新生儿轮状病毒感染临床和分子流行病学研究（可编辑）

新生儿轮状病毒感染临床和分子流行病学研究（可编辑） 新生儿轮状病毒感染临床和分子流行病学研究 ，毛丑冒a矛，a,矿t tjj fiZ 评阅人4: ( 评阅人5: 陈志敏主任医师浙江大学医学院附属儿童医院 答辩委员会主席: 黄先玫主任医师杭州市第一人民医院 委员1: 陈洁 主任医师 浙江大学医学院附属儿童医院 委员2: 委员3: 委员4: 委员5: 2011(2(25 答辩日期- 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签名: 岔纠 日 签字日期:、‘‘年亨移 签字日期:_IJ年弓月砂日 浙江大学硕士学位论文 致谢 ?o，,?’N 致谢 本文是在杜立中教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、构思、资料的收 集，实验的进展到最后的审阅，杜老师都倾注了大量的心血。在论文完成之际， ? ? 谨此怀着诚挚的心情衷心感谢我的导师杜立中教授对我的热情关怀和悉心指导。 在整个硕士阶段的学习期间，杜老师对我的学 --j和生活给予了无微不至的指导和 关心(杜老师渊博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学方法以及敏锐的科研洞 ’ 察力、实事求是的科研作风都令我敬佩不已，他高尚的品格和谦逊宽厚的人格以 及正直不阿的立身风范都是我今后学 --j和工作中的榜样。从我的导师身上，不仅 使我学 --j到了丰富的专业知识，更重要的是老师谦逊、坦诚的做人原则和积极向 上的人生态度给予了我深刻的影响，使我终生受益。在实验过程中遇到困难的时 候，是老师不断的鼓励和支持指导使我坚持下来，完成整篇论文(在 此，我谨向 杜老师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢! 感谢尚世强老师、吴鼎文老师、吴亦栋老师、还有我的师兄徐雪峰、朱家俊， 师姐许燕萍在我的学 -j和实验中给予的大力帮助，在我试验中遇到困难的时候， 他们总是积极的帮助我寻找实验失败的原因，积极探讨解决方法，在 实验进行中 给予了我很大的支持和鼓励，在此我衷心的感谢他们。同时还要感谢我们实验室 的陈黎勤老师、沈征老师、舒小莉老师、袁天明老师、周曹春老师、师姐余金丹、 吴蔚、沈迪颖还有我的同学张立、何雪、姚丹，还有其他同学我就不一一列举了， 在与他们的朝夕相处中，我们已经结下了深厚的友谊，他们就像我的 家人一样给 了我很多的支持和帮助，使我的研究生生活充满欢乐与美好的回忆，真的非常感 谢你们! 感谢我的父母对我毫无保留的支持与关爱，父母的关爱使我获得了前进的动 力和战胜困难的勇气和决心，支持我顺利完成学业! 感谢所有给予我真诚帮助的人们! 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 新生儿轮状病毒感染的临床和分子流行病学研究 浙江大学 儿科学 硕士研究生 程芬 : -( ( I 导 师 杜立中教授 摘 要 目的: 轮状病毒 Rotavirus，RV 是导致世界范围内儿童严重腹泻的最主要病原体， 该病毒所致的腹泻普遍流行，几乎所有5岁以下的儿童均发生过RV感染。每年大 约有60万婴幼儿死于轮状病毒感染，占全世界5岁以下儿童总死亡人数的5,， 其中80,发生在亚洲及撒哈拉以南非洲的贫穷国家;在发达国家例如美国，因胃 肠炎而住院患儿中30,一70,是因为轮状病毒感染所致，每年造成的直 接或间接经 济损失大约100亿美元。在我国，轮状病毒感染所致的急性胃肠炎占30,(40,， 同样造成了医疗资源和社会经济的巨大损失，严重影响了我国婴幼儿的健康以及 生存质量。由此可见，无论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒胃肠炎都是一 个严重的公共卫生问题。轮状病毒性肠炎至今尚无特效药物治疗，且发达国家与 发展中国家轮状病毒的感染率并无明显差异，说明改善卫生条件及提高婴幼儿的 营养状况并不能减少该病毒的传播，因此研制有效的轮状病毒疫苗成为预防轮状 病毒肠炎的主要手段，已经成为当今世界卫生组织疫苗发展的首要任务之一( 当发生多种轮状病毒混合感染时，病毒基因片段可以发生重组，从而产生新 的病毒株，重组可以发生在轮状病毒人株之间以及人株和动物株之间， 产生了轮 状病毒基因多样性，使轮状病毒的流行株随时间和地区不同而发生变异，给疫苗 研究带来一定的挑战。特别是疫苗引入之后，可能对轮状病毒的流行株起到选择 性作用，出现少见病毒株在人群中形成的爆发流行。所以我们有必要对 轮状病毒 的感染情况，尤其是病毒株的分布情况进行深入的流行病学调查研究，从而及时 发现新的流行株的出现，更好的为疫苗研究服务。 新生儿轮状病毒感染具有不同于婴幼儿感染的特点，主要是医院获得性感染 且可在婴儿室中呈现暴发流行难以控制，同一病毒株的感染可持续数年，并且已 ? 中文摘 要 浙江大学硕士学位论文 经有人推测感染新生儿的轮状病毒株可能成为当地社区内随后蔓延的新的病毒株 的来源。