动物源食品中残留乙烯雌酚免疫原的制备与表征

食 品 安 全 旃留己烯雌 隽瘦原的锕帝与旅伍 (江南大学食品学院，无锡 214036) 胥传来 贺铁明 王武康 接 曩：己烯雌 (diethylstilbestrol，DES)为人工合戍的二苯乙烯类 雌性激素药。本文采用碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白 交联，经紫外扫描估算其交联率为 22，SDS—PAGE实验 初步明，DES与 BSA有交联。双向免疫琼脂扩散实验 检测经DES—HS-BSA多次免疫的兔子的血清，结果表 明，兔子产生了针对小分子 DES的抗体 ，进一步说明了 DES免疫原合成成功。 关■词 ：己烯雌酚，碳二亚胺法，交联 Al~'tract：Diethylstilbestrol(DES) iS a kind 0f synthetic stilbene estrogen． In this article。 DES was covalently bonded to BSA through carbodllmides after converted by succinate anhydride UItra—— violet scan indicated that the conjugation ratios were 22 and SDS-PAGE also proved the cross— linking between DES and BSA The DES-HS-BSA conjugate IS ten used to immunlze the New Zealand rabbit， The rabbit antiserum was tested through double immunodiffusion agar test the result of which demonstrated that DES—HS—BSA was able to stimulate the rabbit to develop antibody against DES。and the immunogen DES— BSA was thus synthesized successfully． 1 y words：DES；carbodiimides；conjugate 中图分类号：TS201．2 文献标识码：A 文 章 编 号 ：1002-0306(2004)l2—O115-03 目 前 ， 我 国 使 用 的 检 测 己 烯 雌 酚 (diethylstilbestrol，DES)的 ELISA试剂盒主要依靠 国外 进 口，因其价格非常 昂贵 ，不可能在 国内推广使用 。 为 了有 效 地监 控 DES的非 法 使 用 ，开 发拥 有 自主产 权的此类试剂盒 、降低检测成本成为 当务之急。该试 剂 盒 的 研 制 ，关 键 就 是 要 制 备 出能 促使 动物 产 生 针 对 DES抗体 的免疫 原 。本 文先采 用琥 珀酸酐 酰化 DES，然后 通 过 碳 二 亚 胺 将 DES-HS与 BSA交 联 ，经 鉴 定 ，合 成 的 DES—HS—BsA复合 物能 促使 动物 产 生针 收稿 日期： 作者简介： 基金项目： 2004—05—11 胥传来(1965-)，男，博士，副教授，研究方向：食品安全关键 技术。 国家科技“十五”攻关食品安全重大专项(No．2001BA04A18-05)。 对 DES的抗体 ，为 DES检测试剂盒的研制打下基础。 1 材料与方法 1．1 材料与设备 DES、弗 氏佐 剂 、1一环 乙基一3一(2一吗啉-4一乙基)一碳 化二亚胺 甲基对 甲苯 、磺 酸盐 [(N—Cyclohexyl—N 一(2一 morpholinoethy1)carbodiimide metho——P——toluenesulfonate)] 均 为 Sigma公 司产 品 ；牛血 清 白蛋 白 V(BSA—V)、鸡 蛋 白蛋 白 (OVA)(批号 030602，电泳 纯 )均 为上海 伯 奥公 司产 品 ；琥 珀 酸酐 上 海化学 试剂 公 司产 品 ；新西 兰纯 毛 白兔 购于洛 社实 验动物 中心 。 U3000紫 外 扫 描 仪 日本 岛 津 公 司 产 品 ； 电泳 设 备 美 国 Bio—rad公 司产 品 ；PHS一3TC精 密 酸 度计 上 海 天 达 仪 器 有 限公 司产 品 ；石 英 自动 双 重纯 水 蒸 馏 器 江苏 金坛 市 荣华 仪 器 制造 有 限 公 司产 品 。 1．2 实验方法 1．2．1 DES免疫 原 的合 成 参 照 文 献[1】介 绍 的 碳 二 亚胺 方 法来 合成 。