【doc】 药物耳毒性损伤机制及caspase家族作用

【doc】 药物耳毒性损伤机制及caspase家族作用 药物耳毒性损伤机制及caspase家族作用 医ForeignMedicalSciences,November2005.vok29.N0.6365 药物耳毒性损伤机制及caspase家族作用 ? 综述:听力学? 马云鹏姜学钧暴继敏 摘要细胞凋亡是自然发生的细胞死亡过程,受基因调控,在多细胞生物的发育过程起重要 作用.caspase家族是一组结构特征相似的半胱氨酸蛋白酶,细胞凋亡的发生与caspase家族成员的 活化有直接关系.本文介绍caspase家族在药物致耳毒性损伤过程中所起的作用. 关键词细胞凋亡(Apoptosis);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases) 【药物耳毒性损伤机制】近年来,关于药物 耳毒性机制临床与实验研究报道颇多,这对于加强 对药物性致聋的防治有重要意义.临床常见的耳毒 性药物大致可分为抗生素类如氨基糖苷类抗生素; 非抗生素类如利尿剂,水杨酸类解热镇痛药,抗疟 药,抗肿瘤药,B阻滞剂和其他药物.以下就各类 耳毒性药物耳毒性机制的研究进展进行阐述. 1,抗生素类.氨基糖苷类抗生素是临床常用 广谱杀菌剂,主要抑制细菌蛋白质的生物合成,应 用于治疗结核及革兰氏阴性菌感染己40多年,对 耳蜗,前庭,肾脏,神经和肌肉阻滞等有毒性作 用.其中毒机理有多种学说如选择性内耳毛细胞中 毒学说,血迷路屏障学说,干扰细胞代谢学说和变 态反应学说等. 以庆大霉素为例具体说明其耳毒性机制.庆大 霉素可损伤听觉终末感受器,其耳毒性有明显的延 迟作用.可能为庆大霉素使毛细胞的蛋白质合成障 碍,影响糖代谢的糖原储存.其损伤特点为:首先 损伤基底周外毛细胞,向蜗顶发展,损伤程度由重 到轻.可能原因:?耳蜗底部血流最大,使循环药 物在局部浓度较高;?耳蜗上部回转的Corti器外 毛细胞较大不易被损伤,下部回转的Corti器外毛 细胞较小易被损伤;?耳蜗下部回转的蜗丛,螺旋 韧带,外淋巴腔均较上部回转大,所以氨基糖苷类 抗生素进出的量均较上部回转的多;?从种系发生 来说,内侧第一排外毛细胞的分化程度最高,功能 复杂.从与盖膜接触状态及基底膜振动的支点关系 上看,其受刺激最强,侵入的毒性物质对之最易 影响. 作者单位:110016沈阳,中国医科大学2002级硕士研究生 (马云鹏);中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(姜学钧);辽 宁省金秋医院耳鼻咽喉科(暴继敏) 通信作者:马云鹏(Email:thisismyp@sohu.com) 与庆大霉素相比卡那霉素对位听神经的毒性作 用有其自身的特点:?卡那霉素中毒后内耳的感觉 细胞首先受损,支持细胞的变性明显比毛细胞的变 性晚,螺旋神经节及神经纤维的变性更迟,说明内 耳感觉细胞的损伤是卡那霉素造成听力损害的根本 原因;?卡那霉素引起耳蜗侧壁cAMP减少,继而 造成血管纹功能障碍,导致内,外淋巴间水及电解 质的失调,是药物耳毒性作用的又一机制. 近年来的研究发现听觉感受与传人活动受内侧 橄榄耳蜗(medialolivocochlear,MOC)传出神经 系统的支配和调控,同时还发现氨基苷类抗生素 急,慢性耳中毒时MOC功能均出现明显损害,提 示氨基苷类抗生素耳中毒可能与听觉传出神经损害 有关….听觉传出神经受损机制中与其摄人大量 氨基苷类抗生素并结合在磷酯酰肌醇上,阻断三磷 酸肌醇(1,4,5-inositoltriphosphate,IP3)等第 二信使作用,影响传出神经能量代谢有关. 2,非抗生素类.利尿酸(依他尼酸)和速尿 (呋塞米)作用于肾小管,抑制水分的再吸收.少 尿的患者使用利尿剂后常发生严重的暂时眭听力损 失,也有不可逆者,成为永久性耳聋.如与氨基糖 苷类抗生素同时应用,致聋危险性更大.主要对肾 小管和血管纹作用,抑制Na,K,ATP代谢. 血管纹水肿多发生在边缘细胞和中间细胞之间,而 基底细胞之间的紧密连接仍保持完整,这提示水肿 液不可能来源于外淋巴,而取决于边缘细胞和中间 细胞间的许多复杂因素.边缘细胞水肿的出现和消 退与耳蜗功能受抑制的发生和恢复之间有明显关 系.边缘细胞水肿,胞浆内膜性结构大部分扩张, 而线粒体结构基本正常,这可能是速尿所致耳蜗毒 性能在短期内恢复的组织学基础. 顺铂(cisplatin)是临床上最常用的抗肿瘤药 物之一,有较强的抗肿瘤活性和一定的抑菌作用, 366ForeignMedicalSciences.November20o5.vo1.29.No.6 广泛应用于临床泌尿生殖系与头颈部恶性肿瘤的化 疗,但顺铂的毒副作用无疑限制了其临床用药剂量 和抗肿瘤疗效.近年国内外文献报道了很多其作用 机制,如内淋巴药物积蓄,内外淋巴液化学成份比 例失调,钙离子紊乱,能量代谢障碍,自由基损伤 (图1)以及近年来的细胞凋亡等学说.