藤黄新酸抑制肝癌细胞生长的机制研究

藤黄新酸抑制肝癌细胞生长的机制研究 * 徐 波 邢 丞 李 敏 郭 维 崔景荣 ** (北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100083) 摘要 在肿瘤细胞中蛋白酶体活性的抑制可以导致细胞凋亡和周期阻滞.藤黄新酸(TH2)是从中药藤黄中提取的一个新的 酮 类衍生物.研究结果显示，TH2可以抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖，诱导细胞产生凋亡，且呈浓度和时间依赖性.同时， 10!mol/L的TH2与细胞作用24h后，可以导致早期凋亡标志性蛋白PARP发生裂解.在体外采用特异性荧光底物检测TH2 对蛋白酶体活性的影响，发现该化合物能够抑制蛋白酶体的糜乳蛋白酶样、胰蛋白酶样活性和谷氨酰后水解活性.抑癌基因 p53是细胞内的蛋白酶体降解底物，TH2可使 p53蛋白的降解受到阻滞，达增加.由此可见，TH2具有抑制人肝癌 Bel-7402细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用，可能的分子机制与其抑制细胞内蛋白酶体活性、导致p53蛋白降解受阻有关. 关键词 藤黄新酸，蛋白酶体，Bel-7402细胞，凋亡，p53 学科分类号 R965.1 *国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2004AA2Z3783). **通讯联系人.Tel:010-82802467,E-mail:jrcui@bjmu.edu.cn 收稿日期：2006-11-06，接受日期：2006-12-06 生物化学与生物物理进展 ProgressinBiochemistryandBiophysics 2007,34(5):503~508 研究报告ResearchPapers 泛素-蛋白酶体途径是一条广泛存在于真核细 胞内依赖ATP的蛋白质降解途径.由泛素、泛素活 化酶、泛素偶联酶、泛素-蛋白连接酶、26S蛋白 酶体和泛素再循环酶组成.其中26S蛋白酶体是蛋 白质降解的场所，由1个20S核心蛋白酶体和 2 个19S调节复合物组成.20S蛋白酶体由14种不 同的蛋白亚基组成，其中7个同源的α亚单位和7 个同源的β亚单位分别组成α环、β环、β环和α 环，4个环层叠形成圆筒状结构.α环形成底物蛋 白通道，主要用于底物识别以及与调节亚基结合， 构成26S蛋白酶体；β环上存在催化亚基，主要 参与底物降解.已发现20S蛋白酶体具有3种明显 的酶活性：类似胰凝乳蛋白酶(chymotryptic-like， CT-L)的活性，位于β5亚基上；类似胰蛋白酶的 (tryptic-like，T-L)活性，位于β2亚基上；谷氨酰 后水解活性(postglutamylhydrolase，PGPH)，位于 β1亚基上[1～3].泛素-蛋白酶体途径能够选择性地降 解蛋白质，使细胞内各种蛋白质的降解受到精确的 调控.从而维持了细胞许多重要生理功能，如周期 调控、转录调控、抗原提呈和凋亡等.目前发现， 许多遗传性和获得性疾病的发生都与此途径功能失 调有关，特别是肿瘤疾病[4]. 在蛋白酶体抑制剂的研究过程中，实验已证 实，特异性的抑制剂可以明显抑制肿瘤细胞增殖， 阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤血管形成 以及肿瘤转移，同时还可以提高肿瘤细胞对化疗放 疗的敏感性[5].到目前为止，已经发现了多种蛋白 酶体的抑制剂，其中硼酸肽类抑制剂 bortezomib (VELCADETM)已进入三期临床试验，用于治疗多发 性骨髓瘤和其他肿瘤[6].然而，近年来蛋白酶体作 为某些抗肿瘤药物的第二作用靶点的研究也越来越 受到重视[7,8].Vinblastine是一个作用于细胞微管的 抗肿瘤药物.研究发现，它可以在体外抑制蛋白酶 体的胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性，同时能够 引起HL-60细胞内泛素蛋白的聚集和 I"B的表达 增加[9].因此认为，蛋白酶体作为一种新的靶标， 为开发新的抗肿瘤药物提供了新思路，其抑制剂的 应用也为肿瘤治疗提供新的方向. 藤黄(Gamboge)为藤黄科(Guttiferae)植物藤黄 树(GarciniahanbaryiHook·f·)的树干被割伤后流出 的胶状树脂.主要产于柬埔寨、泰国、越南.同科属 植物在我国南方广东省和海南省也有分布.其生物 学活性在中国古代医书上早有记载，具有消肿、化 毒、止血、杀虫的功效[10].近20年来的研究表明， 中药藤黄具有抗肿瘤活性，临床上用于治疗乳腺 癌、淋巴肉瘤、皮肤癌均取得一定的疗效[11].