论文资料-加洲鲈鱼诺卡氏菌病的初步研究-（word）可编辑

论文资料-加洲鲈鱼诺卡氏菌病的初步研究-（word）可编辑 池塘养殖加州鲈鱼诺卡氏菌病的初步研究 121杨治国，郭国强,王振华 (1信阳农业高等专科学校，河南信阳 464000) (2 洛阳师范学院，河南洛阳 471022) 摘要:首次中国大陆地区加州鲈鱼诺卡氏菌病的发生情况。病鱼体表出血、溃烂，肌肉、 心脏、肝脏、肾脏、脾脏、生殖腺、肠系膜等布满大量直径1-20 mm的黄白色结节。从病鱼 内脏组织的结节中分离培养出短杆状或细长杆状有分枝的革兰氏阳性、弱抗酸菌体。用分离 菌株作回归感染，证实分离菌为加州鲈鱼的病原菌。对病原菌的基本生物学特性进行了研究， 确定病原为诺卡氏菌(Nocardia sp.)。 关键词:加州鲈鱼;诺卡氏菌病;池塘养殖 中图分类号:965.322 文献标识码:A 文章编号: Preliminary study on nocardiosis in pond-cultured large-mouth black bass，Micropterus salmonoides 121Yang Zhi-guo，Guo Guo-qiang，Wang Zhen-hua (1 Xinyang Agricultural College，Xinyang，Henan 464000) (2 Luoyang Normal University，Luoyang，Henan 471022) Abstract: In October 2006，A similar bacterial tuberculosis broke out in pond-cultured large-mouth black bass (Micropterus salmonoides) in Shunde，Guangdong Province，China Main(The disease subsequently broke out from September to October 2009, in pond-cultured large-mouth black bass in Nanyang in Henan Province. Here, the affected fish body weight were . Multiple yellowish white nodules (granulomas), varying in size from 1 to 20 mm in 450 to 600 g diameter, are scattered throughout the muscle, heart, liver, spleen, ovary, and mesenteries. Pure bacteria were isolated from liver and kidney in diseased fish, use of Lowenstein-Jensen medium. Experimental infection indicated that the isolated bacterium was the pathogen responsible for the mortalities. Based on the growth characteristics，morphological，physiological，and biological properties of the bacterium，the isolated were identified as Nocardia sp.( Keywords:Micropterus salmonoides; Nocardiosis ; pond-culture 加州鲈鱼学名大口黑鲈(Micropterus salmonoides)，为北美洲太阳鱼科鱼类，自上世纪80 年代引进中国大陆后，发展很快，现已成为淡水名特优养殖品种之一。2006年10月，河南省 信阳市某酒店从市场购进一批加州鲈鱼，加工过程中发现鱼肌肉中有许多5-10mm的白色坏 死结节，涂片检查发现，坏死结节中有大量革兰氏阳性、杆状、丝状、有分支的菌体，初步 判断为细菌性结节症。追踪调查显示，该批鱼来自广东省顺德池塘养殖，因此，我们就没有 做进一步的研究。