氟康唑和特比奈芬对HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌抗真菌后

氟康唑和特比奈芬对HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌抗真菌后 南方医科大学,,,,级硕士学位氟康唑和特比奈芬对,，,感染者口腔白色念珠茵和光滑念 珠菌抗真菌后效应的体外研究 ,,, ,, ,,,,, ,,,,—,,,,,,,,,, ,,,,;, ,, ,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,，,,,,,,;,,, ,,,,,,,,课题来源:卫生厅科学基金资助项目 广东省医学科学技术研究基金资助项(,,,,,,,,，,,,,,,,,) 专 业 名 称 口腔临床医学 学位申请人 陆晓璐 指 导 教 师 徐平平教授 罗 刚主任医师 黄建生主任医师 委员会主席 刘宏伟教授 答辩委员会成员 章锦才教授 吴补领教授 赵建江教授 梁焕友教授 论文评阅人 夏娟副教授 曾雄群主任医师 ,,, ,年,月,,日 广州 硕士学位论文 氟康唑和特比奈芬对,，,感染者口腔白色 念珠菌和光滑念珠菌抗真菌后效应的 体外研究 硕士研究生:陆晓璐 指导教师:徐平平教授 罗刚主任医师 一?一一，? ，,,,?—,?，?，，,,, 黄建生主任医师 ，、，????—??,,?,?,一?,—?， ? 摘 要 艾滋病的医学全称是“获得性免疫缺陷综合征??(,;？,,,,, ，,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,，,，,,)，其病原为“人类免疫缺陷病毒”(,,,,, ，,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,，,，,)。自从,,,,年美国疾病预防控制中心(,,,)第一次为艾滋病命名，世界卫生组织(,,,)就确认口腔念珠菌病是主要的机会性感染之一，并且是,，,感染的重要指标。例如，超过,,,的,，,感染者在他们病程中的某些阶段会发生口腔念珠菌病。 口腔是全身中分离出念珠菌最多的地方，健康个体中约有,,,至,,,可以检测到，其定殖率随着疾病的严重程度和住院治疗持续时间的增加而增加。其中白色念珠菌是最普遍的念珠菌病原体，它能侵入所有人体组织，被认为是主要引起免疫功能缺陷患者严重和持续性感染的一种重要病原体。近年流行病学研究还显示，随着免疫抑制剂在临床的广泛使用，以及免疫缺陷人群的增多，尤其是,，,,疫情的蔓延，光滑念珠菌在临床的检出率明显增加，在某些地区光滑念珠菌已成为仅次于白色念珠菌的第,位或第,位的常见念珠菌。在之前的一个研究中，我们收集了,,例,，,感染者的口腔含漱液，有,,例培养出念珠 中文摘要—,?， 菌，其中有,,例可以分离出白色念珠菌，,,例可以分离出光滑念珠菌，同时分 离出白色念珠菌和光滑念珠菌的有,,例。由此可见，在,，,感染者中，除了主 要的白色念珠菌外，光滑念珠菌的检出率也在增高。 随着抗真菌药物的频繁应用，念珠菌耐药现象也越来越普遍。氟康唑是一 种常用的抗真菌药物。在晚期,，,,患者中，耐氟康唑的念珠菌感染的年发病率 约为,(,,，并且是预后差的标志。在传统的抗真菌药产生耐药性后，大量新型 抗真菌药物例如阿莫罗芬、萘替芬、特比萘芬、普霉素和伏立康唑等不断问世。 尽管目前这些药物在临床上是有效的，可是这些药物的口腔药效学数据非常有 限。 我们设想，抗真菌后效应(,,,,(,,,,,,,,,, ,,,,;,，,,,,)有可能产生低毒 力念珠菌。抗真菌后效应，指的是将真菌暴露于浓度高于最小抑菌浓度(,，,) 的某种抗真菌药后，再除去培养基中的药物，在去除抗真菌药物后的一定时间 范围内真菌生长受到持续抑制的现象。目前有文献研究抗真菌药对念珠菌是否 存在,,,,以及进行,,,,的测定。,,,,,,,对两性霉素、,(氟胞嘧啶、制霉菌 素、酮康唑、氟康唑及伊曲康唑等抗真菌药 物作用于白色念珠菌产生的,,,,进 行研究，实验结果证明两性霉素、,(氟胞嘧啶和制霉菌素对白色念珠菌具有较好 的,,,,，而唑类药物只在体外有血清的培养基中才对白色念珠菌具有,,,,。 ,,,,,,,,等在对,,株口腔白色念珠菌分离株的研究发现，制霉菌素、两性霉素, 和,(氟胞嘧啶可以观察到明显的,,,,，酮康唑只能观察到一个边缘,,,,值， 而氟康唑很少或几乎没有。,,,,,,,,等报道了几个源自,,腔的念珠菌种属短暂暴 露于制霉菌素后产生数小时,,,,，制霉菌素引发的,,,,平均持续时间最短的 是白色念珠菌(,(,, ,)，最长的是近平滑念珠菌(,,(,, ,)，而克柔念珠菌(,,(,, ,)、热带念珠菌(,,(,, ,)、光滑念珠菌(,(,, ,)分别得到中间值，证实了,,,, 同样存在于非白色念珠菌。 目前关于念珠菌属,,,,引起的毒力改变的资料很少，,,,,对念珠菌的细 胞属性的影响至今还没有被广泛地研究。念珠菌在口腔黏膜定殖和造成感染是 ，， 硕士学位论文一个复杂的过程，主要涉及三个方面:一是宿主的抵抗力，包括机体免疫状况和黏膜损伤等;二是念珠菌与口腔原驻菌之间的相互关系;三是念珠菌自身的毒力水平。而与念珠菌相关的毒力因素主要有粘附性、细胞表面疏水性、与侵入有关的酶、溶血性、菌相转换和表型转换等。细胞表面疏水性是念珠菌一种非特异性的作用力较低的粘附力，也是念珠菌粘附宿主表面的一个互补因子; ? „:念珠菌通过粘附来识别定殖;通过利于其侵入的侵袭性酶来破坏黏膜完整性，增强毒力:通过溶血性获得营养;通过形态发生及酵母相和菌丝相之间的菌相转换而使其利于侵入宿主，并对该微生物的适应性有利。 ,，,感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌在小剂量氟康唑和特比奈芬的作用下能否产生,,,,是本实验关心的主要问题。此外，抗真菌药物处理之前与之后的,,,,能否引发念珠菌的毒力变化，能否降低念珠菌的毒力，使其致病力下降，这也是值得关注的。因此本文选取,，,感染者口腔白色念珠茵和光滑念珠菌各,,株，评估短暂暴露于小剂量的氟康唑和特比奈芬后产生的,,,,情况，并通过研究其对颊黏膜上皮细胞(,,,,, ,,;;,, ,,,,,,,,,, ;,,,，,,,)的粘附性和胞外磷脂酶活性两个毒力因素，比较使用药物处理并产生,,,,后引发的念珠菌的毒力变化，来探讨,，,感染者口腔不同念珠菌菌种抗真菌药物的后效应与念珠菌毒力之间的关系。,(目的: 评估,，,感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌临床分离株短暂暴露于小剂量的氟康唑和特比奈芬后产生的,,,,，从粘附性和胞外磷脂酶活性两个毒力因素研究产生,,,,后念珠菌的毒力变化，探讨,，,感染者口腔不同念珠菌菌种抗真菌药物的后效应与念珠菌毒力之间的关系。,(方法: 从冻存的菌株中挑选,,株白色念珠菌和,,株光滑念珠菌临床分离株，复苏后保存在沙保培养基中，,,?，培养,,,。 将氟康唑和特比萘芬分别溶于二甲基亚砜(,,,,)溶液中，配成质量浓 , 中文摘要 度均为,,,,,肛,,,,的溶液(特比萘芬药液母液中另按,,比例加入吐温(,,)， 用,,,， , ,,,液体培养基稀释成所需浓度。 (,),，,(最小抑菌浓度)的确定 氟康唑和特比奈芬对所有菌株的,，,，按照,;,,,,,,,,,,,,,,的肉汤稀释 法来确定。使用,,,,,;,,,,,,,浓度的接种物两倍连续稀释于,,孔板药物中。在 ,,?中培养,, ,后，抑制念珠菌细胞生长的最小药物浓度即为,，,。 (,),,,,分析 实验组将,(,,,菌悬液加入含,,, ,,,， ,,,,液体培养基和药物溶液的试管 中。使用的药物浓度为,, ,，,、,, ,，,和,, ,，,浓度的氟康唑、,, ,，,、,, ,，,和,, ,，,浓度的特比奈芬。对照组将,(,,,菌悬液加入,,,不含药物的,,,， ,,,,,液体培养基的试管中。每个试管中的菌悬液浓度为,,,”,,, ;,,,,,,,。 将试管置于,,”(,旋转培养箱中，, ,后用无菌,,,离心两次(,,,,,，,,,,,)，以去除药物。然后将上清液完全倒出，沉淀物再悬浮于,(,,,的无菌,,,。在,,,,分析前，对照组和实验组在药物去除后重新进行活菌计数，菌悬液浓度重新配置至,,,,,, ,;,,,,,,,。 每个菌悬液取,,,,,,加入已包含,,,,,, ,,,， ,,,,液体培养基的,,孔板滴定孔。然后将,,孔板放入,,?