【doc】 改良羊水细胞原位培养和传代培养法——附208例羊水染色体分析

【doc】 改良羊水细胞原位培养和传代培养法——附208例羊水染色体分析 改良羊水细胞原位培养和传代培养法—— 附208例羊水染色体分析 第25卷第9期Vo1.25,No.9 2005年9月S印.2005 生殖J;i避孕 Reproduction&Contraception randc@sippr.stc.sh.cn 改良羊水细胞原位培养和传代培养法 —— 附208例羊水染色体分析 沈国松张娃何平亚杨岳洲邱惠麒卢宝庭 (浙江省湖州市妇幼保健院产前诊断中心,湖卅i,313000) 【摘要】目的:建立一种操作简便易于推广的羊水细胞原位培养及传代培养方法.方法:抽取208 例孕16—23周孕妇的羊水,离心作原位培养,6d后换液,换下的上清液传代培养,原位培养和 传代培养在观察到多个细胞集落和较多圆形细胞时直接在原位收获制片分析.结果:208例羊水 全部培养成功,并发现多例异常.其中199例经原位培养即获得足够 分日,培养时间6-9d,平 均7d,平均每例分裂相>100个,一般8-10d报告结果;94~’J由于原位培养不能获得足够分裂相或 实验过程失误等而依靠传代培养,培养时间12-15d,16—18d报告结果.结论:羊水细胞原位培 养法较传统胰酶消化法染色体分裂相多,分带清晰,核型完整,成功率高,出报告时间短等优点, 传代培养后收获的细胞可做为前者的补充或其它研究. 关键词:羊水;原位培养;传代培养:染色体:产前诊断 中图分类号:R394.33文献标识码:A文章编号:0253-357(2005)090568?02 羊水脱落细胞培养及染色体核型分析是目前应 用广泛的一种产前诊断方法,传统的胰酶消化法… 收获的细胞由于经消化剥离及多次离心等步骤,所 得结果往往不很理想.我们在吸取多方经验基础 上,经研究,建立了一种简便易行的原位培养幂II 传代培养方法,现报告如下. 1与方法 1.1资料 2003.01-2004.10来我院产科就诊的有产前诊断 适应症的孕妇共208例. 1.2方法 1.2.1标本采集于孕16-23周,B超监视下,用一次 性穿刺包(7针)经腹抽羊水,一般抽25ml羊 水,分装两管(Falcon无菌离心管,美国Becton 通讯作者:沈国松;Tel:+86.572.2056965; E-mail:sgssjf@yahoo.com.cn - 568一 一 a己一 DickinsonLabuare公司生产). 1.2.2原位培养上述离心管1000r/min离心 10min,吸出上清液作生化检测,留1rnl左右羊 水和细胞沉淀轻轻混匀,吸入培养瓶中(25cm: Falcon培养瓶,美国BectonDickinsonLabuare公司 生产),加4m1F10培养基,CO2培养箱培养6d, 取山换液,并观察贴壁生长情况,如贴壁细胞不 多,应多次换液. 1.2.3传代培养第一次换液时换下的上清液吸入 另一培养瓶中,加入4mlF10培养基,继续培养, 6d后取出观察贴壁生长情况,并换液直至可收细 胞为J 1.2.4细胞收获当有多个生长良好细胞集落, 在倒置显微镜下观察到贴壁生长有较多圆形和双圆 形细胞时为佳.此时加秋水仙素40ktl(20I.tg/m1), 继续培养5h,倒出上清液后直接在原瓶中加入低 渗液(枸橼酸钠:KCL=I:1)7ml,作用45min, 加入定液(甲醇:乙酸--3:1)1ml预固定 5min,弃上清液,继续在原瓶中加固定液7m1. 作用30rain,重复两次,用电铬铁和斜口钳把培 养瓶支解,将培养瓶瓶底直接制成染色体片子, 并过火10次. 1+2.5分带染色制片次日8O?烤片3h后即可分 带,胰酶终浓度O.36mg/ml,消化2min,Giemsa染 液染10rain,片子干燥后计算机分析系统辅助分析. 2结果 图1和图2是羊水原位培养后获得的染色体核 型.208例羊水细胞培养全部成功,成功率100%, 每个病例经原位和传代培养先扁制片4张,染色体核 型数平均每例?100个.其中199例经原位培养即 成功报告结果,培养时间6-9d,平均7d,一般8—10d 即报告结果;9例经传代培养,培养时间12—15d, l6—18d出报告结果.208例羊水中共发现21.三体 2例,18-三体2例,平衡易位3例,染色体多态 性2例,2O.三体嵌合体1例,详见1. 圈1微镜羊水染色体核型00×20倍) 表1 染色体核型 46,XY 46,XX 47.XY.+2I 47,XX.+21 47.XX.+I8 45,XY,一I3,一I4,+r0b(I3;I4) 46,XY,t(1;2) 46,XY,t(15;22) 46,XY,I5P+ 46.XY,YP+ 46,XX/47,XX,+20 3讨论 羊水细胞主要来源于胎儿皮肤,消化,呼吸 道等脱落细胞,细胞大部分是衰老和固缩的,这 使羊水细胞培养较其他组织培养(如外周血细胞, 皮肤细胞)更为困难【:J.传统的胰酶消化法收获的 细胞,由于经过剥离和分带时两次胰酶消化和多次 离心,收获的细胞染色体分带清晰度欠佳,染色 图2.例47,XX,+18核型图 体核型也经常不完整,从而使实验的成功率降低. 由于羊膜腔穿刺是有损伤性的取样技术[3】,一旦失 败,孕妇较难接受第二次取样,所以一次成功极 为重要.下面是我们研究中的一点心得: 穿刺时采用一次性无菌腰麻包,使用方便, 碰到特殊病例时可立即采样,采样针为7针,对 孕妇创伤小,即使前壁胎盘也不易造成血性羊水, 208例羊水穿刺中仅一例较明显血性羊水,未见羊 膜腔感染,流产或培养污染.