神经病理痛大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角血管内皮生长因子受体2及嘌呤2X23相互作用研究（可编辑）

神经病理痛大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角血管内皮生长因子受体2及嘌呤2X23相互作用研究（可编辑） 学位独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得直昌太堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的并表示谢意。 签字日期: 沥/年多月,多日 学位论文作者签名手写:苍一毛 , 学位论文版权使用授权书. 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文的规定,有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签名手写 学位论文作者签名手写:奢久签字日期:矽?’年石月 签字日期:如『年月占摘要 摘要 目的: 神经病理痛 是由外周或中枢神经系统结构损伤或 功能紊乱所导致的病理性疼痛。实验室前期的研究工作已观察到神经病理痛模 型大鼠背根神经节 神经细胞中血管内皮生长因子 免疫反应性增强。鞘内应用抗重组血管内皮生长因子抗体.简称.可使神 经病理痛模型大鼠后足的机械和热痛阈值降低,、及/受体 表达减少。本研究进一步通过电生理方法观察在大鼠神经细胞,对 受体和/受体激动剂激活电流的调制作用,并结合免疫组织荧光双标 观察神经病理痛模型大鼠.背根神经节细胞、及受体共 表达以了解相互之间关系;进而用免疫组织化学、免疫组织荧光双标和蛋白印 迹方法观察神经病理痛模型大鼠/段脊髓背角神经细胞.、 和受体的相互关系,以期拓宽和深化对神经病理痛发病机理的认识,为防 治神经病理痛提供新的靶点。 方法:建立坐骨神经结扎损伤模型。雄性大鼠随机分为三组:假手术组 ,,坐骨神经慢性压迫性损伤神经病理痛模型组 , ,和.处理神经病理痛模型 组. ,。组每隔一天鞘内注射.抗体,和 组同时间注射磷酸盐缓冲生理盐水。术后第天急性分离大鼠手术侧.背 根神经节和/段脊髓背角,通过免疫组织化学、免疫组织荧光双标和蛋白印迹 分析方法检测神经细胞和/段脊髓背角、和的表达。 应用全细胞膜片钳技术在大鼠新鲜分离的神经细胞上对受 体激动剂和,受体特异性激动剂激活电流的调制作用。 结果:免疫荧光双标结果显示三组背根神经节神经细胞.均分别有 受体、受体免疫荧光共表达。组与组比较和受体、 受体荧光表达量更明显,经.抗体处理后,荧光亮度减弱,表达降 低。 膜片钳实验结果表明大部分经细胞外加. ?。,引起剂 量依赖性的内向电流,且随浓度增加增大。/受体特异性激动剂 .可产生类似电流,该电流也能被/受体特异性拮抗剂.所 摘要 抑制。预力,对电流和,.电流都有增强作用,此增强作用均 可被拮抗剂抑制。免疫组化结果显示组/脊髓背角的 .、和的阳性细胞光密度值均高于组和组刚.;免疫 荧光双标结果显示/段脊髓背角.均分别有受体、受体免疫 荧光共表达。组与组比较.和受体、受体荧光表达量更明显, 经.抗体处理后,荧光亮度减弱,表达降低。蛋白印迹分析表明在 目 的条带经.标化后组/脊髓背角的、和的蛋白表达均 明显低于组卿.,但仍高于组矿.。 结论: 神经病理痛模型大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角的、 和受体存在共表达并表达上调,电生理结果显示增大或 /受体激动剂激活电流。提示与或/受体在神经病理痛发 病过程中存在相互协同作用,可增强或/受体在神经病理痛中的 作用。 关键词: 血管内皮生长因子;背根神经节;脊髓背角受体;/ 受体;血管内皮生长因子受体.: ..