两种分离人胎盘组织单个核细胞方法的比较

两种分离人胎盘组织单个核细胞方法的比较 两种分离人胎盘组织单个核细胞方法的比 较 第28卷第3期 2005年6月 遵义医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEZUNYI Vo1.28No.3 Jun.2005 两种分离人胎盘组织单个核细胞方法的比较 章涛,陈代雄,方宁,刘祖林,刘金伟,万卫红 (遵义医学院附属医院细胞工程重点实验室,贵州遵义563003) [摘要]目的探讨从人胎盘组织制备高丰度单个核细胞(MNC)的方法.方法采用机械法加胶原酶消化法 制备人胎盘组织单个细胞悬液,再分别用羟乙基淀粉(6%HES)和Fic0u分离其中的MNC,并对分离效果进行比 较.结果胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC的回收率为(45.3?l1.7)%,而经Ficol1分离为(24.1 ?5.5)%,两者比较差异有统计学意义(P<0.O1),前者分离MNC的回收军明显高于后者.结论6%HES分离 法优于Ficoll法,其可从胎盘组织获得高丰度的MNC. [关键词]人胎盘;单个核细胞;分离方法;回收率 [中图分类号]R33l[文献标识码]A[文章编号]1000.2715(2005)03-0235-02 Comparisonoftwomethodsforisolatingmononuclearcellsfromhuman placentatissues ZHANGTao.CHENDai.xiong,FANGNing.etal (eAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,KeyLaboratoryofCellEngineeringol GuizhouProvince,GuizhouZunyi563003.China) 【Abstract]ObjectiveToinvestigatetheprotocolsofisolatingmononuclearcells(MNC)fromhumanplacentatissues (PT).Me~odsSingleceilssuspensionliquidofhumanPTwasprepbymechanicalmethodscombinedwithcollage- nasedigestion.Then,MNCderivedfromPTwasseparatedby6%HydroxyethylStarch(HES)andFicollrespectively.Re- suitsTherecoveryofMNCby6%HESandFicollwas(45.3?11.7)%and(24.1? 5.5)%,respectively.ItWasobvi. 0llslythattheMNCrecoveryby6%HESwasmuchhisherthanFicollseparatingmethods.CondusionsIncomparisonto FicoU.6%HESseparatingmethodcouldacquirehighrecoveryofMNCfromhumanplacentatissues. 【Keywords]humanplacenta;mononuclearcell;isolatingmethods;recovery 造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitor cells,HSPC)存在于人骨髓,动员的外周血和脐带血 等组织中【】j.近年来有研究发现,人胎盘组织富含 造血干细胞,其CD34CD38一,CD34CD38HSPC 的百分率明显高于脐带血;且胎盘组织中免疫细胞成 分较少,使其极有希望成为今后HSPC的一种新来 源-5J.从胎盘组织中分离出高密度,高活力的单个 核细胞(Mononuclearcells,MNC)是进行下一步 HSPC分选的前提.目前尚无有关人胎盘组织HSPC 【收稿日期]2005-04.10;[修回日期]2005-05—20 [基金项目]贵州省科技计划资助项目(黔科合计字[2003] JGY005) [作者简介]章涛(1969一),男,浙江省湖州市人,在读博士; 陈代雄,男,教授,硕士及博士生导师. 分离的优化可循.本研究旨在建立从人胎盘组 织中分离,纯化MNC的标化流程,为下一步人胎盘 HSPC的分选和相关研究打下良好的基础. 