纳豆激酶的纯化及性质研究

膏 血 监——一 — — 纳豆激酶的纯化及性质研究 吕 莹 张 露 冯 雷 李 虹 郭家荣 (中国食品发酵工业研究院，北京，100027) 摘 要 从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶，采用盐析、疏水层析、离子交换层析等，对 提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，活性酶蛋白为单一组分，并 测得其分子质量为28ku。纳豆激酶在pH5．0～10．0，4～37*(2范围内具有较好的稳定性，其纤溶活 性可被0．1mmol／L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验明，纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原 激活剂。 关键词 纳豆激酶，枯草芽孢杆菌，纯化，性质 纳豆激酶(nattokinase，NK)是由枯草芽孢 杆菌(Bacill“s subtilis)产生的一种具有强烈 溶栓功能的酶，本质上是一种碱性丝氨酸蛋白 酶。1987年，由日本的须见洋行n】等首先发现 纳豆中存在该酶。它具有安全性好，作用迅速， 成本低，有望成为继尿激酶、链激酶、重组组织 型纤溶酶原激活剂(t-pA)后的新一代溶栓 剂 J。本实验室筛出一株产纳豆激酶活力较 高的枯草芽孢杆菌，经固态发酵后对所得到的 纳豆激酶进行纯化，并对其性质进行了初步研 究。 1 材料与方法 1．1 菌种及培养基 枯草芽孢杆菌，由实验室筛选。 发酵培养基：浸泡、蒸煮后的大豆。 1．2 试 剂 丙烯酰胺购自Sigma公司；甲叉双丙烯酰 胺购自Fluka公司；蛋白质分子量为上海 东风化学试剂厂产品；PMSF(苯甲基磺酰氟) 购自北京欣经科生物有限公司；牛血纤维蛋白 原、凝血酶、尿激酶(标准品)，中国药品生物制 品鉴定所产品。蛋白质电泳系统购自北京市六 一 仪器厂。 1．3 蛋白质的含量测定 采用 Bradf0rd 法，以牛血清白蛋白为标 第一作者：硕士，助理工程师。 收稿时间：2003一l1—2O (122) 准蛋白。 1．4 酶纤溶活性的测定 参照Astrup[ J方法。制备纤维蛋白平板， 用微量加样器注射样品(10 L)于平板中，于 37℃恒温箱内放置 17 h，测溶圈的垂直直径。 以尿激酶标准品作标准曲线。加热纤维蛋白平 板的制作[引：按上述方法制得的平板于85"C温 箱中加热 1 h，冷凝后即成不含纤维蛋白溶酶原 活性的平板。 1．5 电泳分析 酶的纯度用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定【6 ；分离胶浓度为 12％，浓缩胶浓度为 3％，考马斯亮蓝R一250染色。 2 实验结果 2．1 纳豆激酶的分离纯化 采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 对纳豆激酶进行纯化，得到白色的纳豆激酶粉 末。SDS-PAGE显示活性成分为单一区带(图 1)。利用该纯化流程，从 180 g湿纳豆中可得 4．7 mg活性蛋白，每毫克蛋白活力达 5663．3 u／mI ，纯度提高5．8倍，回收率为45．2％(见 表1)。 2．2 纳豆激酶的性质 2．2．1 分子质量 在分离胶浓度为12％的SDS-PAGE中，无 维普资讯 http://www.cqvip.com M一分子量标准；1-粗酶液；2-盐析； 3一阴离子交换层析；4-阳离子交换层析 图1 纯化过程中SDS-PAGE 凝胶电泳图 表1 纳豆激酶的分离纯化 论有无还原剂 p一巯基乙醇，纳豆激酶均呈现一 条区带，说明纳豆激酶为单亚基蛋白质，计算其 分子质量为28 ku(如图2)。 a b 图2 纳豆激酶的SDS-PAGE a一分子质量标准；b一纯化的纳豆激酶 2．2．2 pH稳定性 室温下1 h，NK在pH5．0～11．0范围内稳 定，pH 4．0时残余活力为25％。室温下24 h， NK在pH5．0～10．0范围内稳定，pH 11．0时 残余活力不足 5％。最适 pH为 9．0(活力达 116％，以pH 7．4为100％)。 2．2．3 热稳定性 NK经 60℃、2 h的加热即完全丧失活性， 50℃下放置7 h残余活力为18％，37℃下放置 48 h后仍保持约78％的活性，4"C放置6个月、 室温放置 1个星期未见活性明显下降，说明 NK具有较好的热稳定性。但液态酶在一20℃ 放置 3个月活性损失 90％，一80℃冷冻2．5h 活力下降约30％。 2．2。4 抑制剂 NK的纤溶活性可被0．1mmol／L的PMSF 完全抑制，1mmol／I 的 EDTA和 2％SDS对 NK活性无任何抑制作用。 2．2。5 体外纤溶性质 由于市售的纤维蛋白原试剂中往往混有少 量的纤溶酶原，因此无法断定纳豆激酶的作用 是直接溶栓，还是间接激活纤溶酶再作用。实 验中将配好的平板经85℃，1 h加热，破坏纤维 蛋白平板中混杂的纤溶酶原，结果尿激酶本身 不形成溶圈，而与纤溶酶原混合后则出现纤溶 活性。与之不同的是，NK在加热平板上仍形 成溶圈，而与纤溶酶原混合后纤溶活性并未提 高。在未加热平板上，加入纤溶酶原的 NK与 不加入纤溶酶原的NK溶圈相同，而加入纤溶 酶原的尿激酶与不加纤溶酶原的尿激酶溶栓活 性相比有所提高。由以上 2个实验结果说明， NK是一种纤溶酶，而不是纤溶酶原激活剂(如 图3)。 A普kaigVd~蛋白平板 B加热纤维蛋白平板 1一纳豆激酶(100u／mL)；2-纳豆激酶(100 u／mI )和纤 溶酶原(13U／mL)；3-尿激酶(60U／mL)和纤溶酶 原 (13 U／mL)；4-尿激酶(60 U／mL) 图3 含有纤溶酶原活性的平板和不含纤溶酶 原活性的平板上纳豆激酶的活性 3 讨 论 实验中发现，NK为一种具有直接溶栓功 能的纤溶酶，与参考文献[1]中报道的结果一 h 伽 邶 龇 维普资讯 http://www.cqvip.com — — — — 致。