谢 , , , / . / ?. , . ., 仃 . :. , ?.? ,., 一 . ? 一 .?’ 、, ..一 / / . 【, ?一?. ../,,一 .. . ?. . , 一 / , . . : / . ?.,/ . /. ; :;; ;/ ; . 目录 目 录 第章引言? 第章材料与方法?. .材料?. ..动物? ..主要试剂 ..主要仪器 ..溶液配制??.. .方法?. ..实验动物分组。 ..神经病理痛模型制作? ..鞘内注射??。 ..免疫组织化学?.....免疫组织荧光双标..全细胞膜片 钳??..... ..蛋白印迹??。 ..统计学方法第章结果一 .背根神经节神经细胞免疫组织荧光双标? .背根神经节神经细胞膜片钳结果 .. 神经细胞受体激动剂激活电流? .. 对受体激动剂激活电流的增强作用?. .. 增强的浓度一效应关系 .脊髓背角免疫组织化学?.. .脊髓背角免疫组织荧光双标??。 .脊髓背角蛋白印迹。 第章讨论? 第章结论致 谢?目录 参考文献攻读学位期间的研究成果? 综述??.第章引言 第章引言 血管内皮生长因子 是年从牛 垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化出来的作用于血管内皮细胞的生 长因子。主要存在于脑、心、垂体等组织中,除了促进内皮细胞增殖、增 加微血管通透性、诱导血管生成,还可促进神经新生,神经细胞和神经胶质细 胞增长,具有神经保护作用?。包括.通常所指的、 ?、、.、.、胎盘生长因子以及内分泌腺来 源的血管内皮生长因子.。的受体主要有、 /.、.、神经毡蛋白.?和神经毡蛋白..。 主要通过和.发挥生物学效应,.大多数作用通过 实现,.和.共表达才能发挥作用,.和.主 要与./.复合体或特异性结合发挥生物学效应【】。 三磷酸腺苷 ,是一种嘌呤类物质,可作用于 嘌吟受体,具有神经递质/调质作用【刮。嘌呤受体分为受体和受体。受体 又分为受体配体门控性非选择性阳离子通道受体和受体蛋白耦联受 体。大量实验表明向动物皮内注射,可使动物产生对疼痛的防御性行为。 人体实验研究结果与动物实验结果一致,提示是一种重要的疼痛 信号递质。 及其作用的受体涉及痛觉及伤害性信息在初级感觉神经细胞和脊髓背 角的传递【,主要是同聚性受体和异聚性/受体参与了初级感觉神经 细胞的痛觉及伤害性信息传递。和/受体介导神经病理痛和炎性痛 的痛觉传递【】。神经病理痛和炎性痛刺激时,和和/受体和蛋 白表达明显增加,初级感觉神经细胞和/受体介导的激活的门控通 道电流明显增强。以上一系列研究表明和/受体参与神经病理痛的发病 机理。 神经病理性疼痛是由外周或中枢神经系统结构损伤或功能紊乱所导致的病 理性疼痛,常常表现为自发性的疼痛,对机械、冷、热等伤害性刺激产生痛觉 过敏。周围神经的损伤可诱导交感神经节后纤维在它相关背根神经节 ,为芽生并包绕神经细胞胞体形成去甲肾上腺素能“篮状细胞”,也 就是交感神经与感觉神经之间存在解剖结构上的交感.感觉耦联 现象】。神经生第章引言 长因子促进交感神经生长诱导交感芽生,参与坐骨神经慢性压迫性损 伤 。。神经生长因子 ,神经病理痛的发病 和胶质细胞源神经营养因子是造成痛觉神经细胞再生和形成敏感性的 因子】,可使颈部和腰部的受体表达明显增加【】。兴奋嘌呤受体可 增加表达和生成【圳。根据增加的表达这一现象提示生长 因子与痛觉相关,是否也可通过影响表达影响神经病理痛的发病。 另外有研究表明,.及其类似物能够增强外周伤害性感受器对辣椒素作 用的敏感性【’,而也具有类似炎症介质的作用【,其提高血管通透性 的作用比组织胺强万倍【,是目前发现的最强烈的增加血管通透性的物质之 一。尽管与两者在生存部位、部分作用和结构上有所区别,但 在功能上却具有同源性。.与均具有促进血管形成的作用。