所以在新生儿中对轮状病毒感染株的监测有可能早期发现新的流行株的 及时纳入疫苗研究中，以预防少见轮状病毒株引起的感染大规模流行。 出现， 之前对于腹泻期间肠道共生菌群变化的研究主要是应用经典的粪便细菌培养 的方法，较早期的关于这方面的研究表明在儿童急性腹泻期间肠道菌群由原来的 以厌氧菌为主转变为以需氧菌为主，而对于轮状病毒感染和肠道菌群变化的关系， 国内外研究比较少见且存在分歧。 本次研究通过调查2009年浙江大学医学院附属儿童医院新生儿轮状病毒感染 的主要流行株，以了解新生儿轮状病毒的流行病学特点及与临床的关系，为疫苗 的研究提供分子流行病学基础，并通过检测新生儿粪便中p(葡萄糖苷酶、p(葡糖醛 酸糖苷酶以及尿素酶的活性，了解其在发生轮状病毒感染时肠道微生态的变化情 况，为临床治疗提供依据。 方法: 收集2009年3月(12月，浙江大学医学院附属儿童医院新生儿病区腹泻病 人粪便标本，经实验室诊断为轮状病毒感染的新生几粪便标本共100份，根据编 码组特异性抗原的基因VP6设计引物，进行RT―PCR扩增特异性VP6基因片段， 并进行琼脂糖凝胶电泳以确定为轮状病毒感染，阳性者再进一步进行G、P基因分 型。设计针对最常见流行株G1(G4的特异性引物，进行G基因分型;P分 型主要 是根据流行株P[41、P【6】、P[8]分别设计特异性引物进行RT-PCR。基因扩增结果 进行琼脂糖凝胶电泳，根据特征性分子量部位的条带判断基因型别。分别测定轮 (葡萄糖苷酶以及p一葡糖状病毒肠炎组和对照组新生儿粪便中尿素酶、p 醛酸糖苷酶 的活性，了解肠道微生态的变化情况。同时对RV感染组病例的临床资料 包括: 年龄、性别、分娩方式、喂养方式、腹泻天数、每日大便最高次数、发热和呕吐 情况 进行统计分析，以了解新生儿轮状病毒肠炎的临床特征。 结果: 研究期I"1感染新生儿的轮状病毒基因型均为G3P[8]。轮状病毒感染组 粪便尿素酶和p(葡糖醛酸糖苷酶的活性均显著高于对照组，差异具有显著 性意义 III 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 ,k--0(000 ;轮状病毒感染组p(葡萄糖苷酶活性与对照组相比无明显 变化 卢O(256 。浙江省新生儿轮状病毒感染的季节性特征为院内感染高峰发生在1(3 月和10(12月;社区感染高峰是4、5月。临床症状严重性比较:社区获得性感染 与院内感染相比、早产儿和足月夕L相比差异无显著性意义 尸 0(05 ;分娩方式 和喂养方式相比较临床严重性也无明显差异 P均大于0(05 ;出生7天以内发生 感染的新生儿临床症状，包括发热、腹泻和呕吐的严重性评分值低于出生7天后 发生感染的新生儿 尺O(05 。在主要临床症状中发热和呕吐出现的频率院内感染 和社区获得性感染没有明显差异 P 0(05 ，而院内感染组新生儿大便次数增加出 现的频率明显高于社区获得性感染组，大便性状改变即出现水样便或蛋花汤样便 尸值均小于0(05，差异具有显著性的频率社区感染组要比院内感染组高， 意义。 结论:1轮状病毒是引起新生儿院内感染的主要病原体。2009年浙江省新生儿轮 状病毒感染的流行株为G3P[81型，未检测出其他病毒株; 2轮状病毒感染后有可能引起肠道菌群结构的变化。 3新生儿感染轮状病毒后其临床表现的严重程度与感染年龄和喂养方式有 关，与其它因素无关。 4新生儿感染轮状病毒的方式 院内获得性感染和社区获得性感染 不同， 其临床表现不同。 5轮状病毒在新生儿中全年均可检出，呈散发或流行，院内感染高峰 发生 12月以及1(3月。 在秋冬季节10( 关键词:轮状病毒;新生儿;院内感染;尿素酶;B(葡萄糖苷酶;p(葡糖 醛酸 糖苷酶。9 IV 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 andMolecular of Clinical Rotavirus Epidemiology in InfecfionNeonates Pediatrics university Zhejiang MasterCandidate ChengFen Supervisor: Prof(DuLizhong Abstract Rotavirusisthe causeofseverediarrheain children 【Objective】 leading young worldwide(Thediseaseis childhavean ofrotavirus ubiquitous，almostevery episode about children infection diefrom 600，000 rotavirus， account byage5(Everyyear in 5,ofalldeathschildrenunder5 of worldwide(Ofthetotal approximately yearsage deathsmorethan in countriesinsouthAsiaand 80,occurringresource-poor sub-Saharan countriessuchas Africa;Indeveloped for