神经营养因子

神经营养因子 神经营养因子 脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)发生率高、损害严重而且治疗困难。多年来,科研工作者为之付出了无数的艰辛和努力。遗憾的是,由于神经元本身的再生能力不足和缺乏适宜的再生微环境等原因,哺乳类动物中枢神经系统(central nervoussystem, CNS)轴突损伤后再生能力十分低下。但令人欣慰的是,尽管 CNS 轴突难以自发性再生,远离损伤部位的神经元和它们的近侧轴突损伤后仍然存活,应用细胞移植、给予外源性神经营养因子等多种方法改善损伤局部的微环境,可以促进损伤脊髓的神经纤维再生。而且,由于各种治疗方法对神经组织的作用方式不同,其中两者联用可能产生超过单一因素的作用。因此,联合治疗、基因治疗等治疗策略应运而生,成为 SCI 治疗研究的重要方向。 成年动物的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)保留了许多发育阶段的特性和可塑性,它可以促进轴突再生和髓鞘化,协助再生轴突穿越通常无法逾越的胶质瘢痕和 CNS 的微环境,引导神经长入正确的部位;而且,更为重要的是,OECs 源于CNS,与 CNS 的整合及在 CNS 内的迁移非常自然。因而,OECs 被越来越广泛地用作细胞移植治疗 CNS 损伤,为细胞移植治疗 SCI 开辟了一条希望之路。 神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3) 是神经营养因子超家族成员之一。其生理功能广泛,可在体或离体调节周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)和CNS 的神经元形态、维持发育中的神经元的存活、促进其分化与增殖、诱导轴突生长和促进损伤神经元修复等。补充外源性 NT-3 也成为目前 SCI 治疗的有力手段。 本研究应用基因技术,将 NT-3 目的基因转入 OECs,使得经过转染的 OECs 生物活性更强,分泌更多的促进神经生长因子,并进行移植治疗大鼠脊髓打击损伤,充分发挥两者的协同作用。我们首先应用原代培养技术,体外培养纯化成年大鼠嗅球来源的OECs,检测 OECs 上 TrkC 受体和 NT-3 mRNA,观察外源性 NT-3 对体外培养的成年大鼠OECs 存活和增殖的影响;然后建立大鼠 T9脊髓打击损伤模型,局部给予 NT-3 和/或 OECs移植治疗 SCI,从局部剩余组织面积和反应性胶质细胞增生程度考察对损伤脊髓的保护作用,通过辣根 过氧化物酶逆行示踪评价 OECs 和 NT-3 对神经元的逆行性保护和纤维再 - 2 -WP=7第二军医大学博士学位生的影响,并采用 IP 试验和 BBB 联合功能评分观察大鼠下肢运动功能恢复情况,评价OECs 和 NT-3 联合应用对大鼠 SCI 修复的作用;再构建双拷贝逆转录病毒载体 pN2A-NT-3,脂质体转染导入 PA317,感染 OECs,获得高度达有活性 NT-3 的 OECs-NT-3 基因工程细胞株;最后应用 OECs-NT-3 基因工程细胞移植治疗大鼠 T9脊髓打击损伤模型,同样从减轻局部损伤、促进轴突再生、对神经元的逆行性保护及运动功能恢复等方面,系统研究其对 SCI 的修复作用。本研究的主要结果如下: 一、原代培养和纯化大鼠嗅球来源的 OECs 从 2.5 月成年大鼠的嗅球分离、原代培养 OECs,综合运用差速贴壁、阿糖胞苷抑制和 Forskolin、BPE 营养物处理,纯化 OECs。通过 S-100、p75NGFR 及 GFAP 免疫荧光染色鉴定、Hoechst 细胞核标记染色进行鉴定和所得细胞的纯度,并观察不同培养时期的细胞活性。结果表明,成年大鼠嗅球来源的 OECs 纯化后所得纯度可达 90%以上,纯化后的细胞活力随培养时间变化而发生变化,纯化后 7-8d 左右活力最高,此时最适宜进行细胞移植,12-14d 左右细胞活力开始下降,20d 后细胞活力明显下降。 二、建立大鼠 T9脊髓打击损伤模型 采用改良的 Allen 脊髓打击损伤模型,该模型制作简便、稳定,能较理想的模拟人脊髓损伤时所受的生物机械应力、病理生理特点及变化规律。脊髓打击损伤模型组织损伤的时空效应与人类脊髓损伤有较好的一致性,对研究神经元、胶质细胞等的病理变化及再生规律和相互作用,探索神经保护策略有很大的帮助。将上述培养纯化的 OECs 植入脊髓损伤腔,同时局部应用 NT-3。按治疗手段不同,将实验大鼠分为生理盐水对照组、NT-3 组、OECs 组和 OECs+ NT-3 联合应用组,观察。 三、OECs 和 NT-3 对大鼠脊髓损伤后损伤局部的保护作用 在上述模型上,8 周后,损伤脊髓节段取材进行 HE 染色和 GFAP 及 OX-42 免疫组织化学染色,发现 NT-3 组残存剩余组织面积比对照组 大,OECs 组脊髓残存剩余组织面积相对更大。但统计学分析表明,NT-3 组残存剩余组织占整个损伤平面的面积百分比与对照组相比无显著差别(p0.05),OECs 组与对照组相比,残存剩余组织占整个损伤平面的面积百分比明显增加(P0.05)。说明 OECs 对损伤组织有明显的保护作用,而本实验中 NT-3 的局部保护作用不显著。计数各组脊髓损伤节段中每(200×200 μm2)范围内 GFAP 免疫反应阳性的星形胶质细胞和 OX-42 免疫反应阳性的小胶质细胞的数目。结 - 3 -WP=8第二军医大学博士学位论文果显示 T9节段两种胶质细胞反应性增生较为明显,每个节段上,NT-3 组星形胶质细胞和小胶质细胞数目比对照组明显增加(P0.01),OEC 缩略词表5-6中文摘要6-10英文摘要10-15前言15-18第一部分 神经营养因子-3 和嗅鞘细胞对大鼠脊髓损伤治疗的协同作用18-59材料与方法19-32结果32-53讨论53-58结论58-59第二部分 神经营养因子-3 修饰的嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤的治疗作用59-89材料与方法59-68结果68-85讨论85-88结论88-8989-90 参考文献 90-96文献综述96-121致谢121-122附录:在读期间发表论文、著作和获奖情况122