顺铂主 要聚集在耳蜗血管丰富区,应用后耳蜗功能最早改 变.后期变化是毛细胞损伤.顺铂对血管纹有损害 作用,特别是边缘细胞,主要是线粒体变性,水 肿,透明区及结晶形成J.其中对耳蜗微循环及 耳蜗神经毒性的损害是主要的病理生理变化之一. 图1顺铂内耳霉性司能机制 顺铂可引起耳鸣,发病率7%,持续时间数小 时至一周不等.顺铂亦可引起耳聋,双侧性,高频 损害最明显,在4000—8000Hz可有不对称,常于 用药后3—4天出现,轻者停药后即可恢复,重者 可致永久性耳聋. 奎宁及柳酸盐类可致螺旋神经节及基底膜病 变,毛细血管变细,变窄,酷似视网膜血管收缩, 缺血的变化.引起耳鸣,耳聋. 洗必泰可对耳蜗产生毒性,其损害特点是从外 3排,外2排毛细胞,向外l排毛细胞,内毛细胞 推进,而对内毛细胞的损害要迟得多,且程度较 轻.这可能由于感觉细胞的代谢能力最强,因此最 早受到耳毒性药物的损害. 【Caspase家族研究进展】细胞凋亡(apop- tosis)又称程序性死亡(programmedcelldeath, PCD)是自然发生的细胞死亡过程,受基因调控, 在多细胞生物的发育过程起重要作用.是细胞的自 稳平衡(homeostasis)机制对内外刺激因素的主动 应答反应,是借助”细胞丢失,正常细胞更新, 病理情况下清除异常或非法身份细胞”的生理平 衡,是维持多细胞器官完整性和稳定性所必需的. caspase家族是一组结构特征相似的半胱氨酸蛋白 酶,细胞凋亡的发生与caspase家族成员的活化有 直接关系.外源性及内源性的凋亡信号直接或间接 激活caspase酶,导致某些蛋白质的裂解进而引起 DNA断裂,染色质浓缩,细胞骨架与结构的破坏而 发生细胞死亡.caspase家族是PCD过程的关键元 件,它的激活与超常达均引起细胞凋亡,因此又 称死亡蛋白酶,他们通过与众多蛋白质因子的相互 作用调控细胞凋亡.因此,对于caspase及其与耳毒 性药物的毒性作用机制的关系的研究将有深远意义, 从而为基因治疗耳毒性损伤可能提供新的途径. 1.Caspase家族.到目前为止,caspase家族已 确定有l4个成员,它们是结构特征相似的同源蛋 白酶,这些半胱氨酸蛋白酶都是特异性地在底物的 天冬氨酸后切割肽键,故统一命名为caspase. “C”反映半胱氨酸蛋白酶(cyctoine,protease) 机制,’aspase’,表示其特异切割底物天冬氨酸( asparticacid,ASP)后的肽键功能,而caspase基因 则称为CASP. Caspase通常以单一多肽酶原形式存在,含有 一 个N端前域及一大,一小两个亚单位.在其内 部天冬氨酸残基酶解后,释放一大,一小两个亚单 位,这些亚单位组装成ft.:p:四聚体后形成活性酶 (图2).尽管caspase级联目前还未证实,但它很 可能是凋亡启动的最可能.靠近天冬氨酸残基 位置的切割使得caspase能够激活其它caspase,因 而caspase能够以类似于酶原激活方式相互激活, 呈级联放大效应.基于caspaseN端前域的长度, caspase可分为两组:caspase-l,_2,4,.5,-8,. lO有较长的前域,参与打靶和激活调控,称这组 caspase成员为调控caspase;caspase-3,-l5,_7,_9 含有较短的前域,在级联下游操作底物酶切,功能 上作为凋亡的效应子,称其为效应caspase_6J. 酶原活酶 AsptxAsptX 图2活性四聚体 Caspase家族在凋亡的执行阶段起主要作用, 凋亡的发生是一系列caspase家族成员共同参与完 成的J,它们的活性部位含半胱氨酸,ASP部位 产生特异性水解.目前,有lO种以上的caspase成 员相继被克隆J.在众多caspase成员中,caspase. 3被认为是各种凋亡刺激因子激活的caspase家族 中的关键蛋白酶,证据如下:?人类caspase-3全 长氨基酸序列与线虫最接近,被认为是CED-3在 国外医学耳鼻咽喉科学分册2005年l1月第29卷第6期OtolaryngologyForeignMedicalSciences,November2005,vo1.29.No.6367 哺乳动物中的真正对应者;?ICE敲除鼠并不影 响凋亡的发生,而Caspase一3敲除鼠神经系统及大 脑发育过程中的CPD被干扰;?特异性caspase一3 抑制剂在体外可引起组织凋亡的发生;(~)caspase一3 介导的凋亡在人体多种类型的细胞中普遍存在;? caspase-3可被该家族其它成员活化,简而言之, 多种多样刺激因素启动的信号激活caspase一3.活 化的caspase一3可作用于一些其它caspase成员,以 瀑布式活化引起细胞形态上的改变,使凋亡最终得 以完成.因此认为caspase-3是凋亡蛋白酶级联反 应的必经之路. 2.Caspase的激活和级联反应.