arerotavimscaused， andisassociatedwithdirectandindirectCOSTSof gastroenteritis causedrotavirus billion China,acute approximately$lperyear(In gastroenteritisby a account caused lossto andmedicalresources， 30,-40,，also great Socio―economy affectedthehealthandlife ofinfantsand children(Thus(bothiIl seriously quality young and isaserious health developingcountries，rotavirusgastroenteritispublic developed are thereisno noeffective available，and therapies significant problem(As currently rate differenceofrotavirusinfectionbetweenindustrializedand resource―poor that in orthenutritionalstatusofinfants countries，indicatingimprovementshygiene and havelittleeffectonvirus the health young transmission，Soprimarypublic interventionforrotavirusinfectioniSvaccination， Rotavirushasbecomethe vaccination taskofthevaccine inWorldHealth primary developmentprogram Organization(When mixedinfectionwithmorethanonerotavirusstrain fromthe OCCtlrs，the genesegments virusesreassort reassortantsofmixed parental may independently，producingparentage， V 浙江大学硕士学位论文 英文摘 要 thereassortCalloccurbetweenhumanstrainsorhumanandanimal strains， resulting viral rotavirusstrainsovertimeand will a diversity(The vary regions，thisbring invaccine aftertheintroductionofthe challenge vaccine， it development(Especially aselectiverolein strainsof the ofarare mayplay rotavthis，induce epidemic prevalence strain(So ofrotavirusinfectionis needed,thus in―depthepidemiologicalinvestigation candetectthe ofnew strainsin betterservice time，and emergenceepidemic provide forvaccine withinfantsand rotavirus children，neonatal research(Comparingyoung infectionhavedifferent infectionandCan characteristics，mainlyhospital―acquired Cause outbreaksin isdifficultto samestrainofthevirus control，the nursery，it infectionlastforseveral have thatRVstrains may years(Somebodyhypothesized neonates a sourceof ofnew strainsthat infecting mayrepresent emergence possible inthelocal ofrotavirus subsequentlyspread community(Therefore，themonitoring newborns detectionofthe ofanew infecting possiblyprovideearly emergencestrain， internalizeintovaccine Can infectionscaused research，then timely preventpandemic by unusualrotavirusstrain(Previousstudiesaboutthe of intestinalflora changessymbiotic