目前 已分离出的主要活性成分有藤黄酸(gambogicacid)、 http://www.pibb.ac.cn/cn/ch/common/create_pdf.aspx?file_no=20060874&flag=1 圸口 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(5) Fig.1 ThestructureofTH2 O O O O CH3 H3C CH3 CH3 CH3CH3 CH3 H3C OH OH HOOC H CH3 新 藤 黄 酸 (neogambogicacid)和 别 藤 黄 酸 (allogambogicacid)等.藤黄新酸(TH2)是一类与藤黄 酸结构相似的新衍生物，其生物学活性尚未见报 道.1982年雷秋模等[12]实验表明，藤黄对小鼠腹水 型肝癌ECA有抑制作用，对体外培养的Bel-7402 和SMMC-7721肝癌细胞株有明显的杀伤作用.研 究还发现，藤黄及其提取物对其他肿瘤也有抑制作 用[13].鉴于肝癌是目前人类恶性程度最高、死亡率 最大的一类肿瘤，本文将着重探讨藤黄提取物藤黄 新酸对体外培养的人肝癌 Bel-7402细胞生长的影 响，并对其作用机制进行初步研究，为中药藤黄在 临床上的应用提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 试剂 RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司.小鼠 抗人PARP单克隆抗体、蛋白酶体T-L特异性荧光 底物 Z-Ala-Arg-Arg-AMC为 CALBIOCHEM公司 产品.小鼠抗人P53单克隆抗体、辣根过氧化物酶 偶联的山羊抗小鼠二抗及山羊抗兔二抗、蛋白酶体 CT-L特异性荧光底物Suc-Leu-leu-Val-Tyr-AMC和 PGPH特异性荧光底物 Z-Leu-Leu-Glu-!NA为 Sigma公司产品. 1.2 化合物 藤黄新酸(TH2)(中国专利申请号 03109398)， 由中国人民解放军北京军医学院黄正明教授提供. 其分子式为C38H45O8；分子质量629；化学名：2- 丁烯酸，4-[9-(3，7-二甲基-2，6-辛二烯基)- 3，4，5，7-四氢-8，10-二羟基-3，3-二甲基 -11-(3-甲基-2-丁烯基)-7，13-二羰基-1，5- 亚甲基-1H，3H-呋喃-[3，4-d]占吨-1-酰基] -2-甲基 -[1R-1"，1(Z)，3#$，5%，9(E)， 12&S]].结构式如图1所示.藤黄新酸为黄色结晶， 溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成100mmol/L的 储备液， -20℃储存，用时以PBS稀释成相应浓 度.实验中DMSO的含量低于0.1%. 1.3 细胞培养 人肝癌细胞 Bel-7402由本实验室保存,以含 10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉 素的 RPMI-1640培养基,置 37℃、5%CO2、饱和 湿度条件下培养,常规消化传代. 1.4 乙酰罗丹明B(SRB)法 取对数生长期细胞5×104/ml，接种于细胞培养 板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的化合物，作用 一定时间.将细胞在10%三氯醋酸溶液中，4℃条 件下固定 1h.去离子水冲洗，空气干燥后加入 0.4%乙酰罗丹明B(SRB，Sigma公司)溶液(1%醋 酸溶解)，室温染色15min，用1%醋酸溶液冲洗游 离的 SRB染料，空气干燥.最后加入 10mmol/L Tris溶液，充分震荡后于540nm处测定吸光度值 (A540).按如下公式计算细胞活力：样品组平均A值 /溶剂对照组平均A值×100%. 1.5 流式细胞术分析 离心收集细胞，用冷PBS清洗，70%乙醇固 定过夜.样品上机前用 PBS洗涤，再加入 1mg/L RNA酶于37℃孵育30min，PBS清洗2次，加入 适量10mg/L碘化丙锭和0.1%TritonX-100，由流 式细胞仪(BectonDickinsonFACScan)检测分析，激 发光/发射光在488nm/525nm.凋亡SubG1峰用 CellQuest3.2软件(Becton-Dickinson)读取数据并 分析. 1.6 蛋白质印迹反应 离心收集细胞，用冷的PBS清洗2遍.加入适 量细胞裂解液(10mmol/LTris-HCl，pH7.4，1% NP-40， 150mmol/LNaCl， 2mmol/LEDTA， 5mg/LAprotinin，5mg/LLeupeptin和 50’mol/L PMSF)置于冰上孵育30min，在4℃以14000g离 心30min.小心取上清，即为细胞全蛋白质.蛋白质 浓度用BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce公司)测定. 每个样品取蛋白质 50μg，加入 5×上样缓冲液 (125mmol/LTrispH6.8，20%甘油，4%SDS和 10%二巯基乙醇)，95℃加热5min后用10%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.