给药体积与采血指导原则2

EFPIA（欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会）和ECVAM（欧洲替代方法验证中心） 2000年二月 草案 注释： 关于本的初稿，EFPIA/ECVAM关于给药及采血的途径和最大体积的指导原则，目前已经在下面的杂志出版， Appl J Appl Toxicol 21 15-23, 2001 前言 本文是由EFPIA与ECVAM联合首发的研究成果，其目的是为研究者提供一种最新的实验室安全性评价的技术。该资料有可简单使用的一系列数据表，以便于设计实验，同时考虑到对实验动物提供最大限度的权益保护（对实验动物最全面的考虑） 尽管这个原则是针对欧洲制药工业中的研究者，它同样适用于所有那些在其它研究领域使用动物作为实验手段的研究者，不管他们是在研究院、大学或者其他工业部门。这意味着该文稿可以引起像对药典测试担负着调整责任的管理者的一些讨论。有许多的出版物是关于如何对受试药物进行给药及如何采取血样的，此外，许多的实验室也有他们自己的多年来的习惯及从工作实践中发展起来的指导原则。在欧盟内部的指导原则86/609EEC (EU, 1986) ，我们有责任使实验规范化，使实验引起的应激最小化。我们希望这个指导原则能够为实验设计和实验评论（review）提供一些有用的相关数据（背景数据信息 background data）。 这些资料是以同行发表的文献为基础的，在任何时候可行，但在某些地方不可以应用，我们是以其各个实验室内部的实验小组常使用的数据和经验（也包括工业企业中的一些有用的方法）为最终的评价标准。（This document is based on peer reviewed publications whenever possible, but, where that is not possible, we have used ‘in-house’ data and the experience of those on the working party (as well as helpful comments submitted by the industry) for a final opinion.）为满足研究者日益增长的需要，该资料优化了关于药物给药及动物采血的技术并对这些技术的执行提供建议。（The document also addresses the continuing need to refine the techniques associated with administration of substances and withdrawal of blood and suggests ways of doing so.）实验室间资料的共享可避免重复的动物实验，同时也共享关于动物权益与由于“过量”所引起的一些科学性的问题。这个资料（涉及到的）提出的关于正常动物与某些特殊情况下给药量是十分必要的，例如给药量在妊娠期与哺乳期时与正常情况下是不同的。当给予大体积的药量以及受试药过多,特别是在实验动物被麻醉时，阐明药物的研究方法时（或许）是令人困惑的。 一．给药剂量的指导原则 绪论 对于各种各样的科学研究来说，实验动物的给药量达到规定的要求是十分必要的。尤其是在制药工业研究给药浓度与动物权益（福利）及合格的科学实验之间的一致性是十分必要的。 在新药的临床前安全性评价阶段，使用多种有效剂量是一些的规操作，是为了建立必要的用药安全范围，若化学药品是低毒的及所用的剂型是微溶的,将要求对动物个体使用大的给药体积,同时又要满足科学性及调整的要求。与常用的给药量相比，较大的给药量对临床目的用药来说或许更难让人接受例如，显像剂、用于静脉注射的血管增容剂。（The intended clinical use may also impact on the acceptability of larger than usual dose volumes）,。 工作小组的目的如下: a. 对使用于一般实验室的用于毒理学研究的不同种属的实验动物的给药体积(提供一个指导原则 b. 从动物权益和实用性方面，提供一个能体现该指导原则的常规使用的给药浓度。 C. 为常规实验操作中给药浓度上限值提供指导原则。并为特殊研究时陈述理由留有一定的空间。