Notch2和B-catenin在人恒牙牙髓及牙乳头中的表达

Notch2和B-catenin在人恒牙牙髓及牙乳头中的达 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 三:互垄丝 日期: 丝ff:,:卑 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容 保密内容除外 ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文( 论文作者签名: 指导教师签名: 日 期: rlfll Y1 目 录 一、摘要 中文论著摘 要……………………………………………………………………1 英文论著摘 要……………………………………………………………………4 二、英文缩略 语………………………………………………………………………7 三、论文 前 言………………………………………………………………………………。8日U舌………………………………………………………………………………((芍 材料与方法………………………………………………………………((9 6 实验结果 附图、附表 …………………………………………………1 讨 论((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( (((((((((((((((((24 结论…………………………………………………………………………28 参考文献……………………………………………………………………29 四、本研究创新性的自我……………………………………………………32 五、附录 综j苤………………………………………………………………………………33 致 射………………………………………………………………………………46 个人简 介…………………………………………………………………………47 (中文论著摘要?? 目 的 在牙齿发育期间，牙乳头间充质细胞分化为成牙本质细胞，形成原发性牙本 质;在牙齿萌出后，无论年轻恒牙，还是成熟恒牙，牙髓在受创伤和感染时，牙 髓组织中的成牙本质细胞和新分化的成牙本质细胞样细胞就会形成第三期牙本质 和修复性牙本质，表明牙髓组织具有较强的自我防御能力和自身修复潜能。关于 成牙本质细胞和成牙本质细胞样细胞的分化以及牙本质形成的确切机制还不完全 清楚，但目前认为一些生物分子如转录因子、信号分子、生长因子、细胞外基质 分子等参与调节牙髓组织中的细胞增殖、分化和基质合成。 Notch2是Notch信号蛋白家族成员，是一种跨膜蛋白，可影响发育过程中多 种细胞的分化、增殖和凋亡，在多细胞动物发育的细胞分化中起重要作用，是多 种组织和器官早期发育所必需的细胞间调节信号。B连环蛋白 beta-catenin， IB-catenin 为细胞骨架蛋白即连环蛋白的家族成员之一，是Wnt信号通路 的核心因 子，与牙胚发育之间有着密切的关系。目前有关Notch2及p(catenin在年轻恒牙 和成熟恒牙牙髓及牙乳头组织中表达的研究鲜有报道。而对这一问题的深入研究 和探讨，将有助于我们进一步认识牙髓牙本质复合体的发育、成熟以及年轻恒牙 牙髓修复能力的生物学机制。 在人年轻恒牙和成熟恒牙牙髓及牙乳头组织中的表达，并进行比较以探寻它们在 牙髓牙本质复合体发育和成熟中的作用及二者在该过程中是否存在相关性。 材料和方法 收集51例因正畸或阻生拔除的健康无龋的牙齿，研究对象年龄为 11"-30岁， 均无全身系统性疾病，近三个月未曾服用免疫制剂和抗菌药物。牙齿拔除后立即 将年轻恒牙的牙乳头用镊子分离，冻存;然后将牙齿纵向劈开，完整取出牙髓组 织，冻存。成熟恒牙直接将牙齿纵向劈开，完整取出牙髓组织，冻存。 按恒牙牙根发育的八个阶段，结合临床和X光片检查，将R2,3，R3,4的年轻 恒牙的牙乳头组织归为第1组;将R2,3，R3,4的年轻恒牙的牙髓组织归为第2组; 将Ac的成熟恒牙的牙髓组织归为第3组 R2,3代表牙根形成2,3;R3,4代表牙根 形成3,4;Ae代表根尖已封闭 。每组各24例，其中12例样本用于RT-PCR检测， 12例样本用于Western(blot检测;另外有3例用于免疫组化检测。 参，用图像软件分析阳性条带的强度 即灰度值的测定 ，采用SPSSll(0统 织以及年轻恒牙牙髓与成熟恒牙牙髓组织之间的表达强度进行比较;Spearman相 关分析用于Notch2与肛catenin在恒牙牙乳头和牙髓组织中表达强度的相关性分 析，检验水准a O(05，P 0(05为有统计学意义。 结果 恒牙的牙髓组织和成熟恒牙的牙髓组织中均有不同程度的表达，表达细胞为成纤 维细胞、成牙本质细胞、血管内皮细胞;13(catenin在胞核和胞浆中着色，Notch2 在胞浆中着色。 牙髓和成熟恒牙的牙髓组织中均有表达。