因此, 我们推测也可能通过类似炎症介质的作用直接涉及神经病理痛的发病机 制。 本研究通过免疫荧光双标了解神经病理痛模型大鼠神经细胞. 与或/受体之间的关系,电生理方法观察在大鼠丰经细胞对 受体和,受体激动剂激活电流的调制作用。属假单极神经细胞,存 在于外周和中枢突。位于脊髓背角的中枢突表达受体和/受体。进 一步结合免疫组织化学、免疫荧光和蛋白印迹方法观察神经病理痛模型大鼠脊 髓背角受体和受体水平的变化,为神经病理痛的防治提供新的实验基 础。 第章材料与方法 第章材料与方法 .材料 ..动物 健康?大鼠, ,雄性,南昌大学实验动物科学部 提供。 ..主要试剂 兔源性抗体 公司 兔源性抗体 公司 兔源性.抗体 武汉博士德生物工程公司 小鼠源性.抗体 武汉博士德生物工程公司 . 公司 北京中杉生物技术公司 小鼠源性抗体 北京中杉生物技术公司 冷冻切片包埋剂 北京中杉生物技术公司 兔二步法检测试剂盒 北京中杉生物技术公司 小鼠超敏二步法检测试剂盒 北京中杉生物技术公司 显色试剂盒 北京中杉生物技术公司 北京中杉生物技术公司 标记的羊抗兔 北京中杉生物技术公司 标记的羊抗小鼠 封闭用羊血清 北京中杉生物技术公司 甘氨酸 公司 丙烯酰胺 公司 ,’.亚甲双丙烯酰胺 公司 公司 去氧胆酸钠 公司 公司 . 公司第章材料与方法 过硫酸胺 公司 膜 公司 北京中杉生物技术有限公司 山羊抗兔/辣根酶标记 北京中杉生物技术有限公司 山羊抗小鼠/辣根酶标记 胶原酶, 公司 胰蛋白酶, 公司 膑蛋白酶抑制剂 公司 三磷酸腺苷 , 公司 亚甲基三磷酸腺苷, 公司公司 公司 ..主要仪器 .型膜片钳放大器 日本. .刺激器 日本. 型二线示波器 汕头超声电子仪器厂 .二道生理记录仪 成都仪器厂 华中科技大学同济医学院 .玻璃微电极拉制仪 .玻璃微电极 成都川华达科学仪器厂 调速多用恒温振荡器 国华电器公司 倒置显微镜 日本 生物信号采集处理系统 南京美易科技公司 .型荧光显微镜 日本 型电子分析天平 上海恒平科学仪器公司 .型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂 宁波镇海三爱仪器厂 微量进样器 .型垂直板电泳槽 北京六一仪器厂 .型水平电泳槽 北京六一仪器厂 第章材料与方法 .型转移槽 北京六一仪器厂 .型水平摇床 北京六一仪器厂 江苏省金坛市荣华仪器制造 .型恒温水浴箱 公司 恒温干燥箱 上海康路仪器设备公司 自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 微量移液器 公司 ..溶液配制 ....免疫组织化学所需液体 ./磷酸盐缓冲生理盐水.. 。. . 双蒸水定容至, 调值至..。第章材料与方法 。 .,加双蒸水至 / 调至. 细胞外液 ., ., ., ., ., ? 。 ., .,加双蒸水至 / 调至. ....蛋白印迹试剂 去污裂解缓冲液 嘶. 叠氮钠 .且芡~不】 去氧胆酸钠 . .溶于异丙醇后再加到裂解液中 %丙烯酰胺贮存液 丙烯酰胺 . ’一甲叉双丙烯酰胺 . 双蒸水 过滤,棕色瓶保存 %过硫酸胺 过硫酸胺 双蒸水 配制后,一?避光保存。 ×凝胶上样缓冲液 /’溴汾兰 . 甘油 .用时现加 %分离胶 第章材料与方法 ./ . ? . . %聚丙烯酰胺 . % 蛾 %分离胶 ., ./嘶 . %聚丙烯酰胺 . . 姆 % %积层胶 / . .缓冲液后,现加第章材料与方法 双蒸水 调值至. ? 双蒸水 调值至. 含.%的液,用时现加 %封闭液 脱脂奶粉.方法 ..实验动物分组 雄性大鼠随机分为假手术组组,神经病理痛模型组和 .处理神经病理痛模型组组,每组只。组每隔一天鞘内注射 ?,同时对组和组注射.。 ..