电泳后的样品电转移至 硝酸纤维素膜上，在含 5%小牛血清白蛋白的 TBST中室温封闭1～2h，与适合比例稀释的一抗 (PARP1∶100，p531∶200，β-actin1∶2000)4℃ 孵育过夜，TBST清洗，再分别与相应的辣根过氧 化物酶标记的二抗室温反应1h，用TBST充分洗 涤后，ECL发光试剂盒显色(GEHealth公司). 504· · 徐波等:藤黄新酸抑制肝癌细胞生长的机制研究2007;34(5) 1.7 体外蛋白酶体活性的测定 在 100!lTris-HCl(20mmol/L，pH8.0)的反 应体系中含有1"g纯化的20S蛋白酶体(参照文献 [14]方法提取)、不同浓度的化合物和 100#mol/L 蛋白酶体特异性荧光底物，在37℃条件下反应1h. 用 多 功 能 读 板 机 (FluostarOPTIMA， BMG Germany)在 380nm/440nm (-AMC 底 物 )或 335nm/410nm(-$NA底物)的激发波长/吸收波长 下读取荧光数值A，A值与蛋白酶体酶活性呈正相 关性.已知的蛋白酶体抑制剂 MG132和 0.1% DMSO分别用作阳性对照和溶剂对照.用以下公式 计算各浓度化合物对纯化的蛋白酶体酶活性的抑制 率，抑制率=(A溶剂对照-A化合物)/A溶剂对照×100%. 1.8 统计学处理 所有数据均用x±s表示，计量资料分析采用 Student%st检验. 2 结 果 2.1 藤黄新酸对Bel-7402细胞存活率的影响 初步结果显示，藤黄新酸对多种人肿瘤细胞的 生长有抑制作用(结果未显示).这里仅对较敏感的 人肝癌细胞株Bel-7402做进一步研究.藤黄新酸与 人肝癌Bel-7402细胞共同孵育，细胞的生长受到 抑制.图2可见，当藤黄新酸浓度在10&mol/L时， 细胞的存活率由 12h的 86%降低到 48h的 17.2%，且这一抑制作用随药物浓度的提高及作用 时间的延长而明显增强.细胞经瑞式-吉姆萨染色 后在光学显微镜下观察，在给药组中，细胞数量明 显减少，细胞膜皱缩，胞浆减少，染色质加深，核 固缩(结果未显示). 2.2 藤黄新酸对Bel-7402细胞凋亡的影响 为了检测藤黄新酸是否可以引起肿瘤细胞产生 凋亡，我们采用单参数流式细胞分析法观察亚二倍 体凋亡(sub-G0/G1期)峰的出现，该峰代表亚二倍 Fig.2 EffectofTH2oncellgrowth Humanhepatocellularcarcinoma(Bel-7402)wasexposedtoincreasing concentrations(2.5to20’mol·L-1)ofTH2forindicatedtimes. SurvivingfractionsweredeterminedbySRBassay.Dataweregivenas meanoftriplicatex±s.***P<0.001;**P<0.01.●—●:2.5(mol/L; ▲—▲:5)mol/L/;■—■:10*mol/L;○—○:20+mol/L. 120 100 80 60 40 20 0 12 24 36 48 60 72 t/h % of su rv iv in g fr ac ti on ** ** ** ** ** *** *** *** *** Fig.3Pro-apoptoticeffectofTH2 Sub-G1peakofBel-7402cellsexposedtodifferentconcentrationsofTH2for24h(a)orBel-7402cellswereexposedto10,mol/L ofTH2forindicatedtime(b). 505· · 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(5) Fig.4 EffectoftheTH2treatmentonPARPprocessing Bel-7402cellswereexposedat37℃toeitherincreasingconcentrations ofTH2for24h(a)or10!mol/LTH2forindicatedtimes(b).Aliquots ofeachsolubilizedcelllysateweresubjectedtoelectrophoretic separationandelectro-blottingfortheimmunodetectionofPARP.Full lengthPARP(p116)andthecleavageproduct(p85)areindicated. "-actinwasusedtocontrolequalloading,andproteasomeinhibitor MG132wasusedaspositivecontrol. 