This leaves scope to make the case for special investigations. 1． 给药体积 表1 给出了一些经常被使用的实验动物的常规给药途径下的给药体积。由于目前在欧洲狨猴和小型猪越来越多的被使用，故而它们也被考虑在这个范围内。 Table 1 Administration Volumes Considered Good Practice (and possible maximal dose volumes)  Species Route and Volumes (ml/kg except *ml/site) Oral sc ip im iv bolus iv (slow inj) Mouse 10 (50) 10 (40) 20 (80) 0.05* (0.1)* 5 (25) Rat 10 (40) 5 (10) 10 (20) 0.1* (0.2)* 5 (20) Rabbit 10 (15) 1 (2) 5 (20) 0.25 (0.5) 2 (10) Dog 5 (15) 1 (2) 1 (20) 0.25 (0.5) 2.5 (5) Macaque 5 (15) 2 (5) - (10) 0.25 (0.5) 2 (-) Marmoset 10 (15) 2 (5) - (20) 0.25 (0.5) 2.5 (10) Minipig 10 (15) 1 (2) 1 (20) 0.25 (0.5) 2.5 (5) 关于上表的一些说明 1．(-)无数据 2．肌肉内注射时每天不能超过2次。 3．皮下注射时每天限制在2~3次。 4．皮下注射时，不包括弗氏佐剂的使用。 5．每一栏内有两组数字，左边的数字代表的是指导原则中适用于单次或多次给药时的给药体积。右边括号内的数字代表的是可能的最大给药体积。如果超过这个给药体积那么将会导致动物权益与实验的科学性之间产生矛盾。 在某些情况下，给药体积要与药典的要求相适应。 这些被建议的最大体积是从近年来的文献中获得的（Flecknell 1996;Wolfensohn & Lloyd 1998），这些数据与指导原则相比显得比较高。需要强调的，要小心地注意到动物的权益以及使用大体积的给药量时药物的成分组成是必要的，特别是打算多次给药时。研究的持续时间是限定的，同时，高的给药体积所引起的生理反应会危及科学上的有效性。（研究的持续时间了限定高的给药体积，同时，高的给药体积所引起的生理反应会危及科学上的有效性。）然而，从伦理道德的观点它却是一个基本的要点，在草案和工作尚未定下来之前，这些问题将被监察员和伦理委员会充分的考虑。这个操作规范之所以被强烈的推荐，除了从伦理道德的观点来考虑外，也是从体外的物理化学的相容性研究和小范围的试点研究（也就是使用小批量的实验动物）间的科学性来考虑的， 被应用于一些新的成份 在允许应用于较大范围的研究之前。给药体积应在给药的精确度与化合物的成分之间保持最小的一致It is also strongly recommended for ethical as well as scientific reasons that physicochemical compatibility studies (in vitro) and small scale pilot studies (small groups of animals) are carried out on any new formulation before committing to larger scale studies. Dose volumes should be the minimum compatible with compound formulation and accuracy of administration. 2.给药途径 ⑴口服给药 由于饮食因素可能会对吸收产生影响，因而有时，在给药之前限制动物的饮食是必要的。大体积的给药量（40ml/kg）会使胃容量超载以及快速的进入小肠 (Hejgaard et al 1999)。大体积的给药量也有可能反流进入食管。禁食的时间与给予实验动物的饲料、开始禁食的时间、受试药物的生理生化特性、食物和照明周期相关（Vermreulen et al 1997）。为了给药的正确性，推荐给药时采用流质的强饲法和给药时的意外事故。 ⑵非肠胃给药方式 a.对于非胃肠给药，常采用给药体积的方式来控制。应考虑到给药前后受试药的PH值、粘度、渗透压、缓冲容量、无菌性、生物相容性等组成因素的稳定性。对于多次给药来说，上述考虑尤其重要。这些因素的详情在Claassen（1994）中有较为详细的叙述。使用最小规格的针是考虑到给药体积、注射剂原料的粘性、给药速度以及注射剂的种类等因素。 ①皮下给药 这是一种我们经常采用的给药方式，受试药物吸收的速率、吸收程度与药物的组成有关 ②腹腔给药 　 这种给药途径一般不适用于多次给药的实验研究，主要是由于可能会引起一些并发症。当受试药物进入肠道后，可能会引起腹膜炎。药物在腹腔的吸收依赖于受试药物的颗粒大小、溶媒，药物可通过吸收进入全身（循环）和门静脉循环系统。 ③肌肉注射 由于药物被注射入肌肉时，肌纤维处于紧张状态，因而在肌肉注射时会产生痛疼感。注射部位要求选择在不会有危险的地方。多次给药时，要选择不同的注射位点。水溶液与油溶液有不同的要求（油溶液的吸收＞24小时）。对于多次给药来说，必须考虑到这种给药方式可能会引起局部炎症及并发症。 ④静脉给药 对于这给药方式，有静脉推注、静脉滴注、静脉灌注三种不同的方式。表1中的值上适用于静脉推注、静脉滴注。 Ａ：静脉推注：在很多的科学研究中我们都使用这种静脉给药途径，这种给药方式可使受试药在很短的时间内进入体内（大约在一分钟内）。如此的快速注射要求试样与血液之间要能配伍且粘性不能太大。当大体积的注射物质进入体内时，会对动物的体温形成危害。对于啮齿类动物来说，在静脉注射中，注射速度是一个非常重要的因素，给药速度不能超过3ml/min。观察到把盐以6ml/kg给狗快速静脉注射时，在血细胞容量计(分血器)、心率方面没有发现可观察到的改变，但是当用15%的血稀释剂稀释后(是联合的有15% haemodilution)，以20ml/kg 给药时，则会出现短暂的心动过速（46%以上的试样是在1分钟内给入）。 Ｂ：静脉滴注：由于临床应用时要求使用混合物，或是由于诸如溶解度、刺激性等限制性因素的原因，给药时采用静脉滴注是十分必要的。对于静脉滴注是指注射过程超过5~10min、使用蝶状针、在浅静脉中应用静脉管套（短期）、如外科手术般在使用前放置一段时间（或外科手术放置在未来居先使用）（较长时间或多次给药）。 当给小鼠每日以1ml/min的速度，80ml/kg的给药量，连续静脉注射等渗盐4天，经观察没有发现不良应激的显著体征以及肺损害。但以0.25, 0.5 ,1.0ml/min的速度给药且治疗时间延长至30天时，肺损害的严重程度和发生率增加（Morton et al 1997b）。 在早期时可产生可逆的影响，但早期病变没有时间继续发展，故而不发生上述现象。 Ｃ：连续输注 ：鉴于临床适应症和溶解性等相似的原因，选择连续输注上是必要的，同时如果输液时间被延长，仔细的考虑也是必要的。输注的体积、速度与受试药以及液体疗法相关。作为一个指导原则，在2小时范围内，单次给药的给药体积应小于循环血量的10%（the volume administered on a single occasion will be less than 10% of the circulating blood volume over two hours.） 对动物最短期的、最小压力的、有效的固定，对于维持长时间输液来说是个关键的因素。（Minimal effective restraint of animals with least stress is a key factor to consider for prolonged infusions.） 一次输注时总的持续时间也是一个因素。表2提供了推荐使用的关于非连续输注给药（每天4小时）及连续输注给药（24小时）的给药体积、给药速度。 Table 2 Repeated Intravenous Infusion -Dose Volumes/Rates (and possible maximal volumes/rates) Daily Infusion Period Mouse Rat Rabbit* Dog Macaque Minipig Total Daily Volumes (ml/kg) 4 Hour - 20 - 20 - - 24 Hour 96(192) 60(96) 24(72) 24(96) 60 24 Rate (ml/kg/h) 4 Hour - 5 - 5 - - 24 Hour 4(8) 2.5(4) 1(3) 1(4) 2.5 1 （-）无数据 *基于致崎学的研究 关于非水溶剂见正文。 