基因探针快速检测食品中单增李斯特氏菌

柏 潮 技 7I【■ 基 因 搽 针 快 逮 检 测 食 品 中 单增 李 斯 犄 氏 茵 翁文川 李志勇 胡科锋 易敏英 许龙岩 (广州出入境检验检疫局 广州 ·510623) 摘要：应用 AccuProbe基因探针方法快速检测食品中单增李斯特氏茵(Listeria monocytogenes)， 结果表明，采用该基因探针方法检测食品中单增李斯特氏菌特异性强，对食品中单增李斯特氏 菌鉴定时间仅需 30min，采用增菌肉汤检测低限为 7．5×10 cfu／mL。对 206个样品检测结果表 明，AccuProbe基因探针方法可快速准确地检测食品中单增李斯特氏茵。 关键词：单增李斯特氏茵；基因探针 中图分类号：TS207．4 文献标识码：A 文章编号：1005—9989(2003)O1—0075—03 Rapid Detection of L．mo~ ogenos in Foodstuffs by Gene Probe Methods WENG Wen—chuan LI Zhi—yong HU Ke—feng YI Min—ying XU Long—yan (Guangzh~ Entry—E)(it Inspection＆Quarantine Bureau，Guangzhou，510623) Abstract：R d detection of Listefia mone~ ogenes in foodstuffs by AccuProbe gene probe methods was studied．The result showed that gene probe methods was a rapid and high-speciacity detection method for Usteria monocytogenes and limits of detection was 7．5Xlffcfu／mL．Comparing to traditional method，the whole confirmation process could fin- ished within 30rain．Detection data from 2O6 ssmple indicated that AcoJProbe gene probe method was a删 ，accurate and convenient method for detection of Usteria monocytogenes in foodstuffs． Key wor~：Listeria monocytogenes，gene probe(AccuProbe) 0 前言 李斯特氏菌(Listeria)在 自然界分布广泛，可来 源于土壤、水、植物和反刍动物、人的粪便，极易 污染各类食品。该属中的单核细胞增生李斯特氏菌 (Listeria monocytogenes，以下简称单增李斯特氏菌) 更可导致人和动物患脑膜炎、败血症、流产等，病 死率高达 30％ 一70％，是 目前最重要的人类食源 性病原菌之一⋯。国内外对单增李斯特氏菌均给以 高度重视，WHO将其列为 9O年代食品中四大致病 菌之一 。据统计 ，单增李斯特氏菌主要是通过污 染乳制品(生奶和软奶酪)、畜禽产品、生熟肉制 品、蔬菜等 ，引起食源性李斯特氏菌病(Food bor- neListeriosis)[ - 。 传统单增李斯特氏菌检测方法，主要是常规增 菌培养后再行生化鉴定 ，检测过程耗时 4～10d， 难以适应快速检验的要求。近年来 ，随着检测技术 日臻完善 ，ELISA 、PCRt 铂 等快速、特异方法被 收稿日期：2002—09—20 作者简介：翁文川(1973一)，男，工程师，主要从事进出口 食品及化妆品微生物检验方面的工作。 ~ No—I．2—0—03) 引入食品单增李斯特氏菌检验。本实验主要应用新 近发展起来的基因探针方法快速检测食品中单增李 斯特氏菌，并探讨了其在禽肉类及加工水产类样品 检测中的应用。 I 与方法 I．I 仪器 法国生物梅里埃 VITEK公司生产的 GENE— PROBE发光仪。 1．2 试剂 LEB增菌肉汤及添加剂、PALCAM选择性平皿 及添加剂、OXFORD选择性平皿及添加剂、FRAS． ER增菌肉汤及添加剂：德国默克公司生产；5％绵 羊血哥伦比亚血平板、API Listefia测试条 、Ac． cuProbe单增李斯特氏菌基因探针试剂盒：法国生 物梅里埃公司生产。 1．3 AccuProbe基因探针方法测试原理 利用 Acridinium ester作为荧光发光物质 ，标 记特异性单链 DNA作为探针 ，与待测细菌中的核 糖体 RNA(rRNA)互补，形成稳定 的DNA：RNA杂 交体。选择试剂再将未结合的多余探针破坏掉 ，最 维普资讯 http://www.cqvip.com 后通过 GENE—PROBE发光仪检测标记的 DNA： RNA杂交体。 1．