且这些成功的疫苗 在欧美等发达国家实验成功,但应用于发展中国 家效果不好.单价动物株疫苗大多被放弃.我国 兰州的LLR(Lanzhoulambrotavirusvaccine)即P, G10是我国唯一被批准的RV疫苗,但它的作用也 仅在局部地区有效.非复制性疫苗选用的载体病 毒不能在免疫接种动物的体内复制,是一种宿主 限制性疫苗.腺病毒载体以其重组的病毒疫苗能 够比其它重组载体更强地诱导细胞毒性T细胞反 应而在非复制性疫苗中被广泛使用. 2.被动免疫应答 正如前所述的肠内lgA水平高低与Rv的感 染有关.IgA的亚型IgA1和IgA2在血清和唾液中 的比列不同,且随年龄增长比值减小【191.总的来说. IgA1比IgA2高.但IgA2对蛋白酶的抵抗优于 IgA1.对肠道和呼吸道的病原微生物有防御作用. 初乳中含有丰富的I,婴幼儿从初乳获得的对 RV的抵抗力明显高于奶瓶喂养.进一步的研究表 明,初乳中还含有除IgA外的其他物质.如 lactoferrin,AF和lactadherin糖蛋白.Lactadherin蛋 白的分子量大约46kDa,目前发现的lactadherin家 族有6个成员.lacmdhefin的唾液酸糖基结构与肠 道上皮细胞的唾液酸糖基结构相似,可以与RV交 联并竞争抑制其结合肠上皮细胞.从而阻止RV致 病.但具体机制不明.另外lactadherin对婴幼儿有免 疫调节作用,对以后的生长发育有深远的影响. 对于植物抗体方面,目前被看好的转基因植物 热带病与寄生虫学2008年第6卷第4期 JournalofTropicalDiseasesandParasitology2008~Vol6.No4 疫苗具有对表达蛋白进行糖基化,酰氨化,磷酸 化,亚基的正确装配等后加工,使表达产物具 有良好的免疫原性和生物活性;转基因植物生产成 本低,基因整合后便可长期使用等优点. 现在有人已经用转基因植物如马铃薯【21】表达 VP7,番茄[221表达VP6和VP2,表达产物免疫动物 均可以得到相应的抗体,说明植物转基因疫苗是 一 种潜在的获得轮状病毒疫苗的途径.但转基因 植物的表达水平低,表达产物的稳定性,转基因口 服疫苗在产生免疫应答之前在胃肠道内有时被消 化等问题尚待进一步研究. 参考文献 lMalekMA,CuresAT,HolmanRC,eta1.Diarrhea—and rotavirus—associatedhospitalizationsamongchildrenless than5yearsofage:UnitedStates,1997and2000. 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(收稿日期2008—06—17编辑李启扬)