in the acutediarrhea basedontheclassical methodoffecal gutduring primarily bacterialculture(An fromthisinstitutionthat noted acutediarrhea study early during fecal bacteria from ofanaerobestoa ofaerobes( changedpredominance predominance onthe betweenintestinalfloraandrotavirusinfectionis However，studyrelationship rareindomesticand theresultsare controversial(This relatively foreign，moreover rotavirusinfectioninneonateinthe Children’s study 2009，affiliated investigated year of orderto understandthe University，in HospitalZhejiang epidemiological characteristicsofneonatal thebasisofmolecular for rotavirus，provide epidemiology vaccine andthe research，and urease bydetectingD-glucosidase;p―glucuronidase in stoolstounderstandthethe microflorawhen rotavirus activity gut changes occurred( infection [Methods]Wecollected100Stool fromnewbornswhowas as specimens diagnosed ? 浙江大学硕士学位论文 英文 摘要 rotavirusinfection MarchtoDecember2009in byOutpatientLaboratory during affiliated Children’S of tOthe Hospital ZhejiangUniversity(Accordinggene sequences thatencode to VP6，we group―specificantigen designspecificprimeramplification with conduct to ’‘??VP6-specificgenefragmentsRT-PCR,and agarosegeleiectrophoresis determinerotavirusinfection(The then furtherfor G，P positivespecimens genotyping( the ofthe mostcommonstrainsG1-G4forG Designspecificprimers genotype;P classificationis basedon strains mainly prevalentP[4】，P[6】，P[8】to design愚 pecific forRT―PCR(Theresultsof(I conduct primers gene amplificationagarosegel tothecharacteristic molecularbandstodeterminethe electrophoresis，according fecal of and genotype(Detecteenzymeactivityurease， 13-glucosidase13-glucuronidase inrotavirus andthecontrol in toobserve gastroenteritisgroup grouprespectly changes microfloraofintestinal tract(Meanwhile，clinical imum stool and the days， mode，feeding，diarrhea daily frequency,fevervomiting oftwo were tounderstandtheclinicalfeaturesofneonatal groupsstatisticallyanalyzed rotavirus gastroenteritis( 【Results】Theofrotavirus newborns is ureaseand genotype infecting G3P[8](The inthe of rotavirusinfectionare than activity 13-glucuronidasegroup significantlyhigher in thatcontrol are group，therestatisticallysignificantdifferences P