二者在年轻恒牙牙髓组织中的表达强于 其在年轻恒牙牙乳头组织以及成熟恒牙牙髓组织中的表达，差异具有统计学意义 关关系 P O(05 。 结论 乳头和牙髓组织中均有表达。Notch2和B(catenin在年轻恒牙牙髓组织中的表达强 度高于年轻恒牙牙乳头组织，也高于成熟恒牙牙髓组织( 中的主要表达细胞为成纤维细胞、成牙本质细胞和血管内皮细胞。 意义上的相关关系。 2 关键词 牙髓;牙乳头;牙髓牙本质复合体;Notch2;p(catenin;年轻恒牙; 成熟恒 牙 3 英文论著摘要?? ofNotch2and inthe and p-catenin Expression ApicalPapilla DentalTissuesofHumanPermanentTeeth Pulp ective obj Dental cellsdifferentiateinto andform papillamesenchymal odontublasts primary dentin tooth tooth conditions primaryduringdevelopment(Aftereruption，inpathologic aS that fromexternalstimulisuch restorative caries，attrition,and originate procedures， dentin and dentinis tertiary reactionaryreparative including producedbysurviving odontublastsor differentiatedodontoblast-likecellsinthedental shows newly pulp(It that tissuehasa self-defenseand for pulp strong capabilitypotentialself-repair(A studieshave numberof indicatedthatsomebiomoleculessuchaS factors， transcription factorsandextracellularmatrixmoleculesable molecules，growth are to signaling cell andmatrix indentaltissue(But regulateproliferation，differentiationsynthesis pulp and mechanismof differentiationofodontoblastsand precise dentinogenesis odontoblast(1ikecellsisstillnotclear( transmembraneamemberofNotch Notch2，a receptor,is signalingproteinfamily whichinfluences eventsatall of differentiation,proliferation,andapoptotic stages formationand development，thuscontrollingorgan amemberofcatenin an role cytoskeletalprotein,is familyprotein(Itplaysimportant indental aSacorefactorinWrit germdevelopment signal ofNotch2and between tissuesanddentalin expression B―catenin apicalpapilla pulp between h'nmature tooth，and immature tooth andmature permanent permanentpulp tooth has been seldom furtheranddiscussion permanentpulp reportedyet(The study onthis will usrevealthe inthe questionhelp mechanisms maturationand reparativecapacityofpulp-dentincomplex( The aimedto the ofNotch2and in presentstudy compareexpression B―catenin the anddental tissuesofhumanimmature teethand apical pulp permanent papilla mature teeth andWestern-blot permanentusingImmunohistochemisty,RT-PCR