类胡萝卜素高产菌Y11的鉴定及培养条件的优化

塑墼 堕 —————————————————～ 类胡萝卜素高产菌Yll的鉴定及培养条件的优化 郭 秒 ， 陈金全 慕跃林 黄遵锡 1(云南师范大学生命科学学院，昆明，650092) 2(首都医科大学宣武医院老年医学研究所，北京，100053) 摘 要 Y11菌株分离自高原湖泊深水层，生长pH范围广，利用的碳、氮源种类多，且耐受一定的 NaCI、磷酸盐和硫化物，经鉴定为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。通过正交实验，确定了优 化的培养基12 成分：NH4C1 2g；乙酸钠2g；KH2PO4 0．1 g；MgSO4·7H2O 0．01 g；Na2c()3 0．1 g；酵 母膏0．5 g；无机盐0．05mL，水1 000mL，pH 7．0。在12 培养基中，Y11菌株的生长量较高，为类 胡萝 的提取打下基础。 关键词 高原湖泊，光合细菌，类胡萝 素，鉴定 光合细菌中的紫色非硫类群是一类广泛分 布于自然界的微生物，由于其具有易培养、色素 含量高等独特的生理生化特点，被越来越多地 应用于天然色素的开发。据文献报道⋯，在深 水湖泊中10 1TI深度以下生活的光合细菌，由于 依靠类胡萝 卜素吸收到达水层的450～550 RID_ 的蓝绿光，可以优先在胞内大量合成类胡萝 卜 素，往往比浅水和土壤中的光合细菌中类胡萝 卜素含量高，适合进行开发。作者从云南高原 深水湖泊阳宗海 13m水层分离获得 1株优良 光合细菌，命名为Y11菌株，对其进行了菌种 鉴定和生理生化特性研究，并通过正交实验获 得了最佳培养条件，为进一步从该菌中提取类 胡萝卜素打下基础。 1 与方法 1．1 菌株来源 使用深水采水器由阳宗海 13 m水层中采 样。 1．2 分离和纯化(9#培养基) NH4Cl1 g，KH2PO4 0．2 g，丁二酸钠 1 g， MgSO4-7I-I2O 0．005 g，Na2CO3 0．2 g，酵母膏 0．1 g，复合无机盐溶液 1 mL，水 1 000 mL，pH 7．0。 复合无机盐溶液：EDTA 0．5 g，FeSO · 7H2O 0．2 g，ZnSO4‘7H2O 0．01 g，MnCI2‘4H20 第一作者：硕士研究生。 收稿时间：2004 03—04 0．003 g，硼酸 0．03 g，CaCI2。2H2O 0．02 g， NiCI2‘6H20 0．002 g，CuCl2‘2I-I2O 0．001 g， Na2MoO4‘2H2O 0．003g，水100mL，HCI调pH 3．0。 1．3 培养条件 厌氧条件下，30℃，800～1 500 lux光照强 度下培养。 1．4 分离和纯化方法 采用滤纸压印法分离，采用深层小试管和 夹层平板法纯化。 1．5 生理生化特性测定和菌种鉴定 依照参考文献[2]进行。 1．6 活细胞吸收光谱的测定 菌液4 000 r／min离心30min，用生理盐水 洗涤菌体2～3次，悬浮于60％的蔗糖溶液中， 使用岛津 UV2401 PC紫外光谱分析仪在300 ～ 1 000 nm范围测定吸收光谱。 1．7 培养基的正交优化 先采用单因子实验，再选择进行正交优化。 1．8 不同培养基中Y11生长的比较 以5％的接种量，分别在不同配方的培养 基中光照厌氧30℃培养5d，定时取样测定660 nm的 0D。 2 结果与讨论 2．1 形态和培养特征 (73) 维普资讯 http://www.cqvip.com 赭 Yll菌株在液体深层小试管中培养5 d，菌 液颜色变化趋势为：无色一淡粉色一粉红色一 红色。在夹层平板上培养3～5 d，菌落为0．5 mm的圆形、光滑的小红点。光学显微镜下菌 体为杆状，大小约(0．5×1．0)／J．m，极生鞭毛，具 运动能力，行二分分裂。 2．2 生理生化特征和细菌鉴定 2．2．1 对碳、氮源的利用 Y11菌株可以利用多种小分子有机化合物 作为碳源和氮源(见 1)，包括多种糖类和有 机酸。这说明Y11菌株对基质利用广泛，有很 大的应用潜力。 表 1 Yll菌株对碳、氮源的利用能力 碳氮源 菌株 YI1 碳氮源 菌株 Y11 葡萄糖 ++ 谷氨酸钠 +++ 果 糖 + 丁二酸钠 +++ 蔗 糖 +++ 乙酸钠 +++ 木 糖 ++ 甘氨酸 ++ 乙 醇 ++ 淀 粉 + 丙三醇 ++ (NH4)2SO4 ++ 琥珀酸钠 +++ NaNO2 ++ 柠檬酸钠 +++ N}{dCl +++ 苹果酸钠 +++ 蛋白胨 +++ 酒石酸 + NaNO2 一 +++表示生长旺盛，++表示生长良好，+表示可以生 长， 表示不可以生长。 2．2．2 生长因子 YI 1菌株生长不需要在培养基中添加生物 素一类的任何生长因子，生长需求十分简单。 2．2．3 对磷酸盐、NaCl和硫化物的耐受性 Y11菌株可以耐受4％的磷酸盐、4％以下 浓度的NaCI，也可以耐受1％以下的硫化物，对 高浓度有机物的耐受能力很好。 2．2．4 pH值范围 Y11菌株在5．0～9．0的pH范围都可以 生长，如表2所示，在6．5～7．5之间生长最旺 盛。 2．2．