0 MG132 2 5 10#mol/L PARP 116 85 45 ku $-Actin (a) TH2(24h) PARP &-Actin (b) 0 6 12 24 36h 116 85 45 ku TH2(10(mol/L) 体DNA的产生，是凋亡的特点之一.如图3所示， 不同浓度藤黄新酸处理Bel-7402细胞，24h后发 现 sub-G0/G1期峰逐渐增大，由溶剂对照组的 2.31%增加到给药组的8.66%(5)mol/L)和24.97% (10*mol/L).当给药浓度为10+mol/L时，随着藤 黄新酸作用时间的增加，亚二倍体凋亡峰也持续增 加，呈正相时间依赖性. 2.3 藤黄新酸对凋亡相关蛋白表达的影响 为了进一步获得藤黄新酸诱导细胞凋亡的分子 水 平 证 据 ， 我 们 对 凋 亡 标 志 性 蛋 白 -poly (ADR-ribose)polymerase(PARP)的表达进行了分析. 以蛋白酶体特异性抑制剂MG132(10,mol/L)为阳性 对照，考察了藤黄新酸对Bel-7402细胞内PARP蛋 白表达的影响.如图4所示，溶剂对照组只检测到 一条 116ku的 (ADR-ribose)polymerase(PARP)蛋 白.然而，当Bel-7402细胞经10-mol/L藤黄新酸 作用24h后，在85ku处又检测到一条裂解带(图 4a)，且裂解带灰度随给药时间的增加而加强(图4b). 2.4 藤黄新酸对体外20S蛋白酶体活性的影响 本实验采用特异性荧光底物来检测藤黄新酸对 体外20S蛋白酶体CT-L、T-L和PGPH活性的影 响.16.mol/L的藤黄新酸作用于从人红细胞中纯 化的 20S蛋白酶体 1h，其对蛋白酶体的 CT-L、 T-L和 PGPH活性的抑制率分别达到了 52.8%、 55.3%和56.2%，并且这种作用随浓度的增加而逐 渐加强(图5).阳性对照MG132是醛肽类蛋白酶体 抑制剂，能够可逆性地抑制蛋白酶体的活性.当浓 度为1/mol/L时，MG132显著抑制了CT-L活性, 其抑制率达82.8%.但在相同浓度条件下，MG132 对T-L和PGPH活性没有影响. 2.5 藤黄新酸对p53蛋白表达的影响 为了考察藤黄新酸对细胞内蛋白酶体功能的影 响，首先检测了不同浓度的藤黄新酸作用于 Fig.6EffectsofTH2treatmentontheaccumulationsof proteasomaldegradation-relatedproteinsp53inBel-7402 cells Bel-7402cellswereexposedtoeitherincreasingconcentrationsofTH2 for24h(a)or100mol·L-1TH2forindicatedtimes(b).Celllysates wereelectrophoresedon10%sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gelsforP53andblottingontoanitrocellulosemembrane.Membrane wasprobedwithantibodiestoP53andactin.Actinwasusedtocontrol equalloading,andproteasomeinhibitorMG132wasusedaspositive control. P53 1-Actin P53 3-Actin 53 54 ku 0 MG132 2 5 105mol·L-1 TH2(24h) 0 6 12 24 36h TH2(106mol·L-1) 53 54 ku (a) (b) Fig.5EffectofTH2ondifferentproteolyticactivitiesof 20Spurifiedproteasomes 20Sproteasomepurifiedfromhumanerythrocyteswasincubatedwith indicated concentrationsofTH2 and thefluorogenicsubstrates (Suc-Leu-leu-Val-Tyr-AMCforchymotrypsin-likeactivity(openband); Z-Ala-Arg-Arg-AMCfortrypsin-likeactivity(solidband))in1007l 2008mol/LTris-HCl(pH8.0).Releaseofthefluorescentgroupswas measuredwithaspectrofluorometerafter1hreactionat37℃.Activitiesare expressedrelativetonocompoundstreatment,equalto0%inhibition.Data wasgivenasmeanoftriplicatevalues±s.Significantdifferencefromvalue of0.1%DMSOsolventcontrol;***P<0.001;**P<0.01.