在某些情况下，在表格中有两个数据，第二个带扩号的推荐使用的最大体积。家兔给药体积和速度的确定是基于对胚胎毒性的研究所得的数据，这些研究显示给予2ml/kg/h及以上报道的体积（McKeon等1997），对胎儿无影响，但可形成血管周围粒细胞套及增生的心内膜炎屏障。大鼠给药有代表性的注入速度是在1~4ml/kg/h的范围内（Cave等1995；Barrow及Heritier1995;Loger等1997），但在胚胎毒性研究中最好不要超过2ml/kg/h。小鼠(van Wijk1997)、狗、恒河猴（Perkin 及Stejskal1994）和小型猪（未发表数据）的给药体积均是基于为期一个月的重复剂量研究所得。 还有一些给药体积和速度的限制，指明了在高剂量体积时溶媒成分的重要性，这正是以下四篇已发表文献的要点所在（Cornelius等1978;Concannon等1992;Manenti等1992;Mann及Kinter1993）。这些数据表明通过静脉给药时，耐受体积有很大不同，这主要取决于所用的溶媒。关于溶媒对生理系统的长期效应问题，目前还未进行研究。 e.皮内给药 皮内是特征性的给药部位，主要用于评价免疫性、炎性或致敏性反应（Leenaars1997;Leenaars等1998）。药物也可按配方加入佐剂。可用的给药体积为0.05~0.1ml，其选择主要取决于皮肤的厚度。 3.给药所用的溶媒 对动物研究来说，溶媒的选择是个重要的考虑因素。溶媒自身应具有良好的溶解性，但不应影响所研究药物的效应。即理想的溶媒应不具生物学活性，对药物的生物生理特性不产生影响，而且对动物不具毒性。如果 溶媒中的一个组分具有生物学效应，它的剂量应进行限制，以保证其效应降到最低或不产生效应。单纯的溶媒过去常常是以混合物的形式给予的，包扩水溶性的等渗溶液、缓冲溶液、共溶体系、悬液和油剂等。而对于无水注射剂来说，在再次给药之前，应给予充分的时间以保证药物的吸收。给予悬液时，均应考虑到其黏度、PH值及渗透浓度。使用共溶体系时，需加以注意，因为溶媒自身在剂量范围内有其最大容许毒性。提倡实验室能基于所研究的动物和所试药物的特性，形成一套便于选择的最适溶媒的方案。 二．采血中可行的指导原则 １.引言 采血是对实验动物进行的最常见的操作之一，回顾关于实验中哺乳动物和鸟类的操作方法问题， BVA/FRAME/RSPCE/UFAW联合工作组对其细化问题首次进行了报道。这个当前通用的出版物的目的是为人们提供一个基于最新的、可得信息的、容易操作的指导原则，并且满足毒物代谢动力学（药物代谢动力学）和毒理学研究的需要。针对多种啮齿类动物所进行的眼球后静脉的采血技术，目前仍被广泛应用，出于对这种采血方法所致的后遗症问题的考虑，该对选择采血途径的建议问题进行了详述。 ２.循环血量 采血量的最大限值的计算，主要依赖于关于循环血量的精确数据。文献综述表明循环血量的数值有很大的差异，或许这可归因于所用的采血方法、动物品系和性别等方面的不同。最常被引用的确定循环血量的技术是放射性同位素标记的红细胞（Smith1970;Sluiter等1984;Fujii等1993）；放射标记的转铁蛋白（Argent等1994）；放射标记的血清白蛋白（Carvalho1989,Gillen等1994，Callahan等1995）；标记染料（Schad等1987）；酶稀释法（Visser等1982，Holmes及Weiskopf1987）；纤维光学法（Kisch等1995）及右旋糖酐70（Vankreel等1998）。 表3中给出了常用安全性评价研究中关于不同种属动物的循环血量值，以及在毒理学研究中极为常用的狨猴和小型猪的数据。所列数值均得自于不同来源、成年、健康和处于适当营养水平的动物。（Altman及Dittmer1974；Swenson1977;Jain1986;McGuill及Rowan1989; 首次报道于BVA/FRAME/RSPCE/UFAW1993） 表3：实验动物的循环血量 血量（ml/kg） 种属 推荐均数 数值范围 小鼠 72 63-80 大鼠 64 58-70 家家兔 56 44-70 狗（Beagle） 85 79-90 猴（恒河猴） 56 44-67 猴（短尾猴） 65 55-75 狨猴 70 -82 小型猪 65 61-68 ３.