O ; betweentwo haveno D―gludosidase groups significant seasonalcharacteristicsofneonatalrotavirus in as infection ale follows: the Hangzhou seasonof infectionsarefrom nosocomial OctobertoDecemberand to peak January rotavimsinfectionin andNovember( March;community-acquiredprevailApril，May Thereareno differencesbetweenCA―AGEand statisticallysignificant HA-AGE， infantsandterminfantsinclinical of and preterm severity(Mode deliveryfeeding havenodifferenceonclinical whoinfectedRV patterns severity P 0(05 (Neonates 7 within ofbirthhavelowerclinical score withtheonewho days severitycompared after infected7 ofbirth，thedifferencewas days statistically VlI 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 themainclinical offeverand ofthetwo compared symptoms vomiting，thefrequency nosocomialinfectionsand between infectionsdidnot symptoms communityacquired differ ofstool was significantly P O(05 ，whileincreasingfrequencysignificantly inneonateswithnosocomialinfectionthanthat higher as or stoolaremore in infections，Stoolchangeswatery eggsoup―like frequency differencewas infections P 0(05 ，the community-acquired statisticallysignificant( ([Condusions] 1(Rotavirusisthe ofnosocomiMinfectioninneonatal(The majorgause rotavirusstrain neonatesin is prevalence infecting ZheJiang，2009G3P[8】 type， othervirusstrainswerenot detected; 2(Rotavirusinfection cause inthe ofintestinal flora; may changescomposition 3(The oftheclinicalmanifestationsin neonateafterrotavirusinfection severity isrelatedtothe ofinfectionand while ofother age feedingpatterns independent factors; rotavirus infectionand rotavirus 4(Hospitalacquired community-acquired infectioninneonateshavedifferentelinical feature; 5(Rotavirusinfectioninnewbornscanbedetected the throughoutyear,was or seasonof nosocomialinfectionsareAutumnand sporadicepidemic，the peak OctobertoDecemberand toMarch( Winter,from January [Keywords]Rotavirus;neonate;nosocomial IB-glucuronidase; 缩略语 缩略语 Abbreviations 。 一 RV:轮状病毒 一(( RT-PCR:逆转录聚合酶链反应 VP7:轮状病毒结构蛋白7 VP4:轮状病毒结构蛋白4 一 VP6:轮状病毒结构蛋白6 NSPl―4:轮状病毒非结构蛋白1-4 AGE:急性胃肠炎 HA- 院内获得性感染 CA:社区获得性感染 IX 目 次 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„I ?? : ???