纸层析法定量测定米胚芽中的γ-氨基丁酸

第 23卷第 2期 2004年 3月 无 锡 轻 工 大 学 学 报 Journal of W uxi University of Light Industry Vo1．23 NO．2 M ar． 2004 文章编号 ：1009—038X(2004)02·0101·03 纸层析法定量测定米胚芽中的 氨基丁酸 张 晖， 徐 永 ， 姚 惠源 (江南大学 食品学院，江苏 无锡 214036) 摘 要：通过对点样量、展开体系、显色方法等研究，解决 了利用纸层析 法定量测定 )，一氨基丁酸误 差大 、重现性 差的 问题 ，从 而建立 了以纸层析 法定量 测定 )，一氨基 丁 酸 的方 法．结 果 明，此 法定 量 测定 )，一氨基丁酸简单易行，耗费低廉，可作为食品中 )，一氨基丁酸测定的手段． 关键词 ：)，一氨基 丁酸；纸层 析；定 量测 定 中图分类号 ：Q 503 文献标 识码 ：A Quantitative Determination of 7-Aminobutyric Acid in Rice Germ with Paper Chromatography ZHANG Hui， XU Yong， YA0 Hui—yuan (School of Food Science and Technology．Southern Yangtze University．W uxi 214036．China) Abstract：The accuracy and repeatability in y-aminobutyric acid (GABA ) determination with paper chromatography method were improved by means of the sample dose，the developer and the color reaction．The quantitative technique for detecting GABA with paper chromatography—mottle elution method was established．The results showed that this method was simple，cheap and was suggested as a conventional method for detecting GABA． Key words：y-aminobutyric acid；paper chromatography；quantitative determination )，一氨基丁酸(GABA )是一种非蛋 白质氨基酸， 为哺乳动物 中枢神经系统内重要 的氨基酸类神经 递质；它广泛存在于植物以及植物的各个部分中， 在植物的抗逆境中起着一定的作用[1]．大米加工副 产品——米胚芽中含有谷氨酸脱羧酶，可将谷氨酸 转化为 GABA，从而使 GABA得到富集．因此将米 胚芽经适当处理后 ，可以得到富含 GABA的食品配 料，应用于功能食品中．1994年 ，日本农林水产省中 国农 业 试验 场 成 功 开 发 了 富 含 GABA 的 米胚 芽l_2]．动物实验表明，富含 GABA的米胚芽具有降 血压、改善肝、。肾功能 、促进 乙醇代谢等功效 ．近 收稿 日期 ：2003—07—10； 修回 日期 ：2003—08—31 作者简介：张晖(1966一)，女 ，上海人 ，副教授． 年来，GABA在食品 中的应用研究正在兴起 ，而食 品 中 GABA 测定 方法 的报道 尚不多见． 由于 GABA对电化学和紫外、可见光的不灵敏 性，用直接方法对它进行测定 比较困难．关于 GA— BA的测定近年来国内外有酶法[4 2、色质联用法、柱 层析荧光测 定法、纸 电泳 比色、毛细 管气相色谱 法[5]、放射性受体法[6]、毛细管 电泳法 ，以及液 相色谱法[8 等 ，这些方法大多用于医学领域．且价 格昂贵，不适用于大量的定量分析．因此 ，本实验在 进行米胚芽富集 GABA工艺参数的筛选 、优化 中， 研究了纸层析法对 GABA的定量分析 ，确定了点样 维普资讯 http://www.cqvip.com 102 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 23卷 量、展开系统 、洗脱 系统、比色测定 的一套分 析方 法 ，并对此法的精密度、回收率等进行了分析． 1 材料与方法 1．1 材料 1)GABA购 自美国 Fluca公司． 2)展开剂 ：V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)一 4：1：3，0．1 g／dL茚三酮 ；V(正丁醇)：V(醋酸) ：V(水)一4：1：3，0．2 g／dL茚三酮 ；V(正丁醇) ：V(醋酸)：V(水)一4：1：3，0．3 g／dL茚三酮；V (正丁醇)：V(醋酸)：V(水)一4：1：3，0．4 g／dL 茚三酮；V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)一4：1：3， 0．5 g／dL茚三酮． 3)洗脱剂：V(1 g／L硫酸铜 )：V(体积分数 75 乙醇)一2：38 4)其它：层析纸、层析缸、722型分光光度 计等． 1．2 方法 1．2．1 样品预处理 测定米胚 芽中原有 GABA 时，将米胚芽用 80℃的水提取 2 h，离心分离后取 上清液直接点样测定．测定米胚芽富集 GABA后的 含量时，将不同工艺富集 的米胚芽液于沸水中煮沸 5 min，离心分离，取上清液测定． 1．2．2 GABA含量测定 吸取 5～8 L样 品，点 样线距滤纸 2．0 am，样品间距 2．0 cm．将点样后的 滤纸条在展开剂中展开、风干显色，将与标准品位 置一致的斑点剪下，用洗脱液洗脱，520 nm处比色 测定． 2 结果与讨论 2．1 展开剂和显色剂体积分数的选择 关于纸层析法定量测定氨基酸，不同文献使用 了不同的展开剂和配比，但没有专门分离 GABA的 报道，作者选择了几种展开剂配方，发现展开剂 V (正丁醇)： (醋酸)：V(水)一4：1：3时，能够很 好地将 GABA与其它氨基酸分离． 