采血量 我们推荐的采血量的数据是根据已发表的作品，即将出版的为工作团体提供关于某论点信息而进行的近期工作成果，以及来自内部的标准化操作规程的信息。 当采血量接近最大限值时，实验动物的权益问题是首先应考虑的问题，但动物生理反应对研究结果的影响必须同时加以考虑。因为它可能会影响数据的分析和数据的正确性。如预期前提是通过动物所示的临床症状进行结果判定，在可疑病例中，采血样前应将治疗工作安排给动物管理或兽医工作人员。 Scipioni等（1997）的作品表明在24小时内采血达到大鼠总血量的40%及2周后重复此操作，不会引起严重的副作用。总之，关于动物采血后健康状况的关键性指标如心率、呼吸形式、不同的激素水平及外观方面如活动及活动时间的数据目前并不多，而这些指标或许会在采血时发生变化以适应过度的采血。但要在采血时研究这些指标的变化将需要付出极大的人力和物力。然而，血液学参数是很容易测定的，而且在小型的科研项目中，红细胞计数（RBC），血红蛋白浓度（HGB），红细胞压积（HCT），红细胞平均容积（MCV）及红细胞分布范围（RDW）均可在采取不同血量后进行测定。对于体重接近250g的雄性及雌性Sprague Dawley大鼠来说，24小时内采取占循环血量7.5%，11%，15%及20%的血量以模拟动态的研究，结果动物进行采血可达29天。 这个结果表明，所有这些参数回到基线水平所用的时间有相当大的变化（在15%~20%的组内，一些参数（MCV，RDW）在29天后仍旧没有回到基线）。在本文推荐了对多次取样的恢复时间，因此，这个时间是在‘体积’组的所有小鼠恢复至‘正常’（对每种动物来说，开始的水平可以增加或减少10%）。单次取样（诸如要求进行常规毒理研究）推荐不超过15%，因超过15%且抽血不是很缓慢的话，可能引起低血容量性的休克。而多次少量取样则不会产生这样的急性反应。 以下是一个针对最大采血体积和采血后足够的恢复时间的指导原则 ，采血后足够的恢复时间考虑到了多次采血引起的应激性，除了对所有的严重反应的操作评价外，这个表格描述（addresses）了所有的单次采血及多次采血的取血方式。添加了恢复时间，是由于在毒理研究中要求临界状态评价血液参数。 表4：取血体积的限制及恢复周期 一次取样（例如 毒性研究） 多次取样（例如毒代动力学研究） 取血量占循环血量的% 大致的恢复周期 24小时内取血量占循环血量的% 大致的恢复周期 7.5% 1 week 7.5% 1 week 10% 2 week 10-15% 2 week 15% 4 week 20% 3 week 较高的取血体积（20%）是为了使毒性研究和药物代谢动力学研究的连续采血更为便利，这两个方面的研究均需多次采血， 然而，同时我们也应该注意到采血量如此大引起的血液动力学效应的结果，或许会对适宜的半衰期产生影响。如果是在24小时内处死的动物其所采的血样用于评价消除（teminal）半衰期是可取的。这些数值是在当实验动物在实验最后阶段仍旧处于麻醉状态时采取的，不能被用于消除半衰期。目前还未考虑血液替代方法，因为建议体积不能保证无干扰。Blood replacement has not been considered since the volumes proposed do not warrant such intervention. 参考表4的数值，表5列出了一个方便的参考性指导，是有关对动物的正常生理没有显著干扰的采血体积。 Using the values from Table 4, an easy reference guide for the volumes which can be removed without significant disturbance to an animal’s normal physiology is presented in Table 5. 