1材料与方法 1.1主要试剂胶原酶(CollagenaseIV),羟乙基淀 粉(HydroxyethylStarch,HES),Ficoll均为Sigma公 司产品.RPMI一1640,新生牛血清(FCS)购自于Gib. CO公司.荧光标记单克隆抗体CD34一PE及CD34 绝对计数试剂盒ProCOUNTTMProgenitorEnumeration Kit为BD公司产品. 1.2胎盘与脐带血的收集足月分娩的人胎盘,同 时采集同一胎盘的脐带血(肝素抗凝,2OU/m1), HBsAg(.),共l2份.胎盘和脐带血均于6h内进入 实验程序. 1.3胎盘组织单个细胞样品的制备多点全层剪取 遵义医学院28卷 胎盘组织约80g.用Hank'S液重复漂洗,尽量除尽胎 盘组织中的残留血液,将其剪碎,再用Hank'S液漂 洗3次.加入0.025%胶原酶消化20rain,不锈钢网 过滤,细胞滤液1200rpm离心5min,细胞沉淀用100 mlRPMI1640悬浮混匀.细胞样品进行流式细胞仪 (FCM). 1.4人胎盘组织与哜带血单个核细胞(MNC)的分 离 1.4.1羟乙基淀粉(6%HES)分离法取上述50ml 胎盘组织单个细胞悬液按4:1的比例加入6%HES, 混匀,22?下静置45min至红细胞完全沉降.分离界 面出现后,吸取富含单个核细胞(MNC)的上层液. 将收集的富含MNC上层液按1:3的比例加入Hank' s,1500~m离心8min.弃上清,沉淀用2.0ml含15% FCS的RPMI1640悬浮.再按1:3的比例加入RBC裂 解液,作用5rain.1200rpm离l=-,5rain,细胞沉淀再用 含15%FCS的RPMI1640洗涤,悬浮,350目尼龙膜过 滤.镜下计数MNC细胞,台盼蓝染色观察细胞活力 (细胞活力应>90%).取单份脐带血的一半,经1: lHank's稀释唇同法用6%HES分选其MNC.MNC 细胞样品进行FCM分析. 1.4.2Ficol1分离法将剩余的另一半50ml胎盘单 个细胞悬液和脐带血按2:1的体积比缓慢加在Ficoll (密度为1.077)液上,1500rpm离心30min,收集富含 MNC的界面层,按1:3的比例加入Hank's,1500rpm 离心8min.弃上清,沉淀用含15%FCS的RPMI16— 4O悬浮,350目尼龙膜过滤镜下计数MNC细胞,台 盼蓝染色观察细胞活力(细胞活力应>90%).MNC 细胞样品进行FCM分析. 1.5流式细胞仪分析调整细胞密度为1×10./ml, 100~1细胞悬液中加入201~1相应荧光标记单抗(c D34.PE),混匀,室温避光孵育20rain.每管加入2ml 红细胞裂解液,混匀,室温静置10rain,1000rpm离心 5min,弃上清,重新悬浮细胞.每管加入2ml含0.1 %NaN的PBS混匀,1000rpm离心5min,弃上清,再 悬浮细胞;每管加入0.5roll%的多聚甲醛,混匀,2, 8?避光放置,上机分析.采用CellQuest软件对标记 样品进行采集和分析(每管采集2×10个细胞). MNC和CD34细胞绝对计数用ProCOUNT软件采集 和分析.MNC的回收率按下面公式计算: 纯度(%)=麓×l00% c(%): ? 236? 1.6统计学处理实验数据采用统计软件SPSSfor Windows10.0进行处理.如方差齐,采用f检验;如 方差不齐,则采用t检验. 2结果 2.1胎盘MNC数及CD34细胞所占的百分率(表 1)胎盘单个细胞悬液所含MNC数为(12.30?3.51) ×10.,其中CD34细胞所占的百分率分别为(3.93? 2.31)%.胎盘CD34细胞百分率是脐带血的8.9 倍. 表1胎盘和脐带血中单个核细胞(MNC)数及CD34 细胞所占的百分率(?s.%) 注:与脐带血组比较 2.26%HES和Ficol1分选胎盘和脐带血MNC的回 收率(表2)相同分离方法获得的MNC的回收率胎盘 和脐带血比较差异无统计学意义(P>0.05).而无 论是胎盘组织还是脐带血,经6%HES分离MNC的 回收率均明显高于Ficoll法(P<0.01). 表26%HES和Fieol1分离法M.NC回收率的比较(? s,%) 注:与脐带血比,P>0.05;与Ficoll组比较,'P<0.01 3讨论 从胎盘组织中分离纯化HSPC的第一个关键环 节是制备高密度,高活力的单个细胞样品,这对评价 其HSPC丰度,表型特征和相关的生物学特性至关重 要.然而,目前尚无有关人胎盘单个细胞样品制备的 优化方案可循.本研究采用机械法联合胶原酶消化 法制备人胎盘单个细胞样品,经流式细胞仪分析,人 胎盘单个细胞样品中含(12.3?3.51)×10.个MNC, 这与脐带血初始样品中所含的MNC数[(8.64? 