andto theroleofNotch2and the and techniquesexplore D-cateninduring development maturationof whetherthereiscorrelationbetweentheof pulp-dentincomplex，and 4 Notch2and this 13一catenin process( during MaterialsandMethods caries-free teethinneedofextractionwereobtained( Fifl-y-onehealthy permanent the from11 to30 old(All hadno Theof subjects years subjects systematic age ranged antibioticswithinthreemonths( diseaseanddidn’ttake immune??inhibitedor any drugs Wasdetachedwitha of then ARertooth tweezers， and extraction,the pair apicalpapilla thedentalWas removed(AllofthetissuesforRT―PCRandWestern―blot pulp rapidly detectionwerestoredat(70?( Basedontheteethroot status，the wereclassifiedintothree developmentsamples ofimmature 2,3or groups:groupl―apicalpapilla tooth rootdeveloped3,4 ， group2一 dental ofimmature 2,3or of pulp tooth rootdeveloped3,4 ，group3-dentalpulp with were24 mature samples tooth rootdevelopedcompletelyapicalclosed (There RT-PCR 12ofthemwereused foreach 2ofthemwereusedfor detection,and group(1 detection(Another3 wereusedfor forWestern-blot samples foreach detection,1group( andWestern―blot wereusedto techniques Immunohistochemisty,RT-PCR examinethe ofNotch2and atthelevelofmRNAand expression p―catenin protein( ttextWasusedto thedifferenceof between Two-Sample analyze expressionintensity Was to the correlation and correlation used possible Spearman analysis analyze groups betweenNotch2and withSPSS11(0software(P-values1essthan0(05were B(catenin considered significant( statistically Results ItWasindicated that andNotch2 immunohistochemistyp??catenin by experiment were inthedentaland ofhuman teethat positivelyexpressed pulp papilla permanent differentroot different foreach tooth developmentstages，withintensity group(The cellsinbloodvessel cellswerefibroblast，odontoblast，and positivestaining epithelial wasstainedinthe andnucleusandNotch2Wasstained wall(D-catenin cytoplasm only inthe cytoplasm( the ofNotch2and RT-PCRandWestern-blotdetectionrevealedthat expression p― immature teethwere catenininthedental tissuesofhuman