取 76mg琥 珀 酸酐 于 5mL二 氧 六 环 中 ，在搅 拌 下 溶 解 后 ，加 入 133mg DES，溶 解 后 再 加 入 0、25mL三 乙胺 ，30℃下 搅 拌 1h。待 溶 液冷 却 后 ， 滴入 500mgBSA (溶于 25mL，pH7．4，0．Olmol／L的 PBS 溶液中)溶液及 200mg磺 酸盐 ，搅拌 ，调节 pH为 5．5， 10rain后再加入磺酸盐 50mg，pH5．5，暗处搅拌 18h。 随 后将 其 在 4℃冰箱 中用 PBS (0．01mol／L。pH7．2～ 7．4)连 续 透 析 2d，期 间 多 次 换 液 ，最 后 冷 冻 干 燥 保 存 。DES—HS一0VA 的合 成基 本 同上 法 。 1．2．2 DES—HS—BSA 免 疫 原 的鉴 定 1．2．2．1 紫 外 分 光 光 度 计 法 用 乙 醇 精 确 配 制 DES 溶液 ，用生理盐水配制 BSA的标准溶液。称取一 定 量 的 DES—HS—BSA 溶 于 生 理 盐 水 中 ，用 Braford 法 测其蛋 白质 的浓 度日。根据 此浓度 调整 DEs_Hs-BSA 溶液 中蛋 白质 的浓度 ，使其与 BSA一致 。用 U3000 紫 外 扫描 仪 ，分别 用 乙醇 和 生 理 盐 水调 零 ，在 波 长 为 200-320 nm的范 围内进行扫描 。参照文 献[31估 算 DES与 BSA 的交 联率 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 食 品 安 全 1．2．2．2 SDS-PAGE法 按 参 考文 献 【2】的方 法 ，配 制 各 种溶 液 。浓缩 胶 浓 度 为 4％，分 离 胶浓 度 为 14％，电 泳 电压为 20ov，用 考 马斯 亮蓝 染 色 。 1．2．3 DES抗 血清 的制备(参照 文献[4】) 选 3只 2 月龄 、体重 1．5-2．0kg的健康雄性新西兰大白兔 ，1只 注射 生 理盐 水 作 为对 照 ，另 两 只 用 DES—HS-BSA免 疫 。取 浓 度 为 1g／L的 DES—HS-BSA溶 液 (用生 理 盐 水 溶解 )2mL，加 等 量体 积 的弗 氏完 全 佐 剂 充 分乳 化 后 进 行 基 础 免疫 ，即于 兔 背 部 多点 注 射 ，每 只兔 注射 2m Img)。20d后 ，以 DES-HS-BSA溶 液 加 等量 体 积 弗 氏不 完 全 佐 剂 进行 加 强 免 疫 ，剂 量 与 基 础 免疫 相 同。以后每 3星期加强免疫 1次 ，于兔腹腔和大腿肌 肉处交叉进行 。从第 4次加强免疫开始 ，每次免疫后 7d，经 兔 耳缘 静 脉采 血 测定 抗 体 的效 价 。效 价 符合 要 求 时 ，用 未 乳化 的 DIE—BSA耳静 脉加 强 免疫 ，3d后 心 脏 采 血 ，于 40cc冰 箱 中静 置 过夜 ，3000r／min离 心 后 ， 取 上 清液 过 DEAE—Sephedax A50层 析柱 初 步纯 化 。 1．2．4 抗 血清 的特异性鉴定 按 照参考文献[4】的方 法 ，用 双 向免疫 扩 散 的方 法 鉴定 。中 央孑L分别 为 1：32 稀 释 的 阳性 抗 血 清 和 未 稀 释 的 阴性 兔 血 清 ，周 围六 孔 分 另U加 入 oVA、BSA、DES—HS-BSA、PBS、DES— HS、DES—oVA，37cc水 浴箱 中过夜 。 2 实验结果 2．1 DES—HS—BSA的紫外扫描图分析 从 图 1可 见 ，DES在 波 长 242nm，BSA 在 波 长 279nm 吸收 最 大 ，与文 献【5】一致 。DES—HS—BSA扫 描 图与 BSA及 DES均 有 较 大 的不 同 ，最 大 吸 收 波 长 有 明显 的偏 移 。尽 管 DES—HS—BSA 中蛋 白浓 度 与 BSA 相 同 ，但 在 BSA最 大 吸 收处 ，DES-HS-BSA 吸光 度 远 远 高 于 BSA 的 吸光 度 ，虽有 其它 因素 的影 响 ，但 大 致 亦可推知 DES与 BSA发生结合 。根据文献[3】的方法 可大致推算 DES与 BSA的结合率为 22。 2．2 DES—HS—BSA的SDS—PAGE分析 从 电泳 图 的 3泳 道 可 以 看 出 ，DES—HS—BSA 的 电泳 条 带滞 后 于 载体 蛋 白质 BSA 的 电泳条 带 ，说 明 ／一、 、 吸收波长(nm) A、B、C分别为 DES、DES—HS—BSA和 BSA的紫外吸收曲线 图 1 DES、BSA及 DES—HS—BSA的紫外扫描图 DES—HS—BSA 的相 对 分 子 质 量 (Mrx10 )大 于 BSA 的 ， 即 DES已 与 BSA 结 合 形 成 DES—HS—BSA。