温箱振荡培养，在念珠菌生长的,, ,内，每隔,, ,,,用酶标仪检测培养液的浊度(波长为,,,,,)。,,,,的持续时间通过使用公式,,,,,,,,来计算，其中,是暴露于药物的菌悬液在去除药物后相对光学密度达到,(,,吸光度所需要的时间，,是没有药物的对照组菌悬液相对光学密度达到相同吸光度所需要的时间。 (,)念珠菌对,,,的粘附性实验 将,(,,,颊黏膜上皮细胞液和,(,,,菌悬液在试管中混匀，,,?振荡培养,,，用,,,,,聚碳酸酯滤膜的流形滤器在负压下收集,,,,，,,,, ,,,冲洗两次，置于载玻片上晾干，甲醇固定和革兰染色，,,,,的光学显微镜观察，计算,,,个颊黏膜细胞上粘附的念珠菌个数。 ，, 硕士学位论文 (,)念珠菌的磷脂酶活性实验 取菌悬液,,,,,接种于卵黄平皿表面，放置于室温晾干，,,。,培养,, ,后，菌落周围形成一明显的沉淀圈即为磷脂酶阳性的指标。磷脂酶活性(,,值)由菌落的直径与菌落加上沉淀圈的总直径的比率来确定。,,,菌落直径,总直径。,(结果 (,)念珠菌对氟康唑和特比奈芬的,,,,检测结果 白色念珠菌的,,,,检测结果:用两,检验分别比较暴露于不同浓度的两种抗真菌药物后菌悬液达到,(,,吸光度值所用的时间与对照组相比差异是否有统计学意义。在做两样本,检验之前先做方差齐性检验，若方差齐，采用一般,检验;若方差不齐，则采用近似,检验。在,,、,, ,，,浓度的,,,和×,、,, ,，,浓度的,,,,中大多数白色念珠菌菌株达到,(,,吸光度值所用的时间与未经处理的对照组相比差异有统计学意义(户(,(,,,，,,,,(,,,;户(,(,,,，,,,,(,,,,户(,(,,,，弘,(,,,:户(,(,,,，,,,,(,,,)，而,, ,，,浓度的,,,和,, ,，,浓度的,,,,与对照组相比差异没有统计学意义(,,,,,(,,,，尸:,(,,,:,,,(,(,,,,”“ 一,(,,,,,,,(,,,)。 光滑念珠菌的,,,,检测结果:光滑念珠菌分离株暴露于不同浓度的两种抗 ，真菌药物后，在,, ,，,浓度的,,,和×,、,, ,，,浓度的,,,,中，大多数光滑念珠菌菌株达到,(,,吸光度值所用的时间与未经处理的对照组相比差异有统计学意义(,,,,(,,,，,,,(,,,:户(,(,,,，,,,,(,,,:户(,(,,,，,,,(,,,)。,,浓度的,,,与对照组相比差异没有统计学意义(,,(,(,,,，,,,,(,,,)。 (,)短暂暴露于抗真菌药物后念珠菌对,,,的粘附性结果 白色念珠菌的粘附性结果:用两样本,检验比较暴露于药物中的试验组菌株对,,,,的粘附性与没有药物暴露的对照组菌株相比差异是否有统计学意义。在做两样本,检验之前先做方差齐性检验，若方差齐，采用一般,检验;若方差不 齐，则采用近似,检验。口腔白色念珠菌分离株暴露于,, ,，,浓度的氟康唑和×,,，,浓度的特比萘芬,,后，所有菌株对,,,,的粘附性降低，与没有暴露的对 , 中文摘要照组相比差异有统计学意义(户,(,,,，,,,,(,,,;,,,(,,,，,,,,(,,,)，粘附力减少的平均百分比分别为,,(,,,和,,(,,,。 光滑念珠菌的粘附性结果:口腔光滑念珠菌分离株暴露于,, ,，,浓度的氟康唑和,, ,，,浓度的特比萘芬,,后，所有菌株对,,,,的粘附降低，与对照组相比差异有统计学意义(户,(,,,，,,,,(,,,;,,,(,,,，,,,,,(,,,)，减少的平均百分比分别为,,(,,,和,,(,,,。 (,)短暂暴露于抗真菌药物后念珠菌磷脂酶活性结果 白色念珠茵的脂酶活性结果:用两样本,检验比较暴露于药物中的试验组菌株的胞外磷脂酶活性与没有药物暴露的对照组菌株相比差异是否有统计学意义。在做两样本,检验之前先做方差齐性检验，若方差齐，采用一般,检验;若方差不齐，则采用近似,检验。口腔白色念珠菌分离株暴露于,, ,，,浓度的特比萘芬,,后所有菌株的细胞外磷脂酶活性降低，与对照组相比差异有统计学意义(下降,(,,,，产(,(,,,，,,,(,,)。暴露于,, ,，,氟康唑的磷脂酶活性与对照组相比差异没有统计学意义(下降,(,,,，户(,(,,,，,,,,(,,,)。 