2009年9-10月，河南省南阳市鸭河口水库霍姓养殖户池塘饲养的加州鲈鱼 发生连续死亡，病鱼类似2006年所见加州鲈鱼，体表出血、溃疡，严重者出现瘘管致死;病 收稿日期:2010-05-15; 修回日期: 1 作者简介:杨治国(1964-)，男，河南尉氏人，副教授，研究方向:水产动物病理与病害。 1 鱼内脏、肌肉中有许多黄白色结节，二个月累积死亡率约12%。霍姓养殖户自述2002-2004年在广东顺德某渔场打工，2005年回乡养殖加州鲈鱼，养殖技术参照广东顺德模式，2009年11月诊断时每公顷存塘量尚有3万余千克。为了尽快搞清此病发生的原因，找到有效的防治方法，作者对其病原及防治药物进行了研究，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 病鱼来源 病鱼于2009年11月采自河南南阳池塘养殖的加州鲈鱼，体重450,600g。 1.2 病原菌分离 取发病症状典型的濒死病鱼，带回实验室用70,的酒精棉球反复擦拭消毒病鱼体表，用无菌剪刀打开腹腔，无菌操作取肝、肾、脾组织上的结节，划线接种于罗-詹氏(LÖwenstein-Jensen)平板和TAS培养基，30?培养7天，挑取形态特征一致的优势菌落用罗-詹氏平板纯化备用。 1.3 回归感染 在125cm×45cm×55cm的水族箱中，每箱放养体重400-500g的健康加州鲈鱼10尾，连续充气，暂养1天后进行口灌、注射、创伤浸泡和浸浴感染。实验鱼在26?2?条件下观察，每天换水1/3，发现死鱼及时捞出，解剖检查肌肉和内脏器官的病变，同时进行细菌再分离。 1.4 腹腔注射感染 8 挑取罗-詹氏平板30?培养10天的培养物，以无菌生理盐水制成1.2×10CFU/mL(在波长625nm处的吸光值为0.15)菌悬液，以腹腔注射0.5mL/尾的方法进行感染。对照组注射同量无 菌生理盐水。 1.5 口灌感染实验 实验鱼每尾口灌1mL菌悬液，对照组口灌同量无菌生理盐水。 1.6 创伤浸泡感染 以无菌镊子快速撕掉试验鱼臀鳍上方左右侧鳞片各5-6片，将创伤后的鱼放入含菌量约 5为2.4×10 CUF/mL的暴气自来水中暂养观察。对照组不加菌液。 1.7 浸浴感染 选择体表无损伤的健康加州鲈鱼放入暴气自来水中，加入2ppm高锰酸钾消毒，24h后换5水加入菌悬液，使含菌量约为2.4×10 CUF/mL，暂养观察。对照组不加菌液。 1.8 病原体鉴定 纯分离物在罗-詹氏平板上划线30?培养7天观察菌落形态。参照文献1-7的检测项目，检测细菌的酶类产生、水解活性、营养源及温度、盐度耐受性等生理生化特征。检测试剂盒购于杭州天和微生物试剂有限公司。 1.9 药敏试验 采用常规纸片法进行。接种病原菌 于穆-欣氏琼脂(Mueller-Hinton agar， MHA)培养基上，贴上药敏纸片，30? 培养96h后，测抑菌圈直径，抑菌圈大小 取平均数。所用化学疗剂药敏纸片购于 杭州天和微生物试剂有限公司。 2 结果 图1 病鱼肌肉中的大量大型坏死结节和 2.1 病鱼症状及流行情况 肝脏、脾脏、肾脏组织中的点状结节 病鱼发病初期体表无明显症状，仅 2 行动迟缓，食欲下降，离群上浮。随着病情发展，体表出现出血、溃烂、鳞片脱落，部分病鱼眼睛膨胀外突、腹部膨胀，严重病鱼的体表形成脓肿或瘘管，随后逐渐死亡。解剖检查，部分病鱼有腹水，病鱼肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、生殖腺、肠系膜等有明显的病变，布满大量直径1-20 mm的黄白色结节(图1)，将结节内含物作涂片镜检，发现大量有分枝的短杆状或细长杆状的革兰氏阳性菌体，Ziehl-Neelsen抗酸染色呈弱阳性反应。 该病发生于秋季(9-10月)，主要危害成鱼。霍姓养殖户养殖面积1/3公顷，存塘加州鲈鱼 病病程缓慢，二个月累积死亡率约约1.1万千克，经解剖检查统计，群体发病率约33%。该 12%，经济损失严重。 2.2 细菌分离 加州鲈鱼肝、肾、脾组织上的结节在罗-詹氏平板和TAS平板上划线，30?培养，在TSA平板上4天出现白色砂粒状有皱折隆起的菌落，在罗-詹氏平板上7天出现微黄色颗粒状有凸起的菌落。将菌落涂片观察，两种平板分离的培养物与直接用结节内含物涂片镜检所见菌体相同。 