pulp permanent andthatinthedental thanthatinthe tissues pulp significantlyhigher apicalpapilla 5 tissuesof humanmature permanent isno correlationbetweenthe ofNotch2and inthethree expression p―eatenin groups P 0(05 ( Conclusions 1(Atboththe mRNAlevelandthe and were proteinlevel，Notch2B(catenin inthe expressed anddental of apical human papilla pulp teeth(The permanent were in expression thedentalthanthat significantlyhigher pulp inthe of apical papilla immature teethandthe ofmature permanent teethas pulp well( permanent andNotch2 2(13-catenin were in mainly expressed cellsin epithelialbloodvesselwallinthe andinthe apicalpapilla dentaltissuesof pulp human immatureandmature teeth( permanent 3(This didn’tfindthe betweenNotch2 study eorrelationship and inthe B(catenin of toothroot processpermaaentdevelopment( words Key Dental pulp;Apicalpapilla;Pulp-dentin teeth;Matureteeth permanent permanent 6 SP 链霉菌抗生物素蛋 白(过氧化物 streptavidin―peroxidase 酶 cDNA DNA 互补DNA complementary ob odontoblast 成牙本质细胞 Fb fibroblast 成纤维细胞 VEC vascularendothelialcell 血管内皮细胞 DEPCdiethylprocarbonate 二乙基焦碳酸酯 7 ??论文?? (?上(―Jo 刖 吾 牙髓是位于髓腔内的疏松结缔组织，来源于颅神经嵴的外胚间充质，被牙本 质所包围。它包含有多种细胞、纤维、神经、血管和其他细胞外基质等成分，具 有形成牙本质、感觉、营养和防御等功能【l】。在牙齿发育早期，具有成牙潜能的 间充质发育成为牙乳头，随着牙乳头细胞分化为成牙本质细胞并开始分泌基质， 牙本质基质矿化，成牙本质细胞向中心移动，牙乳头的体积逐渐减少，至原发性 牙本质完全形成，余留在髓腔的牙乳头即为牙髓。由于牙髓和牙本质在胚胎来源、 解剖结构及功能上关系密切，因此这两个组织被称为牙髓牙本质复合体 pu岫(dentincomplex 【2】。在牙齿萌出后，无论年轻恒牙，还是成熟恒牙，牙髓在 受创伤和感染时，牙髓组织中的成牙本质细胞和新分化的成牙本质细胞样细胞就 会形成第三期牙本质，表明牙髓组织具有较强的自我防御能力和自身修复潜能【3’ 41。关于成牙本质细胞和成牙本质细胞样细胞分化以及牙本质形成的确切机制还不 完全清楚，但目前认为一些生物分子如转录因子、信号分子、生长因子、细 胞外 基质分子等参与调节牙髓组织中的细胞增殖、分化和基质合成。 Notch信号作为一种进化保守性细胞间相互作用的机制，可影响发育过程中 多种细胞的分化、增殖和凋亡，在多细胞动物发育的细胞分化中起中心作用。Notch 信号在牙齿发育中参与上皮细胞与间充质细胞间的信号传导，决定了成釉细胞和 成牙本质细胞成为终末分化细胞的命运【5】。牙髓炎症时Notch信号表达量及表达 部位都发生相应变化，说明Notch通路在牙齿发育、牙髓损伤再生中可能与其它 细胞因子一起调节细胞分化、增殖和凋亡【6(7】。哺乳动物中的Notch信号通路有 状期，帽状期，钟状期 都有表达，并且首次报道Notch受体在正常成年鼠及人 类已发育的牙髓中无表达，但牙髓损伤后表达上调【9】。 8 的。13(catenin为细胞骨架蛋白即连环蛋白的家族成员之一【10】，介导细胞黏附和细 胞膜分子之间信号传导，且与肿瘤的发生密切相关【ll】。Wnt信号通路在胚胎发 育过程中的作用已被公认，其核心因子B(catenin与牙胚发育之间有着密切的关 系。