培养基和培养条件 是培养成功的关键,我们使用市场上出售的F10培 养基粉剂,经济实惠,使用时用精心选择的注射 用水稀释,使培养基保持最适pH,接种时瓶口管 口过火,严格保持无菌,碰到血性羊水加入一滴 肝素,防止红细胞凝聚,培养6d后换液,在换 液前用无菌生理盐水洗涤2—3次,再加新鲜培养 基,适时收获,能得到满意结果. 核型分析成功的关键是染色体核型能否分散开 且分散均匀,其中低渗条件的掌握是非常重要的因 素.我们在实践中发现冬天需加热操作台和延长低 (下转第575页) 一 569- 卯叭,?2??? SpecialProgramProgressinHumanReproductionResearch. SwitzerlandWHO,l997,p.42—51. 【23】符良.国际.生新概念?生殖健康中国实用妇科与产 科杂志,l999,15(1):l8. 【24]陈炳II_I.生殖健康及其主要影响因素.中国妇幼保健,2000, 15(11:55. 【25】张丽珠,临床生殖内分泌与不育症.j匕京:科学出版社,2001, P.443. 【26】高道利,陈霞飞,洪秀翎.六万新婚妇女初孕率和不孕率 调查.中华妇产科杂志,l989,24(4)234-5. 【27】方可娟,邓新清,高尔生.1976—1985年中国初婚妇女不孕 率分析.生殖与避孕,l992,12(3):48.53. (上接第569页) 渗时间.片子制成后过火也是使染色体有效分散的 重要步骤. 我们对每1例都做了传代培养,换液下来的上 清液中有未贴壁的悬浮细胞和贴壁生长后掉下来的 分裂圆球形细胞,据美国疾病控制中心细胞遗传室 的经验,这种上清液可以连续传代培养5次都有细胞 收获.我们在传代培养6d后观察贴壁生长情况, 换液,收获细胞,能得到跟原代培养同等的效果. 208例羊水全部成功报告结果,成功率100%,其 中199例通过原位培养就得到足够分裂相,占95.7%; 9例需通过传代培养才得到足够的分裂相,占4.3%. 通过原位培养和传代培养(每例各接种2瓶),使每 个病例可得到2—4张片子,需要时还可继续传代. 使实验成功率人大提高. 208例中共发现异常染色体核型lO例,异常率 4.8%,跟文献报道相近【】.其中2例21.三体,2 例18.三体和1例2O.三体嵌合体均为产前筛查高风 险胎儿;3例染色体平衡易位胎儿,都是由于其父 母有不良孕育史.查外周血染色体发现一方有平衡 [28】葛秦生,张觉生.大连地不自流行病学调查.生殖腹学 杂志,l992,1(1):I2-5. 【29】林宏益,Ifj{锡萍.河北省男性不育抽样调查.生殖学杂 志,1994,3(3):l73—6. 【30】贺昌海,不孕不育现代诊治技术.一【海:复大学出版 社,2003.P.1. 【3l】NielsESkakkebaek,HenrikMoiler.Riskoftesticularcan— cerinsubfertilemen:case?controlstudy.BMJ,I999,318 (27):559?62. f32】江鱼,益鑫,李世勤等.542例正常生育力男子的精液 分析.生殖与避孕,l987,7(4):22—9. (2005年4月25日收稿J 易位携带,本次怀孕后做产前诊断;2例染色体 多态性胎儿父母外周血染色体具有相同核型. 我们建立的改良原位培蒹和传代培养法方法简 便,获得的羊水染色体核型多且完整,分散均 匀,分带清晰,出报告时间短,传代培养获得的 细胞可作为原位培养的补充.也可作其它研究. 参考文献: [】】马长俊,陈园荼,霉沛丹.羊水培养与染色体制片与.法.生 殖与避孕,I985,5(1):53--4. 【2】许由恩.遗传病的产前诊断与优生卜海:【:海科学技术出 版社.1985,p,96.7. 【3】Lu&HsuCD.Elevatedamnioticfluidnucleosomelevels inwomenwithintra-amnioticinfection.ObstetGynecol, l999,94(1):7-l0. [4】PeterBenn&LillianYF.Thecentralizedprenatalgenet- icsscreeningpmgramNewYorkCity:thefirst7000cases. AmJMedGenet,l985,20(2):369-72. 《现代妇产科进展》20O6年变更刊期的通知 (2005年2月7日收稿) 《现代妇产科进展》杂志,是由中华人民共和国教育郎主管.1IJ东大学主办的国家级学术期刊.着名妇产科专家江 森教授任主编.创刊10余年来一贯执行”理论联系实际,普及与提高相结合的办刊原则”,始终奉行”慎审校,不骄傲, 广求教”的编辑方针,不断完善自我.提高办刊水平.自I999年始分别被列入中国科技核心期刊(中国科学技术信息 研究),中国医学核心期刊(中国医学科学院医学情报信息研究).中文核心期刊?妇产科学类(《中文核心期刊要目 总览》2004版).为进一步办好这个栏目,扩大倩息量,增加稿件利用率,保护广.大作者的投稿热情.自2006年《现 代妇产科进展》杂志由原来的双月刊改月刊,改办月刊后,办刊方针不变.欢迎广大读者积极投稿!欢迎订阅《现代妇 产科进展》!邮发代号;24.104.2006年全年订价l96元,每期订价:8.00元,邮局全年订阅.编辑部地址:山东 省济南市文化西路107号,邮编:250012电话l053l-82169201. —— 575——