为了克服传统喷雾显色造成的重现性差、定量 不准确的缺点，作者改进了显色方法，将一定量的 茚三酮溶解于展开剂中，在展开过程中，茚三酮随 着展开剂沿滤纸向上移动，由于固定了显色剂的 量，使测定结果更准确．不同质量浓度的茚三酮显 色，洗脱后比色结果显示 ，0．4 g／dL的质量浓度较 为合适(见表 1)． 2．2 显色温度和时间的选择 为了定量的准确性和重现性，减少操作引起的 误差，应将显 色温度和洗脱时间确定下来．将点有 GABA标准品层 析纸展开后放入烘箱，在 80，90， 100，1l0℃分别显色 10，20，30，40 min，剪下显色斑 点洗脱比色，结果见表 2． 衰 1 不同茚三酮质量浓度显色的结果 Tab．1 Effect of the concentrations of ninhydrin Oil absor- bency 茚三酮质量浓度／(g／dL) OD5z0 O．1 O．2 0．3 O．4 O．5 O．24 O．28 O．3O 0．35 O．36 衰 2 不同显色温度对 OD值的影响 ．BIb．2 En'eet ofⅡ d 啊nD窖嘲ic tem It玳 on al霸睁 叮 由表 2可见 ，温度低于 90℃，洗脱液的 0D值 偏低 ，可能由于 GABA显色不完全所致．当温度高 于90℃时，洗脱液的0D值也偏低，并且不太稳定， 可能是由于温度过高，GABA与茚三酮的反应物与 层析纸结合牢固，不能被洗脱下来在洗脱液中形成 铜的络合物．因此，选择显色温度和时间为 90℃， 10 rain． 2．3 颜色稳定性确定 由图 1可知，茚三酮和 GABA反应物的洗脱液 在放置超过 1 h时，0D值明显下降．洗脱液在 10～ 50 min内颜色较稳定，在这个时间范 围内，可以采 用茚三酮比色法定量测定 GABA含量． 目 高 a 0 图 1 放置时间对 OD值的影响 Fig．1 Effect of the staying time Oil absorbency 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 张 晖等 ：纸层析法定量测定米胚芽中的 氨基丁酸 1O3 2．4 测定范围的确定 由图 2可见，当点样量在 8～4O g时，洗脱液 的吸光度值与 GABA的量呈线性关系，可在此范围 内绘制标准曲线，定量测定 GABA质量．标准曲线 显示，GABA质量与吸光度之间关系密切，其相关 系数 R 一0．998 6，由此可 以推 出米胚芽富集液中 GABA质量的为 一 8．435 8A — O．378 8 式中： 为米胚芽富集液中 GABA质量；A 为吸光 度值． 1 暑 凸 0 点样 量／(u L) 图 2 GABA质量与吸光度值 的关系曲线 Fig．2 Correlation curve of GABA content and absorb- ency 2．5 精密度测定 取标准 品 1O L重复点 样测定 (n一5)，结果 参考文献 ： OD 值 分别 为：0．361，0．355，0．351，0．356． 0．354，计算所得相对标准偏差为 0．79 ． 2．6 回收率测定 样品按方法 1．2．1处 理 ，取 lO L滤液点样 ，对 样品进行回收实验 ，回收率为 96．6 ～1O1．6 ，结 果 见表 3． 表 3 样 品测 定结 果 及 回收率 Tab．3 Result of sample determination and recovery 根据测定结果，米胚芽中 y一氨基丁酸质量分数 由富集前的 30．1 mg／hg提高到了 439 mg／hg，可 作为食品配料应用于调节血压等保健食品中．本实 验建立的米胚芽中 氨基丁酸分离 、测定的纸层析 方法，简便易行，耗费低廉，可广泛应用于其它食品 分析． [1]田小磊，吴效岚 ．张蜀秋 ．等． 氨基丁酸在高等植物逆境反应中的作用[J]．生命科学，2002，l4(4)：2l5—219． [2]Saikusa T．Accumulation of gamma aminobutyric acid(GABA)in the rice germ during water soaking[j]．Biosci Biotesh Biochem ．1994，58(12)：229l一 2292． I-3]冈田忠司．GABA富化工 胚芽 生理横能EJJ．食品匕阴凳，2001．36(6)：7—9． E4]胡红焱，杨树德．细菌荧光法酶生物发光分析法测定血清 氨基丁酸EJ]．临床检验杂志 ，l998．16(2)：67—69． i-s]徐小平，郭平 ，宋玉如 ，等．脑 内 氨基丁酸的毛细管气相色谱测定法J-j]．华西药学杂志 ，1990．5(2)：107—109． [6]Nahorski SR．A radioreceptor assay using 3 H—muscimol for GABA in Human CSF[J]．Br J Pharmaca1．1981．72：l6． I-7]朱珠．递质氨基酸的毛细管电泳一安培检测[J]．分析测试学报，l999．18(4)：36—38． [8]Lindroth P，Mopper K．High—performance liquid chromatography determination of subpicomole of amino acids by fluores— cence derivatization with o—phtha1dia1dedyde[J]．Annl Chem．1975．5l(i0)：l667一l669． [9]Liu HJ．Determination of amino acids by precolumn derivatization with 6-aminoquinolyl—N—hydroxysucciniomidyl carbamate and high—performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J]．J Chromatogr．1 994．670(1)：59—62． (责任编辑：杨 勇) 维普资讯 http://www.cqvip.com