光滑念珠菌的脂酶活性结果:口腔光滑念珠菌分离株暴露于,, ,，,浓度的氟康唑和,, ,，,浓度的特比萘芬,,后所有菌株的细胞外磷脂酶活性均呈阳性，磷脂酶活性分别下降,(,,,和,(,,,，暴露于特比萘芬的光滑念珠菌菌株与对照组相比磷脂酶活性差异有统计学意义(,,,,(,,,，,,,,(,,,)，暴露于氟康唑的光滑念珠菌菌株与对照组相比磷脂酶活性差异没有统计学意义(,,,,,,(,,,，,,,(,,,)。全文结论: ,(,，,感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌短暂暴露于低于致死浓度高于最小抑菌浓度的氟康唑和特比奈芬后都能够产生一段时间的,,,,，并且有药物浓度越高诱导的,,,,持续时间越长的趋势，说明只要给予足以维持超抑菌浓度的药物剂量，氟康唑和特比奈芬是可以诱导白色念珠菌和光滑念珠菌产生,,,,的。说明去除氟康唑和特比奈芬后的一定时间范围内，白色念珠菌和光滑念珠 ,， 硕士学位论文菌的生长仍处于持续受抑制状态。 ,(,，,感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌短暂暴露于低于致死浓度高于最小抑菌浓度的氟康唑和特比奈芬后，，对,,,的粘附力降低，与对照组相比差 „异有统计学意义。说明这种与口腔环境非常相似的情况即短暂地暴露于亚致死浓度的氟康唑和特比奈芬中，可以抑制白色念珠菌和光滑念珠菌的粘附和生长。 ,(,，,感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌短暂暴露于低于致死浓度高于最小抑菌浓度的抗真菌药物后都产生不同水平的磷脂酶，暴露于特比萘芬中的胞外磷脂酶活性下降，与对照组相比差异有统计学意义。暴露于氟康唑中的磷脂酶活性与对照组相比差异没有统计学意义。由于实验中我们是在培养,,,后检测念珠菌的磷脂酶活性，因此可以认为念珠菌的磷脂酶活性与暴露于抗真菌药的念珠菌的母代无关，而是与这些念珠菌的子代有关。因此实验结果说明，暴露于小剂量抗真菌药的影响可以持续保留到后代，从而影响白色念珠菌和光滑念珠菌的磷脂酶活性。 ,(以往文献将抗真菌后效应(,,,,)定义为将真菌有限暴露于抗真菌药物 :,,。中，随后通过稀释、药物失活或反复洗涤的方法将药物去除，真菌的生长受到持续抑制的现象【,,,。此定义并未涉及抗真菌药物对念 珠菌毒力属性的影响。总…儿(结以上实验结果，白色念珠菌和光滑念珠菌临床分离株短暂暴露于小剂量的氟康唑和特比奈芬后均能诱导出一段时间的,,,,，并且在,,,,期间，念珠菌对人类颊黏膜上皮细胞的粘附性和胞外磷脂酶活性两个毒力因素均有不同程度的下降，从而,,,,的临床意义不仅仅限于影响给药方案的制定，同时还可以抑制念珠菌的粘附力和致病性，降低念珠菌毒力。因此，我们认为,,,,的定义可以扩充为，将真菌暴露于浓度高于最小抑菌浓度的抗真菌药中，随后通过稀释、药物失活或反复洗涤的方法将药物去除，真菌的生长受到持续抑制，并且引起真菌毒力发生改变的一系列效应。关键词:,，,白色念珠菌光滑念珠菌,,,,粘附性磷脂酶 ,? 硕士学位论文 ,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;, ,, ,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ”;,,,,, ,,,, ,,,，,，， ,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,:,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,(,, ,,,,—,,,, ,,,,(,,, ,,,, ,,,,(,,,,, ,,,,(,,,,, ,,,,,,,, ,，,, ,, ,, ,;,,,,, ,,,”,;？,,,,, ，,,,,, ,,,,;,,,;, ,,,,,,,,”(,,,,,,,,,,, ,,”,,,,, ，,,,,,,,,,;,,,;, ,,,,,”(,,,)(,,,, ,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,; 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