表5 给出体重的各种不同种属的实验动物的总血量及推荐的最大采血量 种属（重量） 血液体积(ml) 7.5 % (ml) 10 % (ml) 15 % (ml) 20 % (ml) 小鼠 (25 g) 1.8 0.1 0.2 0.3 0.4 大鼠 (250 g) 16 1.2 1.6 2.4 3.2 家兔子 (4 kg) 224 17 22 34 45 狗（10 kg) 850 64 85 127 170 猴 (恒河猴)(5 kg) 280 21 28 42 56 猴 (短尾猴)( 5 kg) 325 24 32 49 65 狨猴 (350 g) 25 2.0 2.5 3.5 5 小型猪 (15 kg) 975 73 98 146 195 ４．采血部位 静脉切开、静脉放血的部位考虑的主要是啮齿类与家兔子（First Report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW 1993）。这些资料已经在下面的表6、表7中根据有关的技术进步作了详细的表述，表6是关于在不同的部位进行采血时优点与缺点，表7是对推荐使用的重复采血的部位的概述。.  表 6: 各种不同采血方式的血样的利弊的概述 采血途径 （静脉） 普通麻醉 组织(1) 损伤 重复取血 体积 种属 颈静脉 no 低 yes +++ 大鼠 ,犬，家兔 头静脉 no 低 yes +++ 恒河猴、狗 隐静脉/跗外侧静脉 no 低 yes ++(+) 小鼠、大鼠 狨猴/恒河猴、狗 耳缘静脉 no (局部) 低 yes ++ + 家兔子、小型猪 股静脉 no 低 yes +++ 狨猴/恒河猴 舌下静脉 yes yes +++ 大鼠 尾部静脉 no 低 yes ++(+) + 小鼠/狨猴 耳中动脉 no (局部) 低 yes +++ 家兔子 颅腔静脉 no 低 yes +++ 小型猪 尾尖截段(<1-3毫米) yes 中 limited + 小鼠/大鼠 眼球后静脉丛 yes 中/高 yes +++ 小鼠/大鼠 心脏 (2) yes 中 no +++ 小鼠/大鼠、兔子 · 组织损伤发生的可能性是基于其发生的几率和并发症的严重程度，如炎症反应，组织学损伤。 · 只适用于在全麻时采用的致死性的操作。（只适用在全麻时采用的临终阶段进行操作。） 表 7:推荐使用的重复采血的部位 种属 推荐部位 小鼠 隐静脉/跗外侧静脉 大鼠 股静脉/跗外侧静脉、舌下静脉 兔 耳缘静脉、耳中动脉、颈静脉 狗 头静脉、颈静脉, 隐静脉 恒河猴 头静脉、股静脉, 股静脉 狨猴 股静脉, 股静脉 小型猪 颅腔静脉 在不同的部位所采集血样的临床病理学价值可能存在一些差异，并且对于既往数据库资料有着一定的潜在性关联，注意到这点是很重要的。 对于众多的传统采血途径而言，可以从标准文献资料来获得对其方法学的描述和讲解。然而，对于其它的一些方法需要进行特别的论述，内容如下： ①Lateral tarsal (saphenous) vein隐静脉/跗外侧静脉 这种技术已经在一些实验动物中进行了应用，包括大鼠，小鼠，大田鼠，沙鼠，豚鼠，白鼬（雪貂）, 水貂（Hem et al 1998），并且也在一些大型动物中进行应用，该方法可能获得约占5％的循环血容量标本。这种技术不需要对动物进行麻醉，所以很适合需进行反复采血的实验如药物动力学研究。隐静脉位于跗关节外侧，当进行了剃毛和涂擦酒精后就更易于发现。把实验动物（例如25－27克的大鼠和小鼠）置于合适的制动器（restrainer）之中，例如，可将实验动物放在一段塑料管中，使它不能活动。操作人员可以拉伸动物后腿，轻柔地按压跗关节上则该静脉凸起，使用最小号的穿刺针就能够使血液很快地流出，并且不会发生溶血现象。如果想获得微量标本，仅需在该部位进行一次针刺后使用微量管就可以快速地获得一滴标准血样。采完血样后只需压在该部位就可以有效制止进一步地出血，当需要采集序列标本时则只需揭去该处血痂即可。 除有很小量的持续性出血以外，使用该方法没有出现报道其它的并发症，而且这种方法有着不需要麻醉的便捷之处。虽然目前还没有在体重增加和昼夜规律等行为方式来对实验动物的权益进行研究，但该方法似乎不大可能对动物的权益（wellbeing）产生严重的影响。 ②耳缘静脉/耳中动脉 兔子和豚鼠的采血方式一般上是从耳缘静脉。该方法同时结合应用静脉内插管时也可用于小型猪。将动物固定好并在穿刺前20－30分钟使用一些乳剂型的局部麻醉药有助于防止当针穿过皮肤时动物头部的摆动。先在静脉表面涂抹油膏，然后再进行穿刺用试管在该处也可收集到标本。