2.3 病原性 人工接种实验结果表明，分离物对加州鲈鱼有致病性(表1)。腹腔注射接种后7天体表出现出血症状，13天出现首尾死亡，21天后全部死亡，剖检症状与自然发病相同。创伤浸泡接种后4天体表出现溃疡，11天出现瘘管，16天出现首尾死亡，42天累积死亡率85%，剖检存活鱼内脏都有大量黄白色结节。口灌感染组死亡1尾，剖检症状与自然发病相似，暂养结束剖检存活鱼只，内部器官正常。浸浴感染及各对照组无死亡，剖检鱼只内脏器官正常。 从发病鱼只病灶分离的细菌其菌落、菌体形态和生理生化特性与从自然发病鱼只分离的细菌完全一致。 表1 回归实验结果 42日累积剂量接种后首次出现 菌液浓度死亡率 实验尾数组别 (CUF/mL)(mL)死亡的时间(d)死亡尾数(%) 8注射 10，10 1.2×10 0.5 13 20 100 注射对照 生理盐水10 0.5 — 0 0 8口灌 10，10 1.2×10 1.0 19 1 5 口灌对照 生理盐水 10 1.0 — 0 0 5创伤浸泡 10，10 2.4×10 — 16 17 85 创伤浸泡对照 — 10— — 0 0 5浸浴 10，10 2.4×10 — — 0 0 浸浴对照 10 — — — 0 0 2.4 病原菌生物学特性 分离菌MSN09生长缓慢，好氧，30?时在TSA平板上4天出现可见菌落，7天后菌落呈白色砂粒状，有皱折隆起;在罗-詹氏平板上7天出现菌落，10天后菌落呈微黄色颗粒状，有凸起。 菌体革兰氏染色阳性，弱抗酸，呈杆状、丝状或细长分支状，直径0.3-1.0μm，长2-5μm，丝状体可达5-50μm。不运动，不产生孢子。4.5% NaCl 生长，40?C不生长。 病原菌氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，还原硝酸盐，水解尿素、七叶灵和睾酮，不水解明胶、酪素、黄嘌呤、腺嘌呤，能利用柠檬酸盐和醋酸盐，具有诺卡氏菌的生理生化特征(表2)，与Nocardia asteroides基本相同。 根据病原菌的形态、生长和生理生化特征，确定从加州鲈鱼坏死结节病灶分离的病原菌属于诺卡氏菌(Nocardia sp.)。 表2 分离菌株的生理生化特性 3 MSN09MS06MSN09 项目项目MS06 革兰氏染色Gram + + 麦芽糖Maltose ? ? 抗酸性染色Acid-fast (+) (+) 棉子糖Raffinose N ? 运动性Motility ? ? 鼠李糖Rhamnose N ? 氧化酶Oxidase ? ? 蔗糖Sucrose ? ? 过氧化氢酶Catalase + + 海藻糖Trehalose N + 硝酸盐还原Nitrate + + 木糖Xylose N ? 水解: 甘油Glycero + + 酪素Casein N ? 肌醇Inositol ? ? 酪氨酸Tyrosine ? ? 甘露醇Mannitol N ? 尿素Urea + (+) 山梨醇Sorbitol N ? 七叶灵Esculin + + 赤藓醇Erythritol N ? ? ? 半胱氨酸L-Cysteine 明胶Gelatin + N 苯丙氨酸 ? ? NN黄嘌呤Xanthine L-Phenylalanine 次黄嘌呤HypoxanthineN ? 醋酸盐Acetate N + 腺嘌呤Adenine N ? 柠檬酸盐Citrate + + 生长:睾酮Testosterone N + 利用: 20?C N + 水杨苷Salicin N ? 30?C + + 纤维二糖Cellobiose N ? 35?C N + 阿拉伯糖Arabinose ? ? 37 C N + 葡萄糖Glucose + + 40?C N ? 果糖Fructose N + 4.5% NaCl + + 注:+，阳性;(+)弱阳性;?，阴性;N，没有检测。 2.5 药敏试验 分离菌MSN09在MHA上生长良好，30?培养96h后能清楚判断抑菌圈大小。MSN09对青霉素、四环素耐药(表3)。 