医学论文-亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP

医学论文-亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞达p38MAPK和MCP 医学论文-亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和 MCP 【关键词】 亚硒酸钠;p38丝裂原活化蛋白激酶;单核细胞趋化蛋白 Role of sodium selenite in regulating expressions of p38MAPK and MCP1 in rat mesangial cells 【Abstract】 AIM: To observe the effect of sodium selenite on expressions of p38 mitogenactivated protein kinase (p38MAPK) and monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) in rat mesangial cell line HBZY1, and to study the mechanism of sodium selenite in preventing diabetic nephropathy. METHODS: Cell line HBZY1 was incubated with high glucose, high insulin, H2O2 and advanced glycosylation end products (AGEs), respectively (control group); simultaneously, the cell line HBZY1 pretreated with sodium selenite was also incubated with the above factors (experimental group). The expressions of p38MAPK and MCP1 were detected and compared in the 2 groups. RESULTS: Four factors increased the expressions of p38MAPK and MCP1 indepently; sodium selenite inhibited the expressions of p38MAPK and MCP1 by the 4 factors distinctly. CONCLUSION:Sodium selenite can suppress the expressions of p38MAPK and MCP1 in the cell line HBZY1, which suggests that sodium selenite may play a significant role in the prevention of diabetic nephropathy by the inhibition of the expressions of p38MAPK and MCP1 in the cell line HBZY1. 【Keywords】 sodium selenite; p38 mitogenactivated protein kinase; monocyte chemoattractant protein1; mesangial cells; diabetic nephropathy 【摘要】 目的: 观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1表达p38 丝裂原活化蛋白激酶:p38MAPK:和单核细胞趋化蛋白1 (MCP1)的影响,从而 研究硒在防治糖尿病肾病:DN:中的作用机制. 方法: 分别以高葡萄糖、高胰 岛素、过氧化氢和糖基化终末产物:AGEs:刺激HBZY1细胞;先给予100 nmol/L亚硒酸钠预处理后,再分别以上述4种刺激因素孵育HBZY1细胞,分别 检测HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达并比较. 结果: 4种刺激因素均可作 为独立因素,导致HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达量增加;亚硒酸钠能抑制上 述4种因素所致的p38MAPK和MCP1的表达. 结论: 亚硒酸钠通过抑制 p38MAPK和MCP1在HBZY1细胞的表达, 从而有效防治DN的发生发展,表明硒 在DN的防治过程中发挥积极作用. 【关键词】 亚硒酸钠;p38丝裂原活化蛋白激酶;单核细胞趋化蛋白1; 系膜细胞;糖尿病肾病 【中图号】 R587.24 0引言 近年来国外研究表明单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein1,MCP1)与糖尿病肾病:diabetic nephropathy, DN:有密切关系,1,. p38MAPK是细胞信号传递的交汇点或共同通路,2-3,,但它在DN发生中的作用及其与MCP1关系仍不十分清楚;硒是机体必需微量元素之一,其缺乏可加剧DN的氧化应激,并可产生拟高血糖病理状态,从而加剧DN的发生发展,4,. 但其是否作用于p38MAPK和MCP1国内外未见文献报道. 