( 摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„II 缩略 语„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„IX 目次 1 引 言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„l 2+材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2(1研究对 象„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2(2研究方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 3结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 4讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 5结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3l 8 综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 作者简历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„67 引言 浙江人学硕士学位论文 新生儿轮状病毒感染的临床和流行病学研究 浙江大学 儿科学 硕士研究生 程芬 ‘ 导 师 杜立中教授 1引言 轮状病毒 Rotavirus，RV 属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，由澳大利亚学者 Bishop在1973年利用电镜首次发现，因形似车轮而得名。我国在1978年秋季从 急性腹泻患儿中首次检测出该病毒。轮状病毒现已成为导致世界范围内儿童严重 腹泻的最主要病原体，该疾病普遍流行，几乎所有五岁以下的儿童均发生过 RV感 染。每年大约有60万婴幼儿死于轮状病毒感染，占全世界5岁以下儿童总死亡人 数的5,，其中80,发生在亚洲及撒哈拉以南非洲的贫穷国家;在发达国家例如美 国，胃肠炎住院患儿中30,一70,是因为轮状病毒感染所致，每年造成的直接或间 接经济损失大约100亿美元乜1。在我国，轮状病毒感染所致的急性胃肠炎占 30,-40,b1，每年死于RV感染的5岁以下儿童约3万例H3，同样造成了 医疗资源 和社会经济的巨大损失，严重影响了我国婴幼儿的健康以及生存质量。由此可见， 无论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒胃肠炎都是一个严重的公共卫生问题( 且发达国家与发展中国家轮状病毒轮状病毒性肠炎至今尚无特效药物治疗， 的感 染率并无明显差异，说明改善卫生条件及提高婴幼儿的营养状况并不能减少该病 的发生，因此研制有效的轮状病毒疫苗成为预防轮状病毒肠炎的主要手段，已经 成为当今世界卫生组织疫苗发展计划的首要任务之一。 轮状病毒基因组是包含11个基因片段的双链RNA，分别编码6个结构蛋白 段编码单一蛋白质，仅片段11编码两种蛋白。完整的病毒颗粒是直径70nm的二 十面体结构，由三层蛋白衣壳 内层衣壳、外层衣壳和核心衣壳 包绕病毒双链 浙江大学硕士学位论文 引言 RNA基因组形成。VP6是含量最丰富的结构蛋白，存在于内层衣壳，产生组和亚 组特异性抗原决定簇，不同组的轮状病毒VP6蛋白具有高度的保守性，根据VP6 抗原性的不同，轮状病毒可分为7个组 A(G ，其中A、B、c三组可感染人类， A纽轮状病毒在世界婴幼儿腹泻中是最重要的病原体[51。VP4和VP7是主要的中 和抗原，构成病毒的外层衣壳，可以刺激机体产生保护性的中和抗体。根据这两 种蛋白将轮状病毒分成2种血清型:G血清型和P血清型，两者之间可产生交叉 免疫保护。VP7是糖基化蛋白，可由第9、8或7基因编码，具有型特异性， VP7 的含量远比VP4为多，所以在引发中和抗体产生的过程中，VP7的免疫原性较VP4 强的多。根据vP7所划分的血清型称为G血清型，目前已经有15种G血清型， G1(G4和G9血清型。VP4是刺突蛋白具有亲水性，属于蛋白水解酶敏感性蛋白， 可被胰蛋白酶裂解成VP5和VP8与细胞受体结合，按照此蛋白划分的血清型命名 为P血清型或基因型，至今已明确的有20个P基因型，其中P[4】、P【6】和P[8】是 最常见的流行型[61。NSP4是非结构蛋白，已经证实是一种肠毒素m。在疫苗研究 中VP4、VP6和vP7这三个主要的结构蛋白和非结构蛋白 NSP4 是具有重要价值 的。 当发生多种轮状病毒混合感染时，病毒基因片段可以发生重组，从而产生新 的病毒株，重组不但可以发生在人轮状病毒株之间且人和动物轮状病毒之间也可 以发生重组，因此产生了轮状病毒基因多样性，使轮状病毒的流行株随时间和地 区不同而发生变异，给疫苗的研究带来一定的挑战。我国1998(1999年期间轮状病 毒的流行情况调查显示主要流行株为Gl型，占阳性总数的83(4,，其次是G3 12(0 PEl0]G3、P[8]G5病毒株【9】。