对《三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较》一文中比较实验设计上的缺陷分析（可编辑）

对《三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较》一文中比较实验设计上的缺陷分析（可编辑） 对《三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影 响的比较》一文中比较实验设计上的缺陷分析 对《三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较》 一文中比较实验设计上的缺陷分析 彭长华 发在《中华检验医学杂志》2008年7月第31卷第780-783页的论著《三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较》，对影响荧光定量PCR检测结果的三种HBV DNA提取方法以及黄疸、溶血和脂血样本进行了详尽的比较实验，具有很高的参考价值。然而我们认为论著的比较实验在设计上尚存瑕疵，分析如下: 一、论著的比较在实验设计上忽略了HBV DNA提取方法对样本的稀释作用导致的荧光定量PCR检测结果的降低。 按论著的介绍，各种提取方法最后都取3μl提取液作为HBV DNA，加到PCR反应管中进行扩增检测。对于微量核酸释放法(MNR法)，PCR反应管中的模板量相当于3μl原血清中的HBV DNA量;而对于碱液直接裂解法(直接法)，3μl模板只有相当于1.5μl原血清中的HBV DNA量;对于酚-氯仿核酸提纯法(经典法)，3μl模板只有相当于1.36μl原血清中的HBV DNA量;对于多聚糖病毒沉淀浓缩法(PEG法)，3μl模板应有相当于12μl原血清中的HBV DNA量。 MNR法扩增反应前PCR反应管中的模板量是直接法的2倍，是经典法的2.2倍，这时以扩增反应后MNR法的结果高于直接法和经典法来推断MNR法提取HBV DNA优于直接法和经典法，难以让人信服。 要比较各种提取方法提取HBV DNA的效果，应在设计上使各种提取方法在扩增反应前的PCR反应管中有相同的相当于原血清中的HBV DNA量。例如按以下方案设计比较实验: MNR法:3μl血清，3μl MNR，处理后全部加至PCR反应管中。 直接法:40μl血清，加40μl DNA提取液，处理后加6μl上清液至PCR反应管中。 经典法:50μl血清，500μl Trizol，100μl氯仿，离心后取275 μl 上清液，处理后加50μl TE溶解， 取6μl 至PCR反应管中。 PEG法:100μl血清，加100μl DNA浓缩液，离心后沉淀加200μl DNA提取液，处理后加6μl上清液至PCR反应管中。 以上4种提取方法最后的PCR反应管中都相当于加入了3μl原血清中的HBV DNA量且反应管总体积相同。抽样单位相同才能进行比较。 二、 论著的比较实验在设计上忽视了低拷贝数样本的高抽样误差对荧光定量PCR检测结果的影响。 由Poisson分布的概率函数公式可计算出:当总体均数λ为1、2、3、4时，一次抽样结果为0的概率分别是0.36788、0.13534、0.04979、0.01832。 对应于论著介绍的PCR检测，当血清样本HBV DNA为1.33×103拷贝/ml时，MNR法扩增前PCR反应管内平均HBV DNA为4拷贝(T 4)，一次抽样检测结果为0 论著中所称的定量值为阴性 的概率是0.04979;直接法的T 2，一次抽样检测结果为0的概率是0.13534;经典法的T 1.81，一次抽样检测结果为0的概率是0.16365。 由此可知，按论著设计的抽样，越是低拷贝数的血清，直接法和经典法的定量值为阴性的概率越高于MNR法，仅以一次检测的定量值为阴性来说明MNR法优于其它两方法，还是难以让人信服。 三、检测结果的重复性 荧光定量PCR检测结果的重复性也应以同一样本多次重复检测结果的变异系数来量化。 论著中多次提到重复性，但在论著中没有看到其实验数据和统计结论。在论著的图中有各种方法、各种干扰物的单次扩增反应曲线的比较，但即便是同一方法、同一干扰物的血清多次重复检测也可能得到像论著图中的CT值不同的扩增反应曲线。 要观察重复性，就要设计多次重复检测，然后比较检测结果变异系数的大小。 假设DNA提取效率达到最高的100%、扩增检测效率达到最高的100%，这时FQ-PCR检测结果的最小变异系数由抽样误差决定。Poisson分布总体均数为T，总体方差σ2 T，检测结果的最小变异系数CV /T×100%。 按论著的介绍，对于4×103拷贝/ml的血清样本，MNR法抽样3 μl血清，扩增前PCR反应管 抽样单位 内平均HBV DNA为12拷贝(T 12)，重复检测结果的CV 28.87%;直接法抽样相当于1.5μl血清，T 6，则CV 40.82%;经典法抽样相当于1.36μl血清，T 5.44，则CV 42.87%;PEG法抽样相当于12μl血清，T 48，则CV 14.43%。由此可知，仅仅因为抽样单位内HBV DNA的均数不同，CV就有较大差别。 由于论著设计的抽样就可导致MNR法检测结果的CV远低于直接法和经典法，即使有重复性数据可推断出MNR法提取HBV DNA的重复性优于直接法和经典法，也难以让人信服。 要比较各种提取方法提取HBV DNA后检测结果的重复性，在设计时要么使抽样单位相同(如第一点所介绍);要么选用高于1.33×105拷贝/ml的血清样本(按抽样3μl血清，T,400)，使抽样导致的CV降到5%以下。 四、PEG法是实际检测中常用DNA提取方法，其设计目的是为了提高检测方法的灵敏度，方法是通过浓缩而增加抽样单位内HBV DNA的拷贝数(前述的T值)，减小单次抽样无高于阈值的扩增反应(结果为0)的概率，从而也减小了低拷贝数样本检测结果的变异系数。 对于4×103拷贝/ml的不添加PCR干扰物的血清样本，按论著设计的提取方法，从理论上计算，检测结果的拷贝数PEG法应是直接法的8倍、是MNR法的4倍;检测结果的最小变异系数直接法约是PEG法的3倍、MNR法约是PEG法的2倍。但在论著中也没有看到与理论计算相符的实验数据。对此，我们进行了PEG法与直接法的比较 实验，重复4次结果如表1和图1所示。 表1 低拷贝样本用直接法与PEG法各重复检测4次的结果比较 序次 mean SD CV% 1 2 3 4 PEG法 CT 21.0 20.7 21.4 21.2 21.1 0.30 1.42 10x拷贝/ml 3.66 3.75 3.53 3.60 3.635 0.093 2.57 直接法 CT 26.3 24.5 23.9 23.3 24.5 1.30 5.29* 10x拷贝/ml 1.99 2.55 2.74 2.93 2.553** 0.406 15.90 *与PEG法CT值的变异系数比较，差异有统计学意义(u 1.995，P 0.046)。 **与PEG法拷贝数的变异系数比较，差异有统计学意义(u 2.286，P 0.022)。 图1 低拷贝样本用PEG法与直接法各重复检测4次的扩增反应 曲线比较 按论著设计的方法，我们进行的比较实验的结论是:PEG法检测 的HBV DNA拷贝数高于直接法(W 16，P 0.005)，约是直接法的 9倍;直接法检测的CT值的变异系数高于PEG法(u 1.995,P 0.046 )，检测结果的CV约是PEG法的3.1倍，与理论计算基本吻合。 2008-09-18