□:Chymotrysin- like;■:Trypsin-like; :PGPH. ** ** ** ********* *** *** *** *** 4 8 16 32 MG132 c(TH2)/(9mol·L-1) 100 80 60 40 20 0 In hi bi to ry ra te /% 506· · 徐波等:藤黄新酸抑制肝癌细胞生长的机制研究2007;34(5) Bel-7402细胞对p53蛋白表达的影响.图6显示， 2!mol/L的藤黄新酸作用 24h就可显著增加 p53蛋白的表达.在短时间刺激细胞的情况下 (6h)， 10"mol/L的藤黄新酸可导致 p53蛋白的 累积. 3 讨 论 中药藤黄在肿瘤防治中的研究报道始见于20 世纪80年代，后有学者进一步确定了其主要的有 效成分是以藤黄酸和新藤黄酸为代表的桥环 酮类 化合物[12].研究表明，这两种化合物均能抑制多种 肿瘤细胞的生长，阻断细胞周期于G2期，同时诱 导细胞产生凋亡[12].体外和体内的裸鼠试验结果显 示，藤黄酸能够抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生 长[15]，其机制可能与端粒酶活性抑制、凋亡相关基 因表达改变有关[16].藤黄新酸与藤黄酸具有相似的 化学结构，只是前者C1位上的醚键被打开，形成 了羟基.我们的实验结果表明，藤黄新酸同样具有 很强的抑制肝癌细胞生长的作用.当藤黄新酸的浓 度为10#mol/L作用24h，可诱导大量肿瘤细胞产 生凋亡，并且使PARP蛋白完全裂解，进一步说明 了藤黄新酸的抗增殖活性可能与其诱导细胞凋亡 有关. 众所周知，蛋白酶体的活性与细胞周期调控、 基因转录和凋亡等有着密切联系[17].目前，蛋白酶 体抑制剂以肽类化合物为主，能和蛋白酶体 !亚 基上的活性位点形成共价或非共价结合，主要抑制 其CT-L活性，同时也会轻微影响T-L和PGPH活 性[5].MG132是一个醛肽类的抑制剂，它可以和蛋 白酶体的 !5活性亚基的苏氨酸残基末端形成非共 价结合，从而有效抑制其CT-L活性.只有在高浓 度时MG132才对另外2个酶活性有影响.我们的 结果显示，藤黄新酸对蛋白酶体的3种酶活性具有 相似的抑制作用，提示该化合物可能和蛋白酶体的 3个催化亚基都有结合，或者是通过和其他亚基结 合而发挥效应.有证据表明，化合物可以与非催化 亚基结合，通过变构效应影响蛋白酶体对底物的降 解[18].藤黄新酸是否也是通过该途径而抑制蛋白酶 体活性及其深入的机制还有待进一步证实. 在蛋白质降解过程中蛋白酶体的CT-L活性起 着决定性作用.一旦该活性被抑制，细胞内的蛋白 质降解将受到阻滞，细胞的正常生命活动 (如增 殖、周期调控等)也会被破坏.为了进一步考察藤 黄新酸对细胞内蛋白酶体功能的影响，我们还检测 了藤黄新酸作用于人肝癌细胞后抑癌基因p53蛋白 的表达.p53是一个重要的抑癌基因，是细胞周期 阻滞和细胞凋亡的关键介质.P53蛋白的过度表达， 既可以通过p21wAf21途径影响细胞周期，也可以 通过改变凋亡相关蛋白 Bax/Bcl-2的表达，引起 DNA损伤和凋亡[21]；同时，p53蛋白也是泛素蛋白 酶体通路的酶解底物[22].在肿瘤细胞中，p53表达 下降与蛋白酶体活性增强而导致其降解增加有关. 然而，蛋白酶体抑制剂可以通过影响蛋白酶体活性 来阻碍 p53的降解，引起细胞凋亡[23].研究显示， 藤黄新酸作用于Bel-7402细胞导致 p53蛋白表达 增加.由此推测，藤黄新酸可能是通过影响蛋白酶 体的活性来阻碍细胞内蛋白质的降解，致使p53发 生累积，从而引起细胞产生凋亡. 总之，中药藤黄提取物藤黄新酸具有抑制人肝 癌Bel-7402细胞生长、诱导细胞凋亡的作用，可 能的分子机制与其抑制细胞内蛋白酶体活性、导致 p53蛋白降解受阻有关.该化合物对其他肿瘤细胞 及对荷瘤小鼠的抗癌作用研究正在进行之中. 参 考 文 献 1 RockKL,GoldbergAL.Degradationofcellproteinsandthe generationofMHCclassI-presentedpeptides.AnnuRevImmunol, 1999,17:739～79 2 UnnoM,MizushimaT,MorimotoY,etal.Thestructureofthe mammalian20Sproteasomeat2.75$resolution.Structure(Camb), 2002,10(5):609～618 3 GrollM,DitzelL,LoweJ,etal.Structureof20Sproteasomefrom yeastat2.4%resolution.Nature,1997,386(6624):463～471 4 AdamsJ.Proteasomeinhibition:anovelapproachtocancertherapy. 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