神经病理痛模型制备 本实验建立坐骨神经慢性压迫性损伤模型【‘ , 为神经病理痛模型:%戊巴比妥钠/腹腔注射麻醉,右侧下肢背 侧部备皮、消毒,肌注青霉素,无菌条件下手术。纵向做约切口, 钝性分 离后找到坐骨神经主干,铬制羊肠线结扎处,两结扎线间距各 ,结 扎松紧度以不影响神经外膜的血运为宜,细丝线缝合,伤口%酒精消毒,术 后肌注青霉素预防感染。假手术组只暴露坐骨神经,不结扎。 ..鞘内注射 依据等人的实验方法四用微量乙醚将大鼠麻醉后,垫高腹部,取俯卧 第章材料与方法 位。左手在背侧脊柱下段探及髋结节,其水平位置即为大鼠的,结节上间隙 即为.间隙,固定穿刺点皮肤,右手持微量进样器从间隙垂直缓慢穿刺, 针进入蛛网膜下腔时有落空感,以尾巴出现颤动或突然侧向甩动为穿刺成功标 志。组大鼠每隔一天鞘内注射 配制,同 ?/,. 时间组和组注射 .。鞘内注射后,大鼠一般状况无明显变化,没 有明显的防御或攻击行为出现,也没有伤残和死亡。 ..免疫组织化学 标本制备:手术后第天,麻醉大鼠,立即开胸暴露一脏,经左 室插管,并剪开右一耳,先用生理盐水灌注约,再用%多聚甲醛灌 注固定。 轻柔取每组大鼠术侧?背根神经节 ,和/段脊髓 背角,置于冲洗,再迅速放入%多聚甲醛固定然后用%蔗糖 脱水,换液次。固定脱水后的组织用冷冻切片包埋剂包埋后,连续 冰冻切片, 切片厚度岬,贴于预先用处理过的载玻片上,恒温烤片,置于一 冰箱内保存备用。 免疫组织化学步骤: 将冰冻切片从.冰箱取出,先静置以平衡至室温。. 浸洗次 擦干组织边缘,置.%的中作用,常规. 浸洗; 滴适当稀释的一抗为:,其他抗体用:稀释于组 织切片上,完全覆盖组织,湿盒中过夜; 次日,. 常规浸洗,滴加超敏二步法检测试剂盒的液, 孵育,弃液,常规. 浸洗; 滴加超敏二步法检测试剂盒的液, 孵育,常规. 浸洗; 显色; 梯度脱水,透明,封片,拍照。 图像分析系统观察分析。 . ..免疫组织荧光双标 标本制备:同免疫组织化学。 第章材料与方法 免疫组织荧光染色步骤: 将冰冻切片从 冰箱内取出,先静置以平衡至室温,然后 放入. 中浸洗次 ; 滴%多聚甲醛,室温作用进行后固定,常规. 浸洗: 擦干组织边缘,将含有%正常羊血清的滴加于组织切片上, 完全覆盖组织, 下湿盒内封闭 将混合一抗: 稀释的小鼠源性.、: 稀释 兔源性抗体,或: 稀释的小鼠源性、: 稀释的 兔源性抗体 加入到组织切片上,完全覆盖组织,湿盒内过夜: 次日,经. 常规浸洗后,将二抗: 稀释的标记第章材料与方法 检查仪器连接和初始设置; ; 拉制电极,. ,. 安装电极:用细胞内液充灌玻璃电极的三分之一并弹出气泡,将 电极装 到电极夹持器上: 相界电位补偿和测量电极电阻:入液前对微电极内施加一个小正压, “”状态下将微电极入液,调节相界电位补偿,显示电极电阻.较好; 细胞封接:调节微操纵器使微电极尖端接近细胞表面,对微电极内施加 一负压,形成高阻.封接; 吸破细胞膜:封接后让细胞平衡,再给予负压吸破细胞膜,切换到“钳 压”档并置钳制电压于. ; 加药:移动加药装置排管直径为. ,管距记录细胞 左右, 加入所需药物; 软件记录电流变化。 量一效曲线绘制公式:/】。为浓度,为化后 的激活电流,为标准化后的激活电流最大值,硒为产生最大效 应时的半效浓度,为系数。实验在室温进行。 ..蛋白印迹 蛋白样品制备:术后第天将大鼠击晕,迅速断头,取每组数只大鼠 术奥.背根神经节和/段脊髓背角,清洗后置于匀浆器中,去污 剂裂解液,按%的比例加入?。的,冰上匀浆,间断重复碾磨。 裂解约后,液体移至.离心管,/ 离一后取上清,然后 按比例加入×凝胶上样缓冲液,再按%例加入/ ,分装置于. 保存。 蛋白电泳: 制备分离胶:根据目的蛋白的分子量大小来选择所配制分离胶的种类, 分子量越大,分离胶浓度越小。制备%分离胶,和均制备% 分离胶。吸取分离胶混合液快速注入玻璃板间隙,异丙醇压平胶面,待 胶凝固后吸干异丙醇; 制备%积层胶:吸取%积层胶混合液快速注入玻璃板间隙,注意避 免不要有气泡,迅速插入.