如果为取得大量的血样，在兔子的中央动脉穿刺后至少要压迫止血2分钟以免持续出血和在局部形成血肿。实验动物可被控制住，持续采血5分钟至十分钟后。（The animal should be checked for persistent bleeding at 5 and 10 minutes later.）使用留置针（留置的腔内套管）可以在该动脉进行反复采血，通过该方法可动态的采血超过8小时。 ③舌下静脉 该方法适于在啮齿动物比如大鼠，且该方法适合进行频繁采集大容量血样（如0.2－1ml），仅仅受到采血样和必要的反复麻醉的限制。（This technique is easy to perform in rodents such as rats and is suitable for the removal of large volumes of blood (eg 0.2 to 1ml) at frequent intervals, limited only by the blood volume to be removed and by the necessary repeated anaesthesia .）一项优化（refined）的方法（Zeller et al 1998）可消除在以前的实验方法中发现及使用的一些缺点，该方法可用于反复地采样。将大鼠麻醉并由助手保持为仰卧位，捏紧颈项部松弛的皮肤使得头部静脉回流血液产生淤积。第二个人用棉签轻轻地拉出大鼠的舌头，用拇指和食指抓住大鼠舌头，再用23－25g的皮下针头尽可能地靠近舌尖部位穿刺其中的一条舌下静脉（中线两侧各一条），翻转大鼠让血液滴入试管，获得所需血量后放开颈背并将大白鼠置于仰卧位。再次地拉出舌头用干棉签压堵穿刺血管即可，通常情况下无须使用任何止血措施。 用这种方法处理的大鼠在进食和进水、体重增加方面与那些未麻醉的动物比较时，二者之间没有任何明显的差异。此外，较之眼球采血还显现出更少的病理改变（Mahl et al, submitted）。然而，麻醉可能仍然是一个限制因素。 ④尾静脉 原则上说，这种方法和跗骨侧静脉相似，但只能提供更少的血量（小鼠为0.1 － 0.15ml , 温热的大鼠为2 ml）。可以使用注射器针头和穿刺针进行采血，由于无须麻醉故而这种方法非常适合反复采血。为了增加出血量使血管扩张是必要的，可以将试验动物的尾部局部加温或将试验动物放在37°C的环境中热暴露5－8分钟。这样做很少出现影响动物权益的不利因素，但是在进行热暴露时必须对动物进行严密的监控。 ⑤颈内静脉采血法（颅腔静脉） 首先要限制小型猪的活动，可以将其用绳索捆绑固定，或将其前肢用绳索固定在后背靠近尾部端，其他一些农业上有时使用固定方法（如绑住口鼻，整体捆绑，将后腿吊起固定）等，这对实验动物而言是种应激而并不适用，因为这会对科学研究产生潜在的负面效应。为了避免操作时损伤迷走神经，进针时应在胸骨柄侧缘，与左肩呈30-45度角方向的右侧颈部插入。当针进入静脉时，可通过取样机（sampler）感受到静脉的压力，然后即可很容易的采血。此方法也适用于连续的静脉穿刺术，但因抽出针头后进针部位易形成血肿，所以最好预先设定采血的程序，即不需每周采血的情况。（Swindle,1998） ⑥尾尖截断法采血法 尾尖截断法采血在大鼠和小鼠采血中使用广泛，采血量为0.1 ~0.2ml。截尾限于距尾尖0.5 ~1mm的范围内是恰当的（随着采血的进行，最多可截取5mm的尾尖），而且短时间内通过去除尾尖的凝血块，使尾尖重复出血以便采血也是可行的。但因进行一系列的截尾术而使尾部显著变短（即大于5mm）是不可取的。此技术不适用于年长的动物，而且建议麻醉后进行。 ⑦心脏穿刺采血法 此方法应在全麻下使用。在过去心脏穿刺采血术因缺少可供选择的治疗方法，它常被用来促进小啮齿类动物的愈复。然而，随着现在一些其他方法的出现和心脏穿刺采血方法又可引起疼痛和致命性的后遗症如心包出血和急性心包填塞等原因，此方法仅限用于临终采血。 ⑧眼球后静脉丛采血法 过去的研究者经常使用眼球后静脉丛采血的方法，但但近来研究表明它会产生一些不良反应。由于这些不良反应及其可能产生的严重后果的原因，该方法已引起了人们的担忧。近来已形成的其他一些即可满足科研需要，又可保证动物福利的采血方法。然而，有的专业技术人士认为，同那些新采血方法相比，眼球后静脉丛采血法的利弊仍是值得回顾和评论的。 