5 活细胞的吸收光谱 Yl1菌株在380、590、800、860 rim有细菌 叶绿素a的吸收峰，其类胡萝 卜素的吸收峰值 为 475、500、530 nm。 2．2．6 不同光照、通气条件下 Y11菌株生长 量的比较 如表4所示，Y11菌株在30℃、厌氧条件 下，以白炽灯为光源时生长最好；其次是以日光 灯为光源，厌氧培养；在黑暗、好氧条件下，菌株 生长速度最慢，且没有色素生成。 表 2 Yll菌株生长的pH范围 菌株— —i —百 —i — 了～— — 一 — 了— —_ 『一— Y11 — 0．016 0．024 0．03 0．799 1．091 0．726 0．563 0．076 0．023 一 一 表示不能生长，内的数字为在660niT,．处测定的OD值。 表3 Y11菌株的光谱吸收峰值 菌株 光谱吸收峰值／rim Y11 380 475 500 530 590 g00 860 表4 不同光照、通气条件下Y11菌株生长量的比较 对照上述实验结果，查伯杰细菌鉴定手册， Y11为紫色非硫菌科的红细菌属的类球红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)。 2’．3 正交实验优化培养基 2．3．1 单因素实验 2．3．1．1 不同碳源对菌株生长的影响 根据碳源利用实验，选定如表5几种碳源 (74) 进行实验。通过单因素碳源实验结果，决定采 用乙酸钠为碳源，有以下几个原因：光合细菌可 以很好地利用乙酸钠，且效果比9 培养基中的 丁二酸钠效果好；乙酸钠来源广泛，价钱便宜， 500g丁二酸钠和柠檬酸钠的售价分别为61．2 元和23元，而等质量的乙酸钠的售价只有 13 元，适合大规模的生产需要；文献报道，乙酸盐 具有促进光合细菌去除NH 、NQ 的作用，且 乙酸盐对杂菌生长又一定的抑制作用(表5)。 2．3．1．2 不同碳源浓度对菌株生长的影响 据图1可以看出，0．2％的乙酸钠浓度下菌 株生长得最好，而过量的乙酸钠浓度反而会抑 制混合菌株的生长。 维普资讯 http://www.cqvip.com 表5不同碳源对Yll菌株生长的影响 多会抑制混合菌株的生长。 2．3．1．3 不同氮源对菌株生长的影响 选用氯化铵为氮源。虽然蛋白胨为氮源生 长更好，但是500g蛋白胨售价是等质量的氯化 铵的近 10倍，从大生产角度考虑，选取便宜且 效果也不错的氯化铵。 表6 不同氮源对Y11菌株生长的影响 乙酸钠浓度／％ 图 1 不同乙酸钠浓度对 Y11生长影响 2．3．1．4 不同氮源浓度对菌株生长的影响 如图2，NH4Cl的最适添加量为0．2％，过 图 2 不 l司氯化铵浓度对 Y11生长影响 2．3．1．5 复合无机盐溶液添加量对菌株生长 的影响 无机盐的添加与否对混合菌株的生长影响 很大，添加少量无机盐的培养基可以使混合菌 株在短期内迅速生长；不添加无机盐混合菌株 也可以生长，但是培养初期速度很慢，且最终的 菌液浓度不如添加无机盐的高。如表7，确定 无机盐的添加量为0．05％。 2．3．1．6 酵母膏添加量对菌株生长的影响 酵母膏的添加可以提高混合菌株的生长速 度，但大量的添加容易造成污染，如表 8，最佳 添加量为0．03％。 2．3．1．7 Na，C03浓度对菌株生长的影响 培养基中添加Na2CO3的原因是：它可以 提供厌氧光照条件下进行光合作用的所需要的 C07，并且可以缓冲培养基的pH值。如表9， 最适添加量为0．01％。 表7 无机盐添加量对 Yll菌株生长的影响 (75) 维普资讯 http://www.cqvip.com 表9 Na2COa浓度对 Y11菌株生长的影响 2．3．1．8 MgSO 浓度对混合菌株生长的影响 素的产生，如表 10，最适添加量为10mg／L。 MgSO 的添加可以促进菌株的生长和色 表 10 MgSO4浓度对Yll菌株生长的影响 2．3．1．9 KH2PO4浓度对混合菌株生长的影 响 KH2PO 的添加可以稳定培养基内的pH， 但是大量添加会抑制菌体生长。如表11所示， 最适添加量为0．01％。 表 11 KH2PO 浓度对Yll菌株生长的影响 2．3．2 正交实验 基为：A1B2C3D1。即最佳培养基为： 根据单因素实验的结果，设计了3水平4因 表14 方差分析表 素的正交分析表 引，如表12，实验结果如表13。 表 12 正交分析表 实验号 A 钠 B N H ％ 4a 膏 。 盐 OD ／ 。 ％ ／％ 由表 14看出，因素A和因素C对实验结 果影响特别显著。对因素A，最大数是 K。；对 因素C，最大数是K3，因此选择A。C3。对于因 素B和D选择最大数K2和K ，因此最佳培养 (76) 其中F0 05=9．55，F0 0l=30．82 NH4C1 2 g，乙酸钠 2 g、KH2PO4 0．12g、MgSO4 ·7H2O 0．01g、Na2CO3 0．1g，酵母膏0．5g，复 合无机盐溶液 0．5 mL，水 1 000 mL pH 7．0。 被命名为12#培养基。 2．3．3 Y11菌株在9#和12#培养基中生长曲 线的比较 分别将 Y11菌株以5％接种量接人9#和 12#培养基，在30℃、光照厌氧条件下培养，定 时取样测定 660 nm处的 0D值。