可见轮状病毒的流行特征是在不断交化的，在某个时 期内的主要流行株在另一个时期内可能会降低到次要地位，同时新的病毒株也是 不断出现的(特别是疫苗引入之后，可能对轮状病毒的流行株起到选择性作用， 2 浙江大学硕士学位论文 引言 出现少见病毒株在人群中形成的爆发流行。轮状病毒的较大的变异性使得我们有 必要对轮状病毒的感染情况进行深入的流行病学调查研究，以及时发现新的病毒 此外轮状病毒也是引起院内感染的重要病原体，院内获得性轮状病毒感株。 染占 RV感染总数的14(30,8-50(8,tIo】，特别是新生儿的轮状病毒肠炎大部分是由于院内 感染所致，新生儿轮状病毒感染的流行特征与发生在婴幼儿及年幼儿童中的流行 特点不同，可能会出现同一病毒株在整个婴儿室中的暴发流行，并且病毒株可以 在同一婴儿室中维持数年不变【111。据文献报道，世界各地英[雪1121，美国【13】和印度【tl】 均有新生儿病房内的院内感染爆发流行，1997年11月北京医院产科母婴同室病房 内就出现了由P[2]G4轮状病毒株引起的感染的暴发流行f14】。已经有人推测感染新 生儿的轮状病毒株可能是随后当地社区内蔓延的新的病毒株的来源„】，之前在新 生儿病房内流行的G8或G9型病毒株现在也已经在社区内出现流行【”-18】， 且G9 型在新生儿中检出的时间比在社区内出现的时间提前2年;在世界范围内P[6】病 毒株被公认为是新生儿毒株，它是在瑞典、美国、澳大利亚和委内瑞拉的新生儿 中分离出的【19，20】，但现在该病毒株在较大的腹泻儿童中也已经比较常见。 所以在新生儿中对轮状病毒感染株的监测有可能早期发现新的流行株的出 现，及时纳入疫苗研究中，以预防少见轮状病毒株引起的感染大规模流行。 虽然 一致认为新生儿多为隐性感染或轻度感染，但也有报道新生儿感染后出现严重的 水样腹泻【21】，甚至也可以出现致死性的严重症状如新生儿坏死性小肠结肠炎，事 有人提出大约30,-40,的坏死性小肠结肠炎 NEC 的发生与轮状实上已经 病毒 感染有关【14】，且大多数学者认为新生儿坏死性小肠结肠炎的发生是肠道细菌与RV 共同作用所致。所以对新生儿轮状病毒感染后临床特征进行统计描述，可早期引 起重视并进一步明确诊断，进行早隔期离和治疗，可避免院内感染的爆发和威胁 新生儿生命的严重症状的出现。 目前对新生儿轮状病毒感染的临床特征和流行病学研究的资料较少，我们就 2009年浙江大学医学院附属儿童医院新生儿病房内患轮状病毒肠炎的新生儿为研 究对象，对其临床和分子流行病学特征进行探讨。 同时我们还进一步对新生儿轮状病毒肠炎患儿的肠道微生态进行了研究。对 3 浙江大学硕士学位论文 引言 于腹泻期间肠道共生菌群变化的研究并不多见，较早期的关于这方面的一项研究 表明在儿童急性腹泻期间，肠道菌群构成发生了很大的改变，由原来的以厌氧菌 为主转交为以需氧菌为主，可能由于致病菌的过度繁殖以及肠道内氧化还原环境 ‘’的变化所致。而对于轮状病毒感染和肠道菌群变化的关系，国内外研究则更加少 见并且意见也不一致，Butler[21]等通过动物实验的研究并未发现轮状病毒感染时肠 道菌群的变化，而Mude【22】等则证明发生轮状病毒腹泻时肠道菌群是存在变化的， 但其变化趋势与腹泻的严重程度无关。本实验通过检测新生儿轮状病毒感染后粪 便中D(葡萄糖苷酶、D(葡糖醛酸糖苷酶以及尿素酶活性，通过与对照组 相比辊( 观察粪便中这些酶的变化从而了解肠道菌群的变化情况。 人类的肠道是大量细菌寄居的场所，包含400多种属 其中绝大多数是厌氧 菌 ，其数量超过了人体细胞的总数。肠道正常菌群在人体的肠道防御功能方面发 挥重要的作用，它们通过营养竞争 消耗可以被病原微生物所利用的底物 、占位 效应 侵占有限的粘膜空间或者上皮细胞 、分泌抑菌或杀菌物质 过氧化 氢、有 机酸和细菌素 【23】、产生抗毒素f24】、上调肠内的粘蛋白基刚25】等，形成一道生物 屏障抵抗微生物的入侵，通过抑制致病菌从消化道腔迁移至血液中，有益菌群至 少能部分的降低血浆中细菌内毒素物质的水平。 肠道共生菌群可以通过发酵作用为人体提供营养物质，其发酵副产物(短链脂 肪酸 SCFAs 、聚胺类、维生素类、抗氧化剂和氨基酸在肠道的健康中均发挥重要 的作用f261。 肠道共生细菌除了对人体的营养及肠道防御功能外，对免疫系统也具有调节作 用。乳酸杆菌能够增强细胞免疫和体液免疫。产乳酸细菌能够从各个方面刺激免 疫系统，包括促进巨噬细胞的吞噬功能，调节自然杀伤细胞、单核细胞和 中性白 细胞【拥。正常的有益菌群的粘附竞争性的抑制了致病菌在粘膜层的定植，并且减 少了对免疫系统的过度刺激。具有足量的粘液产生并且有适当菌群定植的健康结 肠，可以阻止致病菌的粘附，调节疾病的进程，并能阻止广泛的炎症紊乱 的发生。 肠道菌群紊乱与许多疾病的发生有关如关节炎、变态反应性疾病 哮喘、过敏性 鼻炎和湿疹 【28，291。有益菌种在肝脏疾病、乳糖消化不良等疾病中也具有重要作 4 浙江大学硕士学位论文 引言 用，研究证明口服细菌疗法可以促进微生态平衡并能降低门静脉的压力从而降低 出血的危险性【3们。Caplan和Jilling的报道指出有益菌种补充治疗在预防新生儿坏 死性小肠结肠炎 NEC 方面可能有效【311，其作用机制可能主要是调解炎症级联 ’ 反应，肠道共生菌群的代谢活动还与癌症的发生有关，动物实验发现某些肠道菌 群的代谢作用可能与结肠癌的发生有关【271。 