5.38)×10.]大致相当,但其CD34细胞的百分率 f(3.93?2.31)%]明显高于后者[(0.44?0. 29)%],是脐带血的8.9倍,与文献报道一致. 从胎盘单个细胞悬液中获得高丰度的MNC是 (下转第239页) 李立等?阿司匹林对脂多糖,地塞米松分别诱导巨噬细胞凋亡中rNF.表达的影响 2.2放射免疫分析法测定培养上清中TNF水平 2.2.1阿司匹林对LPS诱导巨噬细胞凋亡中TNF.Ot 水平的检测LPS刺激组的巨噬细胞在刺激12h后 与空白组比较TNF—水平出现明显升高,与阿司匹 林共同作用后TNF—量减少,差异有统计学意义(P <0.05)并随剂量增加而逐渐下降(P<0.05). 2.2.2阿司匹林对Dex诱导巨噬细胞凋亡中TNF.Ot 水平的检测Dex刺激组的巨噬细胞在刺激12h后 与空白组比较TNF—水平降低,与阿司匹林共同作 用后TNF—量减少,差异有统计学意义(P<0.05) 并随阿司匹林剂量增加而逐渐下降(P<0.05). 3讨论 巨噬细胞与细胞凋亡的密切关系首先是其作为 凋亡细胞的主要清除者而受到关注.阿司匹林在细 胞凋亡中作用的研究,主要集中在癌细胞上,已证实 阿司匹林对结肠癌J,胃癌等多种癌症有促癌细 胞凋亡的作用.TNF—是一种重要的炎症反应因子, 是由活化的巨噬细胞,单核细胞和T细胞产生的,并 在细胞凋亡的启示阶段发挥了作用. 在实验中,我们观测到阿司匹林对LPS诱导巨噬 细胞凋亡中产生的TNF—有抑制作用,并可随浓度 的增高而加强.Dex诱导巨噬细胞凋亡后,与对照组 相比TNF?Ot含量下降,加用阿司匹林后随浓度的增 加TNF—OL含量呈降低趋势. 在Dex诱导的巨噬细胞凋亡中,体现出了Dex对 TNF—Ot的抑制作用,并随阿司匹林浓度的增加呈剂量 依赖性.与LPS诱导的凋亡相比,Dex是在正常生理 水平降低TNF—Ot,加用阿司匹林后rNF—Ot含量更低, 总体水平低于LPS诱导的凋亡. 以上结果提示:阿司匹林在炎症和非炎症情况 下,都可以降低TNF—Ot水平,和它对巨噬细胞凋亡的 作用相结合,首先,可以为抗炎作用提供更多的途径; 其次,在许多需激素治疗的自身免疫性疾病中,可以 作为联合用药通过降低TNF—Ot而起到协助治疗的作 用. [参考文献] [1]BarrPJ,TomeiLD.Apeptosisanditsrolejinhumandisease [J].Biotechmmology,1994,12:487. 黄有国.巨噬细胞凋亡及其调控.生物化学与生 [2]黄行许, 物物理进展[J].2000,7(2):139—142. [3]ShengH,ShaoJ,KiridandSC,eta1.InhibitionofhumanCO- Ioncancercellgrowthbyselectiveinhibitionofcyclooxyge— nase-2[J].JClinIncest,1997,99:2254-2259. [4]刘兴,高青,等.阿司匹林对胃癌细胞株SGC-7901的细 胞毒作用[J].实用癌症杂志,2001;16(4):403-405. [责任编辑:杨明富] (上接第236页),进行后续HSPC分离的关键.脐带[2] 血MNC的分离方法主要有Ficoll(密度为1.077)密 度梯度离心和6%HES分离法'两种,而有关胎盘 组织MNC的分离方法未见报道.本实验借鉴了脐带. 血MNC分离的Ficoll和6%HES法,用于人胎盘组织 MNC的分离.结果显示:胎盘组织单个细胞悬液经 6%HES分离后,其MNC的回收率为(45.31?11. 70)%,而Ficoll法为(24.12?5.54)%,两者比较差[4] 异有统计学意义(P<0.01),说明HES优于Ficol1 分离法,前者可从胎盘组织单个细胞样品分离获得高 丰度的MNC.尽管HES分离后,MNC组分中仍含有LJ 少量的RBC,但可通过适量的RBC裂解液除去,且不 影响其HSPC的活性和生物学特征.此外,HES分离r] 法比Ficol1分离简便,省时,也更为经济,在胎盘组织 MNC的分选中值得推广. [参考文献][7] [I]RowleySD,SharkisSJ,HattenburgC,eta1.Culturefrom humanbonemarrowofblastprogenitorceHswithanexten— siveproliferativecapacity[J].Blood,1987,69(3):804— 808. 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