Obara等【12】利用原位杂交的方法分析了小鼠磨牙牙胚发育过程中D(eatenin的 表达变化情况，发现在牙乳头中，在即将分化为成牙本质细胞的细胞中B(catenin 的表达为阳性，当这些细胞分化为成牙本质细胞后p(catenin的表达为阴性。Chen 等【B1研究发现当间充质中缺乏p(catenin时，磨牙在蕾状期即停止发育，下颌切 牙的发育也受到影响，而上颌两颗切牙正常;在已分化为成牙本质细胞的细胞中 期必需，提示牙齿的正常发育需要p(catenin的精确表达。 Wnt和Notch信号通路中存在多个信号通路的信息交汇点，在细胞的增殖、 分化和程序性细胞死亡等过程中发挥重要的调控作用，两者可通过密切而广泛地 交互作用组成一有机的整体。Hayward等【14】提出了Winch的概念，即在肿瘤的发 生发展过程中，Wnt和Notch两条通路交互交织在一起，从不同的水平上进行广 泛的交互作用。 目前有关Notch2和p(catenin在人的恒牙牙髓及牙乳头组织中表达的研究未见 报道。而对这一问题的深入研究和探讨，将有助于我们进一步认识牙髓牙本质复 合体的发育、成熟及年轻恒牙牙髓修复能力的生物学机制。本研究拟应用免疫组 恒牙牙髓及牙乳头组织中的表达，并探讨两个信号分子之间有无相关性。 材料与方法 一、材料与试剂 l、标本及制备 牙髓标本取自因正畸或阻生而拔除的无龋健康牙齿 包括前磨牙和第三磨 牙 。所有研究对象均无全身系统性疾病，近3个月未曾服用免疫制剂和抗菌药物。 患者年龄为1l,30岁。按恒牙牙根发育的八个阶段【151，结合临床，将R2,3，R3,4 的年轻恒牙的牙乳头组织归为第1组;将R2,3，R3,4的年轻恒牙的牙髓组织归为 第2组;将Ac的成熟恒牙的牙髓组织归为第3组; I也,3代表牙根形成2,3;R3,4 9 实验，12例用于Western-blot实验。用于免疫组化染色的共3例，每组各一例。 牙齿拔除后立即用镊子将年轻恒牙的牙乳头取下，放入1(5mlEP管中，然后 用高速涡轮钻沿着颊舌径磨一凹槽，将牙齿纵向劈开，完整取出牙髓组织， 放入 1(5ml EP管中。而拔除的成熟恒牙直接用高速涡轮钻沿着颊舌径磨一凹槽，将牙 齿纵向劈开，完整取出牙髓组织，放入1(5mlEP管中。将装有要进行RT-PCR技 的牙齿完整取出牙髓及牙乳头后，放入4,多聚甲醛固定 12(24h 。常规脱水，石 蜡包埋，制成49tm厚切片。 2、主要试剂与材料 总RNA提取试剂异硫氰酸 Trioz01 日本TaKaRa公司 RNA聚合酶链反应试剂盒 日本TaKaRa公司 目的基因引物 日本TaKaRa公司 琼脂糖 日本TaKaRa公司 Genefinder荧光染料 厦门百维信生物科技有限公司 DEPC水 日本TaKaRa公司 多聚甲醛 Sigma美国 PBS缓冲溶液 Sigma美国 Cam公司，美国 兔抗人B(eatg:I_tin单克隆抗体 ab Cruz公司，美国 兔抗人IB-actin单克隆抗体 Santa 兔抗人Notch2单克隆抗体 SantaCruz公司，美国 Teeh 山羊抗兔IgG ProteinGroupInc，Chicago，USA SP免疫组化试剂盒 im，Fujian，China DAB显色试剂盒 im，Fujian,China Buffer 、DNA电泳缓冲液 TAE 、氯仿、 其他试剂:上样缓冲液 Loading 异丙醇、无水乙醇等。 3、主要试剂的配制 容量瓶中静置4小时备用。 10 水需要先高压 3 2,琼脂糖凝胶的配制:0(69琼脂糖加30ml电泳缓冲液，加热至 沸腾， 染料均匀分布在胶体中，然后立即将胶体倒入已放置好梳子的胶膜中，在室温下 放置30--45min后进行电泳。 4 电泳缓冲液 TAE : 60ml 蒸馏 水中，在搅拌器上剧烈搅拌。再用浓度为1N的NaOH调节溶液PH值至8(0需 49NaOH。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌，室温保存。 乙酸和50mlO(5ml,L的EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。 再配制l O(59琼脂糖，另外的450mlTAE倒入电泳槽中。 4、主要仪器与设备 制冰机 Zigera，2BE(70(25型，德国 高速低温台式离心机 Eppendorf,90(2型，德国 台式高速离心机 TGL(16G，上海生物仪器厂，中国 PCR扩增仪 Biometra，480型，德国 紫外分光光度计 UV-visible Spectrometer，W300型，英国 电泳仪 BIO(RAD，PowerPac200型，美国 PROTEANl 电泳槽 BIO(RAD(mini lTM，瑞典 光学显微镜 OLYMPUS体视显微镜SZHl0，日本 石蜡切片机 LEICARM2015，德国 自动免疫组化机 AUTOSTRAINER720，德国 二、实验方法 连结法免疫组化染色 1 切片脱蜡和水化 ,乙醇5rain-*95,的乙醇5min-+80,乙醇5min一?60,乙醇5min 2 抗原修复 高压热修复 在沸水中加入0(01M枸橼酸钠缓冲溶液 pH6(O ，盖上不锈钢锅盖，将玻片 置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5rain，然后将盖子锁定， 小阀门将会升起来。