死亡受体可通 过特异的”死亡配体”传递凋亡信号,在启动凋 亡中具有重要的作用.这些受体在与配体结合后的 数秒钟内可激活caspase而导致细胞在数小时内发 生凋亡.死亡配体属于TNF家族,包括FasL, TNF,淋巴毒素,CD一30L,4—1BB配体,CD40L, CD27L,TRAIL(TNF—relatedapoptosis—inducing ligand);死亡受体属于TNF受体基因超家族,胞 内有同类的序列称之为”死亡区域”.死亡区域可 使死亡受体激发细胞的凋亡.最具特点的死亡受体 是CD95(Fas或Apo1)和TNFR1(P=55, CD120a),其配体分别是FasL和TNF,另外还有 禽类的CARL,配体尚未知晓;死亡受体3(DR3, Apo3)?,与Apo3L(TWEAK)结合;DR4; DIL5(Apo2,TRAIL—R2,KILLER),后两者的配 体是Apo2L(TRAIL)?. 死亡配体与死亡受体结合后通过死亡区域激发 细胞凋亡机制.CD95L是同源三体,可与三个 CD95分子结合,因为CD95胞内的DD(deathdo— main)有相互串联的倾向,故CD95L导致受体DD 的串联.FADD(fas—associateddeathdomain或Mort1 ),可以通过自身的DD与串联的死亡受体DD结合. FADD含有一个”死亡效应区域(DED)”,该区域 与caspase一8酶原结构中与DED类似的区域结合, 而该DED是CARD(caspaserecruitmentdomain)的 一 种,多种caspase均发现有CARD,包括caspase一 2,caspase一8,caspase-9,caspase一10.pro—caspase一8 经过自身裂解而成为活化的caspase-8,并激活下游 的效应caspase,最终导致凋亡. TNF三体与TNFR1结合并诱导受体的DD串 联,而后者又与TRADD(TNFRassociateddeathdo— main)结合,TRADD再将信号传递给TRAF2(TN— FRassociatedfactor2)与FADD.前者与RIP(re— ceptor—in—teractingprotein)可导致NF—KB和JN AP一1的激活;后者则激活凋亡.TRAF2和RIP激 活NIK(NF—KB诱导的激酶),NIK再激活IKK(kB 激酶复合体抑制物),IKK能使I—KB磷酸化而导致 I—KB的降解,NF—KB得以释放并移人核中与特定 目的基因的KB部位结合而诱导基因转录从而抑制 凋亡的发生;而FADD与TNFRI—TRADD复合体结 合能激活caspase一8,从而激发并执行凋亡.DR3 的信号途径类似于TNFR1,与Apo一3L结合后通过 TRADD,TRAF2,RIP激活NIK进而活化NF—KB 以及通过TRADD,FADD导致凋亡. DR4和DR5的配体是TRAIL或Apo-2L.研究 发现FADD缺陷的细胞可耐受由CD95诱导的细胞 凋亡,但不能阻断由Apo2L诱导的凋亡,这提示 FADD非依赖性凋亡途径与Apo2L到caspase有 关l】.死亡配体与死亡受体激活pro—caspase一8变 为有活性的caspase一8,激活的caspase一8不仅可激 活下游效应caspase裂解多种蛋白质而最终导致细 胞凋亡,同时还可以降低线粒体内膜电位使Bcl-2 家族成员裂解,导致细胞色素C的释放?,后者 可与Apaf-1结合,在dATP的存在下活化caspase一 9,caspase-9能激活下游效应caspase,如caspase一 3l】.这样,caspase一8起到效应的放大作用. 不仅死亡受体/配体可激活caspase酶原,其他 因素如一射线,化学试剂,细胞毒试剂,细胞因 子的去除,颗粒酶B同样也可激活pro—caspase致 使细胞发生凋亡(图3). 存活因素缺失 信号TNF相关蛋白化疗药物 唧死释放 起始caspas船 效应caspas船 . ./下caspase一8(一10)caspase一 \/ 唧r执行凋亡 裂解凋亡调控因子 裂解看家蛋白 DNA断裂 图3Caspase的活化和级联反应 【Caspase家族与药物耳毒性损伤的关系】 一 直以来普遍认为,内耳感觉细胞损伤与药物的选 368国外医学耳鼻咽喉科学分册2005年l1月第29卷第6期 OtolaryngologyForeignMedicalSciences,November2005,vo1.29.No.6 择性内耳毛细胞毒性作用,血一迷路屏障,干扰细 胞代谢和变态反应等机制有关.近年来的研究显示 细胞凋亡在耳毒性作用中有重要地位.细胞凋亡的 发生与caspase家族成员的活化有直接关系, caspase家族是目前已知的细胞凋亡最关键的执行 因子,尤其是caspase一3.