鉴于肠道共生菌群在人类的健康和疾病中的复杂广泛影响，研究肠道菌群在疾 ?? 病中的变化是非常有意义的，可以指导我们对其适当的调整如使用益生菌、益生 元或合生素，帮助其恢复正常平衡状态，使其朝着对人体有益的方向发展。轮状 病毒肠炎是婴幼儿中普遍发生的疾病，研究其对肠道微生态的影响可以指导治疗， 避免因菌群结构改变而引起一系列疾病的发生。 在对肠道微生态的研究过程中，由于经典的细菌培养方法有很多缺点，很多 细菌并不能被分离培养，所以出现了很多新的检测方法包括直接和间接检测法。 直接检测方法包括:数字图像处理(根据他们的形态学表象以及分子生物学技术可 以检测粪便中主要的细菌;研究肠道菌群的间接方法包括测定粪便中细菌酶活性 【sz斟】，粪便中肠道菌群的其它的生物化学活动例如胆固醇转化成粪甾醇，胆红素 转变为尿胆原，胰岛素的失活和粘蛋白的降解。我们利用间接检测方法，测定粪 便中细菌酶活性的变化，来反应新生儿轮状病毒感染时其肠道微生态的变化 情况。 浙江大学硕士学位论文 材料与方法 实验材料和方法 l实验材料 1(1研究对象轮状病毒肠炎患者来自于浙江大学医学院附属儿童医院新生儿科住 院病人，年龄均小于28天。采集2009年3月份到12月份期间经门诊检验科胶体 金方法检测确诊为轮状病毒感染的新生几粪便标本100份，男60份女40份，男 女比例3:2(所有病例标本均经过了细菌培养和镜检排除了细菌性肠炎，在临床上 确诊为轮状病毒肠炎3天之内，每个病例采集2(59粪便标本迅速冻存于(80* 2冰箱， 用于轮状病毒分型及粪便微生物酶活性的检测。同样的方法另外采集同时期 未发 生胃肠炎的新生几粪便100份，作为与轮状病毒感染组的对照组进行粪便微生物 酶活性的检测。在进行粪便细菌酶活性测定时，挑选的两组病例在抗生素的使用 ??致、且两组病例母乳喂养和人工喂养的例数相等，从而排除抗生素情况上 的使 用和喂养方式的不同对于粪便微生态的影响。 1(2酶及主要试剂 逆转录酶 大连宝生物工程有限公司TaKaRa HotstartDNA聚合酶 大连宝生物工程有限公司TaKaRa Taq 琼脂糖 上海生工生物工程有限公司 脲素 上海生工生物工程有限公司 磷酸氢二钾 上海生工生物工程有限公司 磷酸二氢钾 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 氢氧化钠 上海生工生物工程有限公司 碳酸钠 4(硝基苯基(p(D(葡萄糖醛酸苷 日本东京化成工业株式会社 TCt 4(硝基苯基(p(D(吡喃葡萄糖苷 Sigma公司 Bradford Fermentas公司 Reagent 6 浙江大学硕士学位论文 材料与方法 牛血清白蛋白 Fermentas公司 对硝基苯酚 阿拉丁aladdin 全血用血氨测定试剂盒 FUJIFILM公司 。- (-一 ‘h ((’, 1(3主要仪器 2 酶标仪:(ELX(800型，Bio(TEKInstruments公司; 3 电热恒温水槽:DK一80型，上海一恒科技有限公司; ((， 4 (80?冰箱:CRYOPLUS2型，Forma-Scientific公司; 5 4"C，一20?冰箱:青岛海尔公司; 6 低温高速离心机:l-15K型，Sigma公司; 7 低温低速离心机:TJ(6型，Beckman公司; 8 荧光定量PCR仪:7500型，ABI公司; 9 JAl203电子天平:上海天平仪器厂; 10 TCL(16G台式高速离心机:上海医用分析仪器厂; 2试验方法 2(1粪便标本的处理将标本置于室温冻融，加入适量的PH 7(4的磷酸盐缓 冲液制成10, w? 的混悬液，用5ml注射器反复抽吸混匀标本，将混悬液转 移到1(5ml离心管中，3000转离心10分钟，取上清分装入新的离心管中，用于提 。 取病毒RNA 2(2病毒RNA的提取采用肠道病毒7l型核酸检测试剂盒提取病毒RNA。 1 取200ul粪便上清放置于1(5ml灭菌离心管中，加入400“lTrizol及200“l 氯仿，振荡器强力震荡20s后静置3分钟。 2 12000rpm离心2分钟，小心取出无色上层液体 注意不可触及中间絮状层 转移至新灭菌的1(Sml离心管( 3 加入20ulRNA提取液A 主要成分二氧化硅颗粒 ，再用振荡器充分混匀， 12000rpm离心一分钟，用移液器,ixjQ的将液体吸尽 避免触及沉淀颗粒 。 7 材料与方法 浙江大学硕士学位论文 4 震荡器充分混匀，12000转离心后弃去所有液体，加入溶液C 确认已加入 无水乙醇 800ul，充分震荡混匀，12000转离心1分钟，尽可能将液体去除干净 避免触及沉淀颗粒 。 5 将装有沉淀的离心管置开放式加热器中，60"C‘干燥5分钟 需防止样本交叉 l 污染 ，然后加入50uDEPC水，吸打混匀管中沉淀，得到白色的悬浊液，冻存 于(80?待用。 2(3 RNA逆转录将随机引物和提取出的模板RNA及其它成份按照下列比(例 l， 的双链结构，然后取出PCR管立即置于冰上，每管再加入逆转录酶0(5p Buffer dT ul，按照反应条件37。 C 5*PrimeScriptTM2“l，OligoPri