对所有动物而言，眼球后静脉丛采血通常是在全麻下进行的，而且在一些国家的操作规程中，麻醉又是必需的。某些工作者已对眼球后静脉丛采血的具体方法进行了详细的描述（Stone 1954;Wayn forth 及Flecknell 1992;Van Herck 1999）。 目前几乎没有关于如何改进这种方法的书籍出版。为使组织损伤程度降到最小，目前关于如何选择最佳穿透结膜的途径（眼球侧面或通过老鼠眼睛的背面或上面进针）经讨论被认为是刺入结膜对周围组织损伤最少的且为最佳的方法。（BVA/FRAME/RSPCA/UFAW1993首次报导）大多数情况下，同一部位的采血应间隔两周，以保证受损组织的及时修复（Van Herck等1992）。但这并不意味在完全康复前的早期阶段，动物不经受痛苦与不适，这仅是针对重复眼球后静脉丛采血而言的。然而一些研究显示，重复眶静脉采血不会影响动物的昼夜节律（Beynen等1988;Van Herck等1997），也不会长期影响眶内组织的组织结构（Krinke等1988;Van Herck,1992））。（两者均显示任何组织损伤都是可修复的）。另有一些研究发现，动物组织结构的改变、异常的临床症状和不适的迹象，这些均可导致出于人道的被迫处死实验动物，造成研究的终止。 重复眼球后静脉丛采血还有其他一系列潜在的不良反应（负面效应）： · 眼球后出血可导致血肿和眼压过高，这必将使之产生疼痛感。 · 对于持续出血的血管进行的压迫时产生的压力（如压迫眼球）或源于血肿产生的压力都可导致角膜溃疡、角膜炎、角膜翳形成、玻璃体破裂及微眼炎。 · 视神经及其他眼眶内结构的损伤，可导致视力减退，甚至失明。 · 微量加液器可导致眼眶内脆性骨的骨折及神经的损伤，刺穿玻璃体和玻璃体液的流失。 由于这些有害的后遗症发生于眼眶深部而使之未被发现，它的发生率在1％－2％左右（Krinke等1988），事实上，但是对一些技术人员而言发生率可能还要高一些，虽然他们曾经受过专业训练。 5.穿刺采血的频率 为获得最佳的科研数据，与其相一致的做法中最重要的就是进行最少次数的穿刺。不可以在同一部位反复穿刺采血，即在同一条静脉中应选不同的点进行穿刺。 ６.套管插管法 对于反复采血的来说，套管插管法是一项重要的操作技术。短期的采血可使用暂时的置管如蝶状针套管和针上套管。长期的采血，就需要用生物相容性导管进行手术式置入。插管法可以进行反复地采血且对动物造成的痛楚和不适极微。皮下静脉通路置管因其不需将置管动物与同类隔离开而使用很广。但置管法仍存在一些潜在性的问题需加以说明： • 操作需要外科手术技术而且为取得良好的效果，操作必须在无菌条件下进行，这样可避免发生交叉感染等的并发症。经常发生的套管内凝血可影响采血，导管阻塞常见，可表现为无法采血和输液速度下降。 • 为避免套管的脱出或外露套管被咬断，将置管动物固定或将其与同类隔离开是很必要的。这同时也是在长期置管中皮下静脉通路置管的优势所在。 • 进行长期置管后可能发生血管穿透和由于动物增长过大而使导管不适于继续使用。 ７.麻醉 BVA/FRAME/RSPCA/UFAW 1993首次报导了关于各种不同的麻醉方法如何影响脾被膜上肌细胞功能以及促使血容量下降等其他方面的问题。麻醉药中加入芬太尼和氟丁酰酮，加或不加咪达唑仑，对所有动物都会引起明显的外周血管扩张，这点与小型实验室动物采血操作密切相关。麻醉使得进行采取血样较为容易，但其同时增加了既往采血点处发生出血的几率，所以应格外关注这一点以确保止血成功。此外，我们还应适当对局部麻醉的应用给予关注。 三．结论及建议 目前针对不同种属动物的采血，有许多供选择的采血方法，这些方法特别适用于小的啮齿类动物，在过去做到这些并不容易。此外，有些采血方法因需进行麻醉或存在较高的不尽人意的副作用的发生率，都严重影响了动物的权益，尤其是在反复采血时。鉴于此我们建议如下： 1. 推荐的采血方式如下：尾侧缘静脉，舌下静脉和颈静脉可适用于所有的啮齿类动物。家兔的采血可用耳缘静脉、二部中间的动脉和眶内静脉。 2. 只有在其他的采血途径不能使用时方可考虑动物的眼球后静脉采血。 3. 心脏采血只有在动物全麻的临终阶段方可使用。 最后，我们强调在所有的涉及动物的试验操作中，全面的训练与个人能力是采血成功与否的关键，同时也是减少组织损伤和保障实验动物健康和权益的根本之所在。