5min后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。 3 免疫组化染色 SP法 @PBS洗2次各5min ?3,H202 甲醇 溶液，室温15min 镬 PBS洗2次各5min ?滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，干燥，滴加兔抗人[3-catcnin 多克 隆抗体 浓度l:500 ，室温90min ?PBS洗2次各5rain ?滴加山羊抗兔ZgG，室温下20rain ?PBS洗2次各5min ?滴加sP，室温20min ?PBS洗2次各5rain，室温下DAB显色 ?蒸馏水洗，苏木精复染5min 阴性对照是用PBS缓冲液代替一抗 以上操作均由自动免疫组化机完成 4 脱水、透明、封片 5 结果判定‘16】 阳性染色为淡黄色至深褐色颗粒，苏木素复染细胞核为蓝紫色。按照二级计 为3分， 75,为4分。染色强度分类:淡黄色为1分，黄色及深黄色为2分，褐 色及深褐色为3分。将细胞阳性率与染色强度两者积分相乘:0分为阴性 ( ， 1,4分为弱阳性 + ，5,8分为阳性 ++ ，9~12分为强阳性 +++ ( 12 2、ImPCR 1 引物 采用的引物序列如表1所示，由TaKaRa公司合成。 表1，引物序列及扩增片段 Tabl，Primerand fragments sequencesamplification 基因名称 引物序列 扩增 片段参考文献 长度 GTAGGCTCCATCCAGTC 上游5’(TGA Notch2 551bp[171 TGTCAGGTAGGGATGCT 下游5’(TGG ATGGCTAC GCGTGGACA 上游5’(CCA lj-catenin… TGAGCTCGAGTC?6岍GC 270bp【181 下游5’(CTC CTA GGGGTATGC 上游5’(T 汀GCCCAT CGA 13(actin 439bp[19】 CGCCAGACA ACATGGTGGTGC 下游5’(GGT 2 总RNA的提取 的Trizol，室温放置5min ?加入氯仿0(2ml，摇匀，室温放置5min 4"C离心15rain，吸上清于另一个EP管中，加入等体积的 异丙醇， ?12000xg 室温放置10min ?12000x94"C离心10min，去上清，加入75,的乙醇lml @7500xg 3 逆转录合成eDNA RT反应体系: 13 RNaseFree H20 3(759l MgCl2 2(009l 10xRTBuffer 1(00m dNTP 1(009l RNriseInhibitor 0(251tl AMVReverse 0(50Ixl Transeriptase Primer OligodTAdaptor 0(513I山 RNA 1(0 3lm Sample Total 10(00I_tl RT反应条件: 30? 10min 42? 30min 99? 5min 5? 5min 4 PCR扩增 PCR反应体系: ddH20 18(375:山 5xPCRBuffer 5(000 tl TaKaRaEx TaqHS 0(125叫 Sense 0(2501d primer Antisense 0(250I_tl primer eDNA 1(oooI-tl Total 25(000I(tl Notch2的扩增条件: 延伸10min。 13-catenin的扩增条件: 94?预变性2min，94?30s，57(7"C45s，72?45s，共30个循环，最 后72? 延伸10min。 13-actin的扩增条件: 14 延伸10min。 5 电泳鉴定 Buffer 将2,的琼脂糖凝胶置于电泳槽中，取7(5I-tl扩增产物与1(59l6xLoading 混合后上样，140V电泳，30min电泳结束后，采用凝胶成像系统照相，并进行灰 度值分析、记录每条DNA目的条带的灰度值，每一个目的DNA的扩增片段的灰 度值与相应的内参J3-actin的灰度值的比值即为目的基因的表达强度。 3、Western(blot 1 样品蛋白的提取 retool,1Tris,HCl7(5，O(1mmol,l 组织以1:5比例加入裂解缓冲液80ul 20 pH NaF，2mmol,1EDTA，lmmol,1 Na3V04，25mmol,1 DTT,lmg,ml亮肽素,抑肽酶 ， 匀浆机匀浆，4。