4 测试菌种 单增李斯特氏菌(L．monocytogenes)、绵羊李斯 特氏菌 (L ivanvii)、英诺克李斯特氏菌(L．innocua)、 威尔士李斯特氏菌(L．welshimeri)、西尔李斯特氏 菌(L．seeligeri)、格氏李斯特氏菌(L．grayi)、默氏 李斯特氏菌(L．murrayi)等菌种来源于军事医学科学 院 ，绿 脓 杆 菌 (ATCC9027)、金 黄 色 葡 萄 球 菌 (ATCC6538)、粪链球菌(ATCC29212)、沙门氏菌 (ATCC7001)、大肠杆菌(ATCC8739)。将菌种从保 存斜面培养基内转接至血平板经 37~C、24h复苏 后，取适量的菌落划线到选择性平板培养观察，确 认菌株不受污染后，再分别挑取单个典型菌落划线 斜面培养基备用。 1．5 AccuProbe基因探针方法特异性测试 将 1O株李斯特氏菌种分别接种至 LEB肉汤经 3Occ、24h培养后，转接 Fraser肉汤 3Occ、24h培 养 ，将 Fraser肉汤划线到 PALCAM和 OXFORD平 板上 37~C、24～48h培养。其它阴性菌株接种各自 选择性平板，相同条件培养。 在选择性平板上选取典型菌落，用接种环取一 环 lOlL细菌加入 AecuProbe探针试剂管内，再加 入 501xL裂解液试剂 ，充分混匀 ，(36±1)cc孵育 5min后加入 501xL杂交缓 冲液 ，(60±1)cc孵育 15min，加入选择试剂 ，充分混匀 ，(60．4-1)cc、 5min后室温放置 5min，经 GENE—PROBE发光仪 测定。与此同时，采用 API Listeria方法 对 10株 李斯特氏菌进行对比试验。M 1．6 AccuProbe基因探针方法的敏感性测试 选取单增李斯特氏菌菌株，接种到 LEB基础 液中 37cc培养 24h后 ，获得初始菌液。初始菌液 经 LEB基础液稀释后取 0．1mL涂布到 PALCAM平 板，37cc培养 24～48h进行计数。同时取初始菌液 按一定梯度用 LEB基础液稀释，得到一系列浓度 菌液。除无须添加裂解剂外，按照上述基因探针方 法程序，分别对以上系列浓度菌液进行检测。 1．7 AceuProbe基因探针方法在实际检测中的应用 选取 140个冰鲜家禽、肉类样品及 66个水产 类样品进行检测。称取 25g样品到含有添加剂的 225mL LEB前增菌肉汤中，培养 30~C、24h，再转 种到 Fraser肉汤中，使用 Vidas LMO酶联免疫自动 分析进行前筛选，阳性结果划线 PAL CAM和 OX— FORD平板，再转接血平板，使用 SPI Listeria进行 鉴定。同时从选择性平板上取典型菌落进行单增李 一 柏 嬲 技 疵 斯特氏菌探针试验。 2 结果与分析 2．1 ACCtlProbe基因探针方法特异性测试 选择食品检测中常见致病菌及经过 API Listeria 方法鉴定的李斯特氏菌属各种菌等 20株菌株来测 试单增李斯特氏菌基因探针方法的特异性，检测结 果见表 1。从中可见，单增李斯特氏菌检测结果为 阳性，而李斯特氏菌属其他菌及阴性对照菌种检测 结果为阴性，表明单增李斯特氏菌基因探针检测方 法具有良好的特异性。 表1 属间和属内不同菌株的培养鉴定试验 2．2 AccuProbe基因探针方法的敏感性实验 基因探针检测方法是利用发光仪读取数值 ， RLU(相对光单位)大于 49999为阳性，小于 40000 为阴性，RLU值在 40000～49999范围则为可疑。 为探讨测试方法的敏感性，研究了肉汤中单增李斯 特氏菌菌液浓度与 RLU值关系，结果见图 1。对 数据进行 回归分析 ，得到回归方程式为 RLU= 2．95×10 ×【菌液浓度】+27973，其中菌液浓度 单位为 cfu／mL， =0．9526。回归结果表明，RLU 值与单增李斯特氏菌菌液浓度成正相关，当肉汤中 单增李斯特氏菌浓度≥7．5×107cfu／mL时，RLU≥ 49999即可判定为阳性。因此该方法检测单增李斯 特氏菌浓度低限约为 7．5×107efu／mL。 35 30 — 25 20 × 吝 15 10 5 0 菌液浓度 (×10 cfu／mL) 图 1 菌液浓度与 RLU之间的关系 维普资讯 http://www.cqvip.com 趋 溺 技 水 ● 2．3 基因探针方法在实际检测中的应用 采用基因探针方法进行了206个样品单增李斯 特氏菌的检验，检出情况见表 2。共有 21个样品 检出李斯特氏菌 ，其 中 1O个检出单增李斯特氏 菌，8个为英诺克李斯特氏菌，2个为西尔斯李斯 特氏菌，1个为威尔士李斯特氏菌。 表 2 基因探针方法对 206个样品进行 李斯特氏菌检测结果 我们过去的研究表明，经 Vidas方法筛选后， 再进行 API鉴定易于精确检测出食品中的李斯特氏 菌属[91。将上述基因探针检测结果与 API listeria检 测方法进行对比，从表 3结果可知，两种检测完全 符合。