梳子,完全凝固后取出梳子。如暂时不用,可用第章材料与方法 吸有纯水的滤纸包裹,再用保鲜膜包裹外层,置。保存; 电泳:从.中取出蛋白样品,置沸水中煮约,使其充分变性。 每孔道上样,两边各上..,置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电 泳,槽内液面高于槽外,内外不相通。积层胶约 跑至分离胶时换成 电压,约后若的标示位置已过样品中目的蛋白位置时就可以结 束电泳; 转膜:根据标示的位置,切取所需凝胶部分,剪比胶稍大一些的 膜盖住凝胶膜先在甲醇中浸泡,凝胶和膜两面各放四层与凝胶大 小一致的滤纸,胶对转膜央子负极,膜对正极,夹好放入装有转膜 缓冲液的转 膜器中,转膜.。 免疫学检测 .封闭:转膜结束后,将膜置中,正面向上平摇洗膜,中间换 一次,然后移入于%封闭液中,缓摇孵育。 .孵育一抗:封闭结束后将膜移入用封闭液适当稀释的一抗反应 液稀释 比例:抗体:,其他抗体均:,正面向下,过夜或室温缓摇; 回收一抗,平摇洗膜三次×。 .孵育二抗:将膜移入封闭液适当稀释的.二.抗反应液稀释比例: 羊抗兔:,羊抗小鼠:,缓摇,平摇洗膜三次。 .曝光:膜在中反应后,暗室中曝光一 ,显影、定影。 图像分析系统观察分析各组光密度值。 . ..统计学方法 使用统计软件 .进行统计分析,以均数标准差?表示实验结 果,各组数据间统计采用方差分析,法比较组问数据,.为显著性 差异, 胙.为极显著差异。 第章结果 第章结果 .背根神经节神经细胞免疫组织荧光双标 实验观察到假手术组,模型组,?抗体处理组背根神 经节神经细胞或单独免疫荧光表达,和受体免 疫荧光共表达。模型组神经细胞和受体荧光表 达亮度比假手术组更明显。.抗体处理后.和受体荧光 亮度减弱见.。 网 / . .. / . . .; ; 第章结果 , . “. 实验观察到假手术组,模型组,抗体处理组背根神 经节神经细胞或单独免疫荧光表达,.和受体免 疫荧光共表达。模型组神经细胞.和受体荧光表 达亮度比假手术组更明显。抗体处理后和受体荧光 . 亮度减弱见.。 / . .. /. . 、析 . ; ;? . . . 川. 第章结果 .背根神经节神经细胞膜片钳结果 .. 神经细胞受体激动剂激活电流 急性分离大鼠神经细胞。选取圆形或椭圆形,中小直径,轮廓及形 态 清晰的细胞进行实验。本实验共检测个神经细胞,其中大多数细 胞 .%,/对力. ?敏感,引起剂量依赖性的内向 电流,的完全恢复时间约为~ 。/受体特异性激动剂 ,. ?。可产生类似电流见.。及【,.激活 电流可被和/受体特异性阻断剂.所阻断见.。. 使 ?.激活电流减小..%,,. ?以.激活电流减小..%。所以本实验所记录的.激活电流 是由或/受体介导。 ?. 丫 ,喜? 喜 ’ 》乙一’ ,一 。 第章结果..? , ?. . , . . 一. . ?‘一‘‘一 . .. 对受体激动剂激活电流的增强作用 在对敏感的细胞中,本身可引起可检测的膜电导改变。预加 .. ?~后再加 .?‘,发现大部分神经 细胞.%,/可观察到明显增强的 ?.激活电流。 预力 ?对【,. ?也出现明显的增强作用,增强 ?时开始产生作用,随浓 幅度约为..%。在浓度为 ?’ 度增加,增强作用逐渐增大,在 浓度时趋于稳态.。 在浓度为.、、、和 ?以时,对 ?。.激活电流的增强幅度士分别为:..%, ..%,..%,.士.%一和.士.% .。 , ‘一 一 ‘。 弓 》 一丫第章结果 ?粥??隋胡. 唔.. 喀. ... ,? ?。 邺?卜‘ . . . .,,,, ?。.. :均 . 塔 ..,??.阱,伽叩鲫诵辔龇喊 .. 增强册的浓度?效应关系 ?? .后对. ..为预加 ?.激活电流 抑制的量一效曲线。由图所示:的量.