但 DES—HS—BSA能 否 刺激 动 物 产 生针 对 DES的抗 体 只 有通过动物实验来验证 。 肘 ×1O 97 66 43 31 20 14．4 3 ：}= A 1．蛋白marker； 2．BSA(1g／L1； 3．DES-HS-BSA(1g／L1 图2 DES—HS—BSA 的SDS—PAGE分析 2．3 抗血清的特异性鉴定 从 免疫 扩 散 图可 以看 到 ，抗血 清 与 BSA 和 DES— HS—BSA 之 间 有 反 应 ，形 成 明 显 的沉 淀 线 ，说 明抗 血 清 中含 有 针对 BSA 的抗 体 ；同时 抗 血 清 与 DES一0VA 及 DES之 间亦 有 很 明显 的沉 淀 线 ，而 与 PBS和 oVA 之 间没 有 沉 淀 线 形成 ，充 分说 明抗 血 清 中亦 含 有 针 对 DES的抗体 。反过来 也证 明上述 合成 的免 疫原 DES—HS—BSA能促 使 动 物产 生 针 对 DES的抗 体 。 1．0VA；2．BSA；3．DES—HS—BSA；4．PBS； 5．DES—HS；6．DES—OVA；中央孔为抗血清 图3 DES抗血清特异性的鉴定 3 讨论 己 烯 雌 酚 (diethylstilbestrol，DES)为 人 工 合 成 的 二苯乙烯类雌性激素药 ，化学名为 1，2一双(4一羟苯基) 一 1，2一二 乙基乙烯 。因其能显著促进动物增重 ，提高饲 料 转 化 率 ，曾经 广 泛 用 于畜 牧业 。但 因其具 有 致癌 性 及 其 他 副作 用 ，世 界 上绝 大 多数 国家 已经 禁 止 在 食 品动 物 中使 用 DES旧。20o2年 ，我 国农 业 部 亦 下 文禁 止 DES及 其盐 、酯 制 剂用 于 所 有 食 品动 物 的所有 用 途 。但 由于 利 益 的驱 使 ，以 及 目前 DES的 检 测 方 法——高效 液相色谱一质谱联 用法 (HPLC—Ms)和气 相 色谱一质谱联用法 (GC—MS)不 能适 应市场 监督所 需要 的快速 、简便 、价廉 的要求 ，滥 用 己烯雌 酚的现 象 依 然存 在 『7．81。 制 备 针 对 小 分 子 的抗 体 关 键 就 是 合 成 小 分 子 免 疫 原 。将 小 分 子 半 抗 原 与 大 分 子 载体 交 联 形 成 完 全 维普资讯 http://www.cqvip.com 抗 原 ，首 先 由 Landsteinerder创 立 。但 半 抗 原 偶 联 到 载 体 上 的数 目常 会 影 响抗 体 的滴 度 ，而 最 佳 的偶 联 数 目 ，迄 今 仍 无 定 论 ，一 般 认 为 在 8-25之 间 比较 合 适 。本 研 究通 过 控制 DES和 BSA 的摩尔 比和 反应 时 间进 行 偶联 ，经 紫外 扫 描计 算 得 到 的偶 联 比为 22。 交 联 物 DES—HS—BSA 的 紫 外 扫 描 图 和 SDS— PAGE谱 图均 与 载 体蛋 白 BSA有 较 明显 的区别 ，初 步 表 明 DES分 子 确 已与 BSA分 子偶 联 。采 用 已鉴定 的 DES—HS—BSA作 为免疫 原 免疫 兔 子 2只 ，双 向免 疫 扩 散 试 验 表 明 ，免 疫 兔 均产 生 了针 对 DES的抗 体 ，说 明 用碳二亚胺法合成 DES免疫原是行之有效的方法。 参考文献： 【1】 李林峰，李世荫，崔季巧，等．琥珀酸酐一碳二亚胺法制备高 结合比利福平人工抗原【J1．北京医科大学学报，1994，26(2)：136- (上接 第 108页) lJ|MER乙酯(自) 3500 3000 2500 2o0O 15o0 1o0O 5o0 Wavenumbers(cm- ) a蛋氨酸乙酯 3000 2000 15o0 1o0O 5o0 Wavenumbers(cm- ) c蛋氨酸辛酯 食 品 安 全 137． 【2】 汪家政，范明．蛋白质技术手册【M】．北京：科学出版社，2002． 【3】 杨利国，胡少昶，魏平华，等．酶免疫测定技术【M】．南京：南 京大学出版社，1998． 【41 沈关心，周汝麟．现代免疫学试验技术【M】．武汉：湖北科学 技 术 出版社，2002． 【5】 中华人民共和国药典(二部)，1990年版． 【6】 B Hammes，CNM，et al， Diethylstilbestrol(DES)Ufpdate： Recommendations for the Identification and Management of DES-Exposed Individuals[J]．Journal of Midwifery& Women's 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