但进行 API Listeria试验(连溶血试验)需要 24h，而单增李斯特氏菌基因探针试验仅需 30min。 表 3 基因探针方法与 API Listeria方法检测 样品中21株李斯特氏菌结果对比 3 结论 3．I 采用 AccuProbe基因探针方法可快速检测食 品中单增李斯特氏菌，对食品中单增李斯特氏菌鉴 定时间仅需 30min，连同前增菌及选择性平板划线 纯化仅需 72h，同传统检测及鉴定方法需 4～10d 相比，大大缩短了检验鉴定周期。而且，该方法检 测特异性强 ，采用增菌肉汤检测低限约为 7．5× (上接第 74页) 【7】 纵伟 ．桑叶挂面的研制【J】．食品科技 ，2000，(4)： 55， 51 【8】 刘惠宾，等 ．脱腥速溶海带精粉的研制【J】 业， 1998，(3)：19，18 食 品工 【9】 林作辑 ．食品加工与小麦品质改良【M】．北京 ：中国 农业出版社，1993 【10】 杜连起 ，李新华，等 ．粮油加工工艺【M】．成都科技 大学出版社．1999 [1l】 杜连起 ，李润丰 ．玉米淀粉磷酸酯在挂面生产中应用 研究【J】．粮食与油脂，2000，(8)：5～7 【12】 落先群 ，等 ．野生仙人掌挂面的研制【J】．食品研究 与开发 ，1999，(6)：28～29 肼 Ⅲ 107cfu／mL。对大量实际样品检测结果显示 ，基因 探针方法可快速准确地检测及鉴定食品中单增李斯 特氏菌。 3．2 为缩短前增菌及选择性平板上划线纯菌落时 间，我们探讨了使用一步增菌法获得增菌肉汤直接 用基因探针方法鉴定，亦可取得良好的检测结果， 连前增菌过程在内，整个检测时间仅需 24h，有关 探讨及结果仍需进一步深入研究。 参考文献： 【1】 WHO Working Group．Foodbrone listeriosis．Bul1．WHO， 1988，66(4)：25 【2】 Ryser T，Elmer H M．Listeriosis and Food Safety．Marcel Dekke Inc，1991，6(2)：214—216 【3】 Ingianni A，Floris M．Rapid detection of Listeria monocy- togenes in foods，by fl combination of PCR and DNA probe．Mol Cell Probes，2001，15(5)：275—280 【4】 付萍 ．中国7类食品中单核细胞增生性李斯特氏茵污 染状况调查 ．卫生研究，1999，28(2)：106 【5】 Scheu P，Gasch A，Berghof K．Rapid detection of Listeria monocytogenes by PCE —ELISA．Lett Appl Microbiol， 1999，29(6)：416—420 【6】 Angelika Lehner．A rapid differentiation of Listeria mono- cytogenes by use of PCR —SSCP in the listeriolysin 0 (hlyA)locus．Journal Microbiological Methods，1999，34： 165～ 171 【7】 Dawn—marie Norton．Detection of Viable Listeria mono． cytogenes with fl 5’Nuclease PCR Assay．Applied AND Environmental Microbiology，1999，65(5)：2122～2127 【8】 R Karpiskova．Appilcation of fl chromogenic medium and the PCR method for the rapid confirmation of L．monocyto- genes in foodstuffs．Journal of Microbiological Methods， 2000，41：267～271 【9】 翁文川 ．联用 VIDAS法和 API Listeria法对食品中李 斯特氏茵检验及分类．食品科学，2000，21(4)：59～62 【13】 【14】 【15】 【16】 【l71 【18】 扬祥宏 ．挂面沿复合 向脱 离原因分析 【J】．食品科 技 ，2000，(2)：51～52 李容启 ，等 ．新型面条品质改良荆一面条王的研制 【J】．郑州粮食学院学报，2000，21(2)：41～44 张玉荣，等 ．挂面的理化特性及烹煮品质研 究【J】． 郑州粮食学院学报，2000，21(3)：47～50 刘魁英 ．食品研究与数据分析【M】．北京：中国轻工 出版社 ．1998 南京农学院 ．田问试验和统计方法[MI．北京：农业出 版 社 ． 1978 何社强 ．即食海带豆渣点心的研 制【J】．食品科 学， 1997，(4)：64～66 维普资讯 http://www.cqvip.com