另外，体外溶栓实验中，NK在加热平板上 显示的溶栓活性比未加热平板的活性高。分析 原因是加热后改变了不溶性纤维蛋白原的结 构，使点入的样品更易于渗透，形成的溶圈比未 加热平板的溶圈大且模糊。 2 3 4 参 考 文 献 Simi H，Hamada H，Tsushima H et a1．A novel fibri— nolytic enzylne(noottokinase)in the vegetable cheese natto, a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]．Experientia，1987，43：1 110～ 1 111 陈志文，徐尔尼，肖美燕．纳豆激酶的研究进展[J]． 食品科技，2002，(2)：66～68 Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utiliz— ing the principle of protein-dye binding[J]．Am Biochem，1976，72：1 105～1 112 Astrup T，Mullertz S．The fibrin plate method for as— timating fibrinolytic activity[J]．Arch Bioehem Bio— phys，1952，40：346～351 5 王 骏，王 敏，王以光．链霉菌产生的新型纤溶 酶的纯化和性质研究【J]．生物工程学报，1999，15 (2)：147～152 6 萨姆布鲁克丁，弗里齐E F，曼尼阿蒂斯T著，金冬 雁译．分子克隆实验(第二版)[M]．北京：高等 教育出版社，1993 7 Pekka Mmantsala．Howard Zalkin．Extracellulat and membrane-bound pmteases from Bacillus subtilis[J]． Journal of Bacteriology，1980，141(2)：493～501 8 Mitsugu Fujita，Keiichi Nomura，Kyongsu Hong et a1．Purification and characterization of strong fibri— nolytic enzyrne(nattokinase)in the vegetable cheese nooho, apopular soybean fermented food in Tapan [J]．Biochemical and Biophysical Research Communi— cations，1993，197(3)：1 340～1 347 9 Wonkeuk Kim，Keehyun Choi，Yongtaek Kim et a1． Purification and characterization of a fibrinolytic en— zyme produced from Bacillus sp． strain CK 1 1-4 screened from Chungkook—Jang[J]．Applied and Envi— ronmentM Microbiology，1996，62(2)：2482～2488 Purification and Characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis Lti Ying Zhang Lu Feng Lei Li Hong Guo J iarong (China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing，100027) ABSTRACT A nattokinase extracted from natto was purified by ammionium sulfate fraction precipi— tation，hydrophobic interaction colum and ion exchange colum．The molecular weight of this enzyme was 28 ku by SD PAGE．The fibrinolytic activity of NK is stable at pH 5．0～10．0 and 4～37℃． The activity can be entirely inhibited by 0．1 mmol／L PMSF．The fibrinolytic experiment in vitro indi— cated that nattokinase is a fibrinolytic enzyme instead of a plasminogen activator． Key words nattokinase，Bacillus subtilis，purification，characterization 保健品必须达到GMP认证 从2003年10月10日起，国家食品药品监督管理局完成了与卫生部的交接，正式开展保健食品的 审批工作。根据规定，今后保健品产品要做人体实验，必须通过严格的实验过程，才有可能发放产品批号。2004年 3月底前，没达到GMP认证的保健品业不允许生产销售保健品。在保健品实施“放心工程”的过程中，从注册、 GMP认证、市场监管、标准认证、直销管理等诸多环节还将出台一系列新政策。 ■ 敷簟进纛标准 胁 维普资讯 http://www.cqvip.com