我们分别给予高葡萄糖(HG)、高胰岛素(HI)、过氧化氢(H2O2)和糖基化终末产物(AGEs)孵育HBZY1细胞,观察HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达以及亚硒酸钠对HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达的影响. 从而明确二者在DN形戎中的作用及硒在防治DN中的作用机制. 1材料和方法 1.1材料大鼠肾小球系膜细胞系:HBZY1,中国典型培养物保藏中心CCTCC:;新生牛血清、RPMI 1640培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:二抗::北京中山生物技术有限公司:;亚硒酸钠(Karolinska Institute 赠送);柱离心式总RNA抽提试剂盒、RTPCR两步法试剂盒、PCR相对分子量标准:TaKaRa公司:; PCR引物合戎:上海博亚生物技术有限公司:,蛋白质相对分子量标记物:BioRad公司:;磷酸化p38MAPK兔多抗:(Promega公司). 1.2方法 1.2.1细胞系HBZY1的培养HBZY1细胞常规培养于200 mL/L RPMI 1640培养液中,培养条件为37?,饱和湿度50 mL/L CO2,每2~3日用0.2 g/L乙二胺四乙酸:EDTA:消化传代. HBZY1细胞长满培养瓶底40%后分为9组,以无血清培养液饥饿24 h, 然后按实验分组加入刺激:及干预:因素. 1.2.2体外制备AGEs参考文献,5,,按牛血清白蛋白:bovine serum albumin, BSA: 50 g/L,与葡萄糖90 g/L,0.5 mmol/L EDTA及0.2 mmol/L PBS :pH 7.4:混匀后过滤除菌,37?恒温培养箱卵孵育60 d. 0.1 mol/L PBS :pH 7.4:中透析48 h,测定蛋白含量及荧光强度,分装后存于-80?冰箱保存备用. 1.2.3实验分组分别以一定浓度HG, HI, H2O2和AGEs刺激细胞系HBZY1一定时间;先给予亚硒酸钠100 nmol/L预处理HBZY1细胞48 h后,再分别以上述4种刺激因素:浓度、时间同前:孵育HBZY1细胞,同时设对照组. 分组情况如下: ? 对照组:用等体积PBS培养细胞; ? HG组:用25 mmol/L葡萄糖刺激HBZY1细胞72 h; ? HI组:用100 nmol/L胰岛素刺激HBZY1细胞24 h; ? H2O2组:用100 μmol/L H2O2刺激HBZY1 细胞1 h; ? AGEs组:用100 mg/L AGEs刺激HBZY1细胞6 h; ?亚硒酸钠+HG组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和25 mmol/L葡萄糖分别刺激HBZY1细胞48 h和72 h; ?亚 硒酸钠+HI组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和100 nmol/L胰岛素分别刺激HBZY1细胞48 h和24 h; ? 亚硒酸钠+H2O2组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和100 μmol/L H2O2分别刺激HBZY1细胞48 h和1 h; ? 亚硒酸钠+AGEs组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和100 mg/L AGEs分别刺激HBZY1细胞48 h和6 h. 1.2.4RTPCR法检测MCP1 mRNA表达以柱离心式总RNA抽提试剂盒提取细胞系HBZY1总RNA,测定总RNA浓度,计算纯度,A260 nm/A280 nm均在1.8,2.0之间. MCP1引物序列按文献,6,:上游引物: 5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′;下游引物: 5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′, 扩增片段长度258 bp. βactin引物序列:上游引物: 5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′;下游引物: 5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′,扩增片段长度228 bp. 以两步法RTPCR试剂盒进行反转录扩增,扩增条件:94?变性30 s,55?退火1 min,72?延伸1 min,共35个循环,72?最后延伸7 min. 每次PCR反应至少重复3次. PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳,结果经图象分析系统扫描存图,并对目的条带进行密度分析. 1.2.5Western blot法检测p38MAPK蛋白表达培养的细胞系HBZY1,经4?胞浆蛋白提取液裂解,提取物在冰上孵育2 h,然后12 000 g 4?离心10 min,沉淀加入4?预冷核蛋白提取液,震荡混匀,冰浴1 h,再12 000 g 4?离心30 min,取上清为核蛋白,其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量. 磷酸化p38MAPK表达量采用Western blot法检测,核蛋白中加入等体积2×上样缓冲液煮沸5 min. 