现在普遍认为细胞凋亡 是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶caspase级联 反应事件的结果,caspase一3被证实处于该级联反 应的下游,它通过降解细胞内相应底物使细胞死 亡,与其他下游的caspase成员可能是凋亡事件的 真正执行者.因此拮抗caspase一3级联反应有可能 抑制一些药物的内耳毒性作用,对于临床的用药选 择有相当大的实用价值.目前这方面的研究仍处于 初级阶段,有很光明的前景. 【前景与展望】上个世纪末人们逐渐注意到 了细胞凋亡在药物耳毒性机制中的作用,但其研究 处于初级阶段,没有实质性的进展.进入新世纪, 细胞凋亡的基础研究取得了巨大进展,人们认识到 了caspase家族是细胞凋亡的过程的关键因素.因 此,可以有针对性地激活caspase或抑制caspase来 防止或拮抗药物的耳毒性.相信随着对caspase家 族的结构,特性及其在凋亡中作用的不断深入了 解,将有助于人类最终逐步明确认识内耳损伤机 制,并有效地寻找到内耳损伤的防护与治疗方法. 参考文献 1.HensonMM,XieDH,WyrmeRH,eta1.Thecourseanddistributionof medialefferentfibersintheCOChleaofthemustachedbat.HearRes, 1999,102(2):99一l15. 2.WatanabeK,JinnouchiK,Y8giDetectionofsinglestrandedDNA (SSDNA)inthevestibuleofguineapigsaftertheapplicationofcis— platinum(CDDP).AnticancerRes,2001,21(2A):35-40. 3.MeechRP,CampbenKC,HughesLP,eta1.Asemiquantitativeanaly— sisoftheeffectsofcisplatinontheratstriavasculari~HearRes. 1998,124(1-2):4449. 4.KohnS,FradisM,PodoshinL,eta1.Endotheliainjuryofcapillariesin thestriavascularisofguineapigstreatedwithcisplatinandgentami— cin.UltrastmcturePathol,2002,21(3):289-296. 5.李小明,孙志贤.细胞凋亡中的关键蛋白酶.Caspase-3.国外医 学分子生物学分册,1999,21(1):6_8. 6.VillaP,KaufmannSH,EarnshawWC.Caspaseandcaspase inhibitors.TIBS,1997,22(9):388-398. 7.EnariM,SakahiraH,YokoyarnaH,eta1.AcaspaseactivatedDnase thatdegradesDNAduringapoptosis,anditsinhibitorICAD.Nature, 2001,391(6662):43-50. 8.GregoliPA,BondurantJ.FunctionofCaspasesinregulatingapoptosis causedbyerythmpoietindeprivationintrythroidpmgenitom.Cell Physiol,1999,178(2):133—136. 9.ZhanY,VandeWaterB,WangY,eta1.Therolesofcaspase-3and bcl-2inchemically??inducedapoptosisbutnotnecrosisofrenalepi— thelialcells.Oncogene,1999,18(47):65o5_6513. 10.ChinnaiyanAM,ORourkekApo3andcellapoptosis.Science. 1999,274(7):990-992. 11.PittiRM,Robe~MP.Caspaseresearchpmgress.JBiolChem,1999. 271(56):12687—12690. 12.YehWC.FADDandceilapoptosis.Science,2001,279(34): 1954.1958. 13.JianrongL,ChristopherA.FunctionofCaspasesandinhibitors.JBio Chem,1999,274(24):17325—17333. 14.ShougangZ,LynchMC,KochevarIE.Caspase-8functioninapoptosis progress.ExpCellRes,2000,250(2):203-212. (收稿日期:2005-02-02)