由图 3可以 看出，在第4 d，2个培养基中的 019值即有明 显的差异，到第10d，菌株在12#培养基中的生 长(019=1．127)比9#培养基中(019=0．813) 019提高0．314。 与报道的培养光合细菌最多的培养基相比 (如表 15)，对于Y11菌株，12#培养基有着明 显的优势。 维普资讯 http://www.cqvip.com 1 5 E 1 、r (J 5 0 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 时间／d 图3 两种培养基培养复合菌液的比较 3 小 结 文中报道了1株从云南高原湖泊——阳宗 海13 m层分离的光合细菌Y11，经鉴定为类球 红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)。由于所处 生活环境比较特殊，Y11菌株含有丰富的天然 色素，适合培养用于类胡萝 卜素的提取。通过 单因素和正交实验优化了Y11菌株生长的培 养基，使 OD值从0．813增加到1．127，类胡萝 卜素粗制品的提取率为 51．5 mg／g(另文报 道)，大约为360．5 mg／L，和国内外报道的产量 (一般在 0．5～45 mg／g)相比，名列前茅，为进 一 步开发天然色素打下基础。 表 15 Y11菌株在不同的培养基中的生长状况 参 考 文 献 3 诸葛健，王正详．工业微生物实验技术手册[M]．北 京：轻工业出版社，1994 1 刘如林．光合细菌及其应用[M]．北京：中国农业 4 Weaver P F，Wall J D Gest H·Characterization of 科技出版社，1991 Rhodopesudornonus capsulata[J]-Arch Microbiol， 2 东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M]．北 1975，105：207～216 京：科学出版社，2001 5 郑士民．自养微生物[M]．北京：科学出版社，1983 Identification of the High Yield Bacteria Y1 1 and the Optimization of Its Culture Conditions Guo Miao ·2 Chen Jinquan Mu Yuelin Huang Zunxi 1(College of Life Science，Yunnan Normal University，Kunming，650092) 2(Medical Institute of Geratology，Capital Medical University Xuanwu Hospital，Beijing，1 00053) ABSTRACT Y1 1，a strain to produce high yield of carotenoid，was isolated from the water of plateau lake．It is seen that this strain can grow in a wide range of pH and it is highly resistant to NaCI，phos— phate and sulfides．It can utilize many kinds of carbon and nitrogen sources．It is identified as Rhodobacter sphaeroides．Through experiments，the best culture media 12 is as follows：NH4CI 2g； CH3COONa 2g；KHEPO4 0．1 g；MgSO4。7H20 0．01 g；Na2CO3 0．1 g；yeast extract 0．5 g；complex inorganic salts(10×)0．5mL and water 1 000mL，pH 7．0．Yl1 strain grew well in 12 culture with high yield of biomass． Key words plateau lake，photosynthetic bacteria，carotenoid，identification ． 意 包羲概辘珊攀 垦羹 魏境鸶 赫 据意大利自动化包装机械制造商协会(UCIMA)最新数据统计，2003年意大利自动化包装机械行业成 。 绩不俗，销售额达到29亿欧元，比上一年增长了2_8％；出口达23．7亿欧元，比上一年增长了1．3％，出口 率达81．7％。意大利包装机械行为近年来对中国的出口出现强劲增长，2003年出口额达1．65 855亿元，比上一年 增长了31．3％，并取代德国成为中国包装机械进口排行榜上的第一名。同时，中国在意大利包装机械目标出口市 场上的排名上升至第4位，前3位分别是美国、法国、德国。 (77) 维普资讯 http://www.cqvip.com