效曲线相比的量?效曲线 明显上移;预后,激活电流增强的最大幅度达.%;预加 ?和 后,激活电流的‰值与对照组激活电流的值分别为 ?.,两者非常接近;的阈浓度与对照组的阈浓度相似; 单独预加的拮抗剂 ?以激活电 ?.后, 流没有明显变化:预加的拮抗剂 ?后再加 ?, ?‘激活电流亦没有明显变化;但冲洗后再单独 加 , ?.激活电流明显增强。 第章结 果................?? ...................................... ??’ ..........?? . ‘ 拈 柚 . 协 ? ?苫鲁弓;艺?卜《暑一目 ? 硼 姗 ?岫?. .. . ..一 ?.. . 沁 凹 ;士 一 ?. .晤? 诚 .硼岛 % 嬲 分 玳一,. 谢. 第章结果 .脊髓背角免疫组织化学 ?,一:??’, ’,。?.~ 毒 ‘ ‘ 。最 ., ? ;。.。. ?岁.:? ’。?。。。? ’ / 鹈?。一一,一。.,。 ‰: 纸,,、。 夔‘‖ ?一?.。 。一参.??。,地: : ‘ 。 , 蕾 :一。,?。/?‘ 一 .。砖。。/ ‖。:丫? 珀.? . 一 一 芷 . 岑. ?. 一 . ?.? .? 啊 ?俘。 .. /研,缸【矗 . 乱 / , 舢. 第章结果 ., .幸?.. 受体在假手术组,模型组和.抗体处理组‰ 段脊髓背角表达的光密度值分别为.:.,.., .士.。模型组与假手术组相比较受体表达明显升高庐., 辟.,抗体处理组与组相比较受体表达明显降低 ‖.,但仍高于假手术组‖,.见.。 . ” , 矿’。 甜 ’’ 。。 屯《诋 ?肇 。 。 ” 鬯 , 鼍 / 辔 。 ~席, 也.磁。一。.? 。。舢 。。。。。乙每。。。。 舻?. ??? ? 厂 、 孽 静 哪 。 静 够 ,,:一 。,,声一 . . . . . . 哇. . . 氇 /... 六/ 第章结果 , . . ? . .幸., 受体在假手术组,模型组和.抗体处理组,段脊 髓背角表达的光密度值分别为.士.,.., .士.。受体的表达在抗体处理组较组有所 降低,具有统计学意义.,,但仍高于假手术组.见 .。 。 毋 “ ‘ ”’ 。‘。孳 .一 月 ;。??‘。。参 一囊 . ‰ 。 一. ~ “ ?? 雌 . 小 ? .节 , , “ ,乙 。 , 雌 ? ? ,第章结果 /.,.. ? ? .?.,’ . .脊髓背角免疫组织荧光双标 实验观察到假手术组,模型组,抗体处理组/ 段脊髓背角或单独免疫荧光表达、和受体免疫 荧光共表达。模型组神经细胞.和受体荧光表达 亮度比假手术组更明显。抗体处理后.和受体荧光亮 度减弱见.。 【 一 备 ?遵籀餮盆翳,? 攀 一。,飞甓。/ / .. / . . 一第章结果 . . . ; ;??. , . .. 实验观察到假手术组,模型组,抗体处理组/ 段脊髓背角.或单独免疫荧光表达、.和受体免疫 荧光共表达。模型组神经细胞.和受体荧光表达 亮度比假手术组更明显。抗体处理后和受体荧光亮 度减弱见.。 // .... /. 一 . ?巧 印 . 第章结果. ; ; ... .脊髓背角蛋白印迹 .蛋白与蛋自在俗段脊萌背角表达的光密度值比值在假 手术组,模型组,抗体处理组分别为.., ..和..。模型组高于假手术组胙., 庐.和抗体处理组即.,抗体处理组高于 假手术组,但无明显统计学意义 .见.。 干 三 旱 乏 筚 , 垂 焉 晕一 ?~ 辨” ’’嘲 艮。争嘲??渺 . . . . . . . . . ?口?.血为。芷山一? .血 廿俩叩面酣?曩 唔.日和麟 . 钆/第章结果 ?, . .?‘., . 受体蛋白与肛蛋白在/段脊髓背角表达的光密度值比值在 假手术组,模型组,.抗体处理组分别为.:., .:.和.:.。模型组明显高于假手术组?., .和抗体处理组.。