进行10 mol/L SDSPAGE,将蛋白转至PVDF膜后用5 g/L BSA室温下封闭2 h,分别用1?2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4?孵育过夜,用PBS充分洗涤,再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1?5000,37?孵育1 h,用PBS充分洗涤,DAB显色试剂盒显色. 结果经图象分析系统对目的条带进行扫描存图并进行密度分析. 统计学处理:资料采用SAS 8.0进行统计分析,组间两两比较用非参数统计分析,P<0.05即认为有统计学差异. 2结果 2.1细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析, HG,HI,H2O2和AGEs均可作为独立因素使细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达量均明显增加:P<0.01,表1,图1:. 表1各组细胞系HBZY1 MCP1 RTPCR和磷酸化p38 MAPK Western blot半定量结果:略: 2.2细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达细胞系HBZY1磷酸化p38 MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分, HG,HI,H2O2和AGEs均可作为独立因素激活p38MAPK,使细胞系HBZY1磷酸化p38 MAPK蛋白表达明显增加:P<0.01,表1,图2:. 图1RTPCR法检测各组细胞系HBZY1 MCP1 mRNA和βactin mRNA表达:略: 图2Western blot法检测各组细胞系HBZY1磷酸化p38 MAPK蛋白和βactin蛋白表达:略: 2.3细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达 以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析. 亚硒酸钠预处理后,再分别给予以上4种刺激因素孵育细胞系HBZY1,可见MCP1 mRNA表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组明显减少:P<0.01,表1,图1:. 2.4细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达的影响HBZY1细胞磷酸化p38 MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析. 先以亚硒酸钠预处理细胞系HBZY1后,再分别给予上述4种刺激因素刺激细胞系HBZY1,可见磷酸化p38 MAPK蛋白表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组显著减少:P<0.01:,但与对照组比较仍有显著差异:P<0.01,表1,图2:. 3讨论 本研究结果显示HG, HI, H2O2和AGEs均可单独诱导细胞系HBZY1,使其MCP1 mRNA表达量明显增加. 4种刺激素诱导HBZY1细胞MCP1 mRNA表达增加的机制,结合文献和实验结果我们认为有以下几点:? 高糖有直接刺激MCP1 mRNA及蛋白表达增高的作用,该作用是PKC,MAPKs所介导,这可能是DN时肾小球中单核巨噬细胞浸润的重要原因; ? 大量AGEs可以和系膜细胞上的AGEs受体:RAGE:相互作用,使IκB磷酸化而导致NFκB激活;新近的研究表明,8,,AGEs与AGEs受体:RAGE:相互作用可消耗细胞内谷胱甘肽,产生大量的氧自由基,从而导致细胞内信号传导改变,激活核转录因子NFκB/AP1. 同时NFκB也是调节RAGE表达的一个启动子,它的位点1和位点2的激活可使RAGE表达上调,NFκB的激活作为一种正反馈,又进一步促进了AGEs与RAGE的结合,导致NFκB的持续活化,而活化的NFκB可以上调MCP1 mRNA和蛋白表达,从而在糖尿病所致肾脏损害中发挥重要作用; ? 过氧化氢可导致系膜细胞氧化应激加剧,诱导细胞内ROS产生,从而迅速激活NFκB,上调MCP1表达,在DN发生发展早期起重要作用,8,; ? HI可能是通过激活PKC,MAPKs信号通路,引起系膜细胞氧化还原状态发生变化,使细胞内ROS产生增加,导致NFκB激活,从而使MCP1表达上调. MCP1介导糖尿病肾小球损伤. MCP1不仅对血液中单核细胞有很强的趋化活性,也能通过激活转录因子NFκB和AP1来诱导非炎症细胞产生细胞因子和黏附分子,在诱导单核细胞迁入内皮下间隙及渗入肾小球的过程中起重要作用,7-8,;同时,渗入到肾小球的单核巨噬细胞反过来又刺激局部肾小球细胞,在巨噬细胞衍化生长因子如PDGF和TGFβ等作用下导致系膜增生和细胞外基质聚集;此外通过炎症细胞因子作用,还可上调黏附分子和趋化因子的分泌,从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球,7,. 近年来通过细胞实验及对人和实验动物DN的研究发现, MCP1在DN的发病机制中起重要作用. p38MAPK可被多种细胞外刺激激活,导致细胞生长、增殖、分化和调控某些因 子表达,9-11,. 本研究以糖尿病时存在的4种应激因素孵育大鼠肾小球系膜 细胞系HBZY1,可见p38MAPK被激活,磷酸化表达增加. 