表3 药物敏感实验结果 纸片判读抑制纸片判读抑制 药名 药名 含量效果含量标准效果 链霉素Streptomycin10 ug?15 22S 卡那霉素Kanamycin30 ug?18 22S 青霉素G Penicillin G —R 30 ug 12R10 U?15四环素Tetracycline?19 庆大霉素Gentamicin 21S 氟苯尼考florfenicol 28S 10 ug?1530 ug?19 红霉素Erythromycin15 ug?23 46S 土霉素oxytetracycline30 ug?19 32S 注:R指耐药, S指高度敏感.—表示无抑菌圈,前面的数字表示抑菌圈的直径,单位为mm。 4 3 讨论 水产动物的诺卡氏菌病首见于观赏鱼类。1962年Conroy and Valdez从霓虹灯鱼(Paracheirodon innesi)分离到一株致病性类结核杆菌，该菌对叉尾斗鱼(Macropodus opercularis)和毛足鲈 (Trichogaster trichopterus)也有致病性，但对金鱼无致病性，后来该菌 [7]被R.E. Gordon鉴定为Noc. asteroides。目前已知的对水产动物有致病性的诺卡氏菌还有Noc. [3-5]Salmonicida、Noc. Seriolae和Noc. crassostreae等。 steroids存在于淡水和土壤中，一般认为只感染受伤的鱼体，属于偶发的慢性疾病，Noc. a [6]群体发病率低，死亡率也不高。从本研究回归实验结果分析，腹腔注射和创伤浸泡接种的发病率为100%，浸浴接种感染未成功，也表明诺卡氏菌只感染受伤的鱼体;而口灌接种感染的一尾鱼，则可能是由于接种操作导致的创伤所致。天然水体中诺卡氏菌的含量并不高， [8]且在清洁水体中仅能生存几天，但在污染的水体中生存期则延长。王国良等(2005)报告自然情况下网箱养殖大黄鱼感染诺卡氏菌(Noc. Seriolae)是由于网箱养殖的集约化程度高，养 [10]殖密度大，鱼体容易损伤，体质下降，给病原菌提供了致病机会。 Chen(1992)报告加州鲈鱼感染Noc. Seriolae引起结节症，认为诺卡氏菌是一种机会致病 [9]菌，当养殖鱼类体质虚弱、免疫力低下时，通过呼吸或饵料而感染。本研究从加州鲈鱼分离的病原与Chen的研究结果不同，其生理生化特征与Noc. asteroides基本相同，这可能与加州鲈鱼的养殖模式不同存在着某种关联。广东省是我国加州鲈鱼养殖的主产区，2006年广东佛山市加州鲈鱼养殖面积3489公顷，产量70627吨，其中顺德区养殖面积2662公顷，产量59383吨。顺德区加州鲈鱼养殖模式的特点是养殖单产越来越高，1/15公顷产4000千克早已不是奇迹，相应的养殖病害增多也是不争的事实。养殖者为减少病害损失，除有条件大量换水外，大量使用水质改良剂和底质改良剂以维持所谓的可接受水质状态，而目前市售的底质改良剂多含有诺卡氏菌及其产物，可以推测这和加州鲈鱼发生诺卡氏菌病存在关联。因此，加州鲈鱼高密度养殖池发生诺卡氏菌病与使用含有诺卡氏菌及其产物的底质改良剂之间的关系是值得探讨的一个课题。 诺卡氏菌感染受伤的鱼体，预防的关键在于防止受伤。治疗成功的病例仅限于还能摄食的病鱼。观赏鱼诺卡氏菌病可在饲料中添加磺胺二甲基异恶唑2mg/g治疗，至少喂10天，最好喂21天。1999-2001年，日本曾用卡那霉素治愈Noc. seriolae感染症。在养殖实践中也发现 [7]一些分离菌株抗红霉素、北里霉素和螺旋霉素。 本研究是中国大陆地区首次报告加州鲈鱼诺卡氏菌病。徐益军等(2007)曾报告池塘养殖 [11]乌鳢的诺卡氏菌病。表明我国淡水鱼类诺卡氏菌病有多发趋势，应引起病害监测机构的关注。由于诺卡氏菌病病情缓慢，在发病前期无症状或症状不明显，持续时间长，给该病的早期诊断和防治带来极大困难，损失严重，故有必要对淡水鱼类诺卡氏菌病的病原菌分类鉴定、快速检测、致病机理和防治技术等方面作进一步研究。 参考文献: [1] 刘志恒，姜成林(放线菌现代生物学与生物技术[M](北京:科学出版社(2004(77-80( [2] Kurup, P. and Schmitt, J. Numerical taxonomy of Nocardia. Canadian Journal of Microbiology，1973，19, 1035–1048. [3] Kudo, T., Hatai, K. and Seino, A. 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