抗体处理组高于假 手术组,并有显著性差异舻.见.。 ‘ 工 》 耄 可?? ? 口 氏 . . .筠 . . . 一暑田.『‘ד? .? 塔 , . .. 憾./ ? , ,?..第章结果 .?.,鲫. 受体蛋白与蛋白在/段脊髓背角表达的光密度值比值在假 手术组,模型组,.抗体处理组分别为.士., .士.和. :.。模型组明显高于假手术组 .,.和抗体处理组.。.抗体处理 组高于假手术组.见.。 刍 争 仂 乏 卫 》 ? 零 互 疗 . ? ? ? 仉? 仉? 仉? 一口毋。未位一?一 .. 仍 . 文 / 衄私? , . ??., .第章讨论 第章讨论 ’ 神经病理痛是指由于外周或中枢神经系统结构损伤或功能紊乱所致的病理 性疼痛,其发病机制涉及外周性神经和中枢性神经途径。模型通过轻度结扎 坐骨神经而较大程度的模拟人类神经病理痛的各种症状,是目前神经病理痛研 究中最常用的模型。鞘内注射药物由于可以直接作用于中枢神经系统,因 此给予小剂量的药物就可以产生显著效果,而且还可以避免全身给药引起的不 良反应。本实验选用模型大鼠鞘内注射.进行神经病理痛研究。造 模后,大鼠出现手术侧下肢足趾并拢背屈,不愿触地,患肢行走无力,运动跛 行,说明本实验造模成功。 背根神经节 不但是感觉神经冲动由外周传向中 枢的通道,还是初级感觉信息的调制部位。与神经病理痛密切相关的或 /受体主要在中、小神经细胞中表达【,这些神经细胞的纤维主要 投射 到脊髓背角的第二层。切断大鼠坐骨神经后.中约有%受体表达 减少。慢性压迫损伤坐骨神经时中、小型神经细胞中阳性表达增加。 鞘内注射受体反义核苷酸后,中受体表达明显下降,从而减轻脊 神经节结扎引起的机械性疼敏以及受体激动剂,.和福尔马林所致 的足底伤害性反应。基因敲除和/受体的小鼠试验显示诱导痛 觉的作用减轻【,证明和,受体是致痛的作用部位。因此, 受体涉及神经病理痛的发病【盯。受体的异源性聚体结构分别由不同的 受体亚基组成。/异聚体由个受体亚基和个受体亚基组成。免疫 荧光染色双标实验结果显示.和受体或受体共表达在神经 节神经细胞和脊髓背角,说明在神经节神经细胞和脊髓背角与 受体、受体共存。本实验中神经节神经细胞和脊髓背角共存的 和受体可以是/受体异聚体结构的表达。本研究观察到神经病理痛大鼠 模型和脊髓背角的和表达均增加,表明和/受体与 大鼠痛觉有关。 研究报道中风或机械损伤后脊髓多种神经细胞的及其受体的 和蛋白水平明显增加。大鼠坐骨神经切断后及.在脊髓与神 经节中的表达增加。我们实验室前期的行为学实验观察到大鼠鞘 内注射 第章讨论 .后大鼠后爪热缩足反射潜伏期和机械缩足反射闽值 明显升高删。神经细胞表达.和【】。本研究通过免疫组织化 学和蛋白印迹分析发现,、、在/脊髓背角均有表达,且 模型大鼠组蛋白表达量较假手术组和.抗体处理组升高。此结果 表明.、、在/脊髓背角存在相互作用。神经病理痛大鼠 模型经鞘内注射.后,、、蛋白表达量降低,表 明可能通过作用于受体参与神经病理痛发病过程。结合免疫荧 光染色双标实验结果和受体、受体共表达在神经细 胞和脊髓背角,且模型大鼠组表达增加,提示及可能参与 神经病理痛发病,其作用可能涉及和,受体。组大鼠/脊髓背 角表达增加,当鞘内注射.后表达减少,同时也 降低与神经病理痛相关的受体及受体表达,表明.可能通 过阻断与特异结合,进而降低受体和/受体的表达, 影响痛觉传递。由于有类似炎症介质的作用,它也可能通过促进 外周感 觉神经的炎症损伤作用使神经细胞和/受体敏感性增强,注射 .拮抗,可能使大鼠和脊髓背角受体和/ 受体敏感性降低,从而缓解大鼠的痛行为。 三磷酸腺苷 ’,是和/受体的天然激 动剂,仅,亚甲基三磷酸腺苷【,.,.是受体激动 剂。及其类似物【,.与之结合后可激活受体,使非选择性阳离子通道 开放,引起内流为主的电流,引发痛觉。本实验应用全细胞膜片钳方法观察 到体外施.岬。