硒是机体必需微量元素之一,是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组戎部分,缺硒可 出现拟高血糖症病理状态,引起白蛋白尿和肾小球硬化,从而加剧DN的发生发 展;补充硒不仅可预防氧化应激,而且可防止肾脏损伤,4,12,. 本研究结果 还显示,亚硒酸钠具有类似p38 MAPK抑制剂所产生的作用,其机制可能是:? 通过保护系膜细胞免遭氧化损伤而抑制MCP1的分泌;?通过抑制p38 MAPK信 号通路而抑制MCP1在系膜细胞的表达. 表明亚硒酸钠可能通过抑制p38MAPK而 延缓DN的发生发展,但亚硒酸钠是否通过抗氧化而抑制p38 MAPK亦或作用于 信号通路的其它环节尚需进一步深入探讨,提示硒在防治DN发生发展过程中发 挥着积极作用. 【参考文献】 ,1, Banba N, Nakamura T, Matsumura M, et al. Possible relationship of monocyte chemoattractant protein1 with diabetic nephropathy,J,. Kidney Int,2000,58(2):684-690. ,2, Sakai N, Wada T, Furuichi K, et al. Involvement of extracellular signalregulated kinase and p38 in human diabetic nephropathy,J,. Am J Kidney Dis, 2005,45(1):54-65. ,3, Xu ZG, Kim KS, Park HC, et al. High glucose activates the p38 MAPK pathway in cultured human peritoneal mesothelial cells,J,. Int Soc Nep, 2003, 63(3):958-968. ,4, Reddi AS, Bollineni JS. Seleniumdeficient diet induces renal oxidative stress and injury via TGF,beta,1 in normal and diabetic rats,J,. Kidney Int, 2001,59(4):1342-1353. ,5, Makita Z, Vlassara H, Ceramic A, et al. Immunochemical detection of advanced glycosylation end products in vivo,J,. J Boil Chem, 1992, 267:5133-5138. ,6, Lynn EG, Siow YL, Karmin O. Very lowdensity lipoprotein stimulates the expression of monocyte chemoattractant protein1 mesangial cells,J,. Kidney Int,2000,57(4):1472-1483. ,7, Christiane V, Ralph D, Fei J, et al. MCP1 induces inflammatory activation of human tubular epithelial cells: involvement of the transcription factors, nuclear factor,kappa,B and activating protein1,J,. Nephrology, 2002, 13(6): 1534-1547. ,8, Ha HJ, Yu MR, Jin CY, et al. Role of high glucoseinduced nuclear factor,kappa,B avtivation in monocyte chemoattractant protein1 expression by mesangial cells,J,. J Am Soc Nephrol,2002,13(4):894-902. ,9, Wilmer WA, Dixon CL, Hebert C. Chronic exposure of human mesangial cells to high glucose environments activates the p38MAPK pathway,J,. Int Soc Nep, 2001, 60(3): 858-871. ,10, Dai T, Natarajan R, Nast CC, et al. Glucose and diabetes: Effects on podocyte and glomerular p38MAPK, heat shock protein 25, and actin cytoskeleton,J,. Kidney Int, 2006,69(5):806-814. ,11, 张坚,李圣青,戚好文,等. p38MAPK在大鼠急性肺损伤模型中的 表达及抗氧化剂NAC的影响,J,. 第四军医大学学报,2004,25:15:: 1353-1355. ,12, Sheng XQ, Huang KX, Xu Hb, et al. New experimental observation on the relationship of selenium and diabetes mellitus,J,. 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