卜以刺激.神经细胞,大部分神经细胞.%, /敏感,引起剂量依赖性的内向电流,且随浓度增加电流增大。 受体特异性激动剂,.可产生类似的激活电流。和/受体特异性 拮抗剂.可阻断以上电流,因而此电流是由激活或/受体所产 生。研究报道:受体功能可以被一些神经递质所调制,通过影响配体门控离 子通道激活伤害性感受器,降低其伤害性感受阈从而间接增强神经纤维末梢细 胞膜的兴奋性引。神经生长因子 ,可增加,. 引起的内向电流,而抗体可减弱这种电流 。应用全细胞膜片钳实验发现 作用于人微血管内皮细胞引起受体依从性阳离子通道电流。本实验 观察到:在对敏感的细胞中,本身可检测到微弱的膜电导改变,第章讨论 同时与施加于神经细胞时,发现预力 ?以后 ?以.激活电流明显增强。预力 ?也可使,. 岬?‘.激活电流增强。可能使和,受体对激动剂的敏感性增 强。是多靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂,对.、均 有抑制作用。单独预力的拮抗剂对的激活电流没有明显的影 响。而同时预加和其拮抗剂后,可产生降低增强或 .激活电流的作用。表明通过作用于受体使和/ 受体兴奋,介导的电流增强。发挥生物学效应需要通过种酪氨酸激酶受 体和,的大多数作用通过.实现。我们实验室的 前期研究显示主要表达.,未检测到表达。有研究表明, 可以直接作用于神经细胞,促进神经细胞生长【们, 给予的特异 性抗体可以完全阻断的这种作用,但.抗体却无影响【孔】。应用酪氨 酸激酶抑制剂阻断的磷酸化过程后,发现可抑制经处理 的培养神经节细胞生长【例。因此,本实验中主要是通过阻断. 产生抑锖增强或伐,.激活电流的作用。 激活介导某种信号传导通路而直接作用于神经细胞。 受体介导的信号转导与其他受体酪氨酸激酶相似?,与配体结合后形成二聚体, 使受体胞内激酶区特定的酪氨酸残基自体磷酸化增强,引起胞浆内激酶级联反 应,进而激活一系列信号传导通路。增大和/受体激活电流的作 用也可能是由于通过与.结合,从而使受体和,受体磷酸化,敏 感性增强,或表达上调。本实验预后,激活电流的‰值与对照组 的‰值非常接近。因此,对受体与其激动剂和,.的亲和力 增加没有明显的影响。受体激动剂激活电流的增大主要是因为和, 受体表达上调,与结合增多,相应的离子通道开放增加,非选择性地引起阳 离子内流,使细胞内浓度增加,增强初级感觉神经细胞的痛觉信息传递。因 此,可能与和/受体具有协同作用参与神经病理痛的发病机制。 模型组神经节神经细胞.和受体或受体荧光表达比假 手术组和.抗体处理组神经节神经细胞.和受体、 受体荧光表达更明显。而经过.抗体处理后,神经节神经细 胞细胞.和受体或受体荧光表达亮度降低。实验结果表明在神 经病理痛的状况下,:经节神经细胞的.和受体或/受体表第章讨论 达明显增高,而在.抗体处理后,.和受体或;受体表 达降低。因此,.抗体处理可降低组大鼠中和/的表 达,同时减少表达,阻止和或/受体兴奋在神经病理 痛发病过程中的相互增强作用,抑制痛觉信号传递从而缓解大鼠的痛行为。 总之,通过鞘内给予.后,背根神经节神经细胞及脊髓背角的 .、、/表达较神经病理痛模型组明显减少,说明. 可以减少与特异性结合的量,影响介导的痛觉信号的传导, 减少和/受体的表达,减少神经细胞对伤害性刺激的反应。结合 拮抗剂可以阻断增大和仅,.激活电流的作用,表明作用的 与或/受体之间存在相互协同作用,共同增强痛觉信号的传 递,参与神经病理痛的发病。第章结论 第章结论 大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角的与/受体存在共表达。 神经病理痛导致大鼠背根神经节神经细胞和脊髓背角的.和或 /受体表达上调。增大或/受体激动剂激活电流。提示 作用的与或受体之间存在相互协同作用,及其受体 .参与神经病理痛发病。