C12000rpm离心lh，上清为细胞质蛋白组分。 2 考马斯亮蓝法定量样品蛋白浓度 3 浓度的调整与样品的处理 把样品制成相同浓度，加入样品buffer，沸水煮5min。 4 杂交过程 电泳一转印 50V，2h 一TBS浸泡10min--*封闭 5,脱脂奶粉TBS1h 一TTBS 曝光1IIlin_显影5mjn_定影5min-((分析结果。 三、统计学分析 所有数据用均数4-差 商 表示。应用SPSSl1(0软件对所得的数据进行 统计学分析。其中Notch2及p(eatenin在年轻恒牙牙乳头与牙髓组织以及年轻恒牙 牙髓与成熟恒牙牙髓组织之间的表达强度的比较采用两样本t检验方法，Notch2及 验水准a 0(05，P 0(05为统计学上有显著性差异。 15 实验结果 一、免疫组化结果 光学显微镜下，HE染色可见牙髓组织的四层结构，由外到内依次为成牙本 质细胞层，少细胞层，多细胞层，髓核。 见图1 图1，光学显微镜下牙髓的组织结构 HE染色，200x Ob成牙本质细胞，Fb成纤维细胞，VEC血管内皮细胞，未分化间充质细胞 Structureofdentalunder Figl，Histologic pulp light microscope HEstaining,200x 1(13-catenin免疫组化染色结果 p(catenin在年轻恒牙的牙乳头、牙髓和成熟恒牙的牙髓组织中均有表达，主 要在成纤维细胞、成牙本质细胞、血管内皮细胞的胞核和胞浆内呈阳性着色。年 轻恒牙的牙乳头中部分成纤维呈弱阳性表达 图2 。在年轻恒牙牙髓中成牙本 质细胞呈强阳性表达，成纤维细胞和血管内皮细胞呈阳性表达 图3 。在成熟 恒牙牙髓中成牙本质细胞呈阳性表达，成纤维细胞和血管内皮细胞呈弱阳性表达 图4 。阴性对照见图5。 16 200x，B400× 图2，年轻恒牙牙乳头中肛cateIlin的表达 A 成纤维细胞 + in ofimmatureteeth A ngZ，Expressionofp-cateuinapicalpapilla 200x，B400× Fibroblast + 图3，年轻恒牙牙髓中p-catenin的表达 400× 成纤维细胞 ++ 成牙本质细胞 卅 血管内皮细胞 ++ indentalofimmature n93，Expressionofp-tatenin teeth 枷× pulp Fibroblast ++ Odontoblast 卅 vascularendothelialcell ++ 图4，成熟恒牙牙髓中p-catenin的表达 400x 成纤维细胞 + 成牙本质细胞 ++ 血管内皮细胞 + of indentalof Fi94，ExpressionII-catenin pulpmatureteeth 400x Fibroblast + Odontoblast ++ vascularendothelialcell + 17 年轻恒牙的牙乳头中部分成纤维细胞和血管内皮细胞呈阳性表达 图6 (在 年 轻恒牙牙髓中的成牙本质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞呈强阳性表达 图7 。 在成熟恒牙牙髓中仅限于少数血管内皮细胞中呈弱阳性表达 图8 。 200x，B400x 图6，年轻恒牙牙乳头中Notch2的表达 A 成纤维细胞 ++ 血管内皮细胞 ++ in ofimmature200x，B400x ofNotch2 teeth A Fi96，Expressionapicalpapilla Fibroblast ++ vaseularendothelialcell ++ 18 图8成熟恒牙牙髓中Notfb_2的表达 400x 血管内皮细胞 + vascularendothefialcell + 二、RT-PCR结果 1、Notch2的RT-PCR实验结果 Notch2(mRNA在年轻恒牙的牙乳头、牙髓和成熟恒牙的牙髓组织中均有表 达，但表达强度不同。两样本t检验分析表明，Notch2的表达强度在年轻恒牙牙 髓组织明显高于其在年轻恒牙牙乳头组织以及成熟恒牙牙髓组织的表达强 度，统 计学上有显著性差异 P 0(05 。 见图9，图lO和表1 19 paclin 图9，各组组织中Notch2与13-aetin的RT-PCR产物电泳图 forRT-PCR of in Notch2and thetissuesof Fi99,Electrophoresisfigure products p(actin three groups 注:泳道1~4为第1组，年轻恒牙的牙乳头组织;泳道5(8为第2组，年轻 恒牙的牙髓组织;泳道9~12为第3组，成熟恒牙的牙髓组织;上图的Marker是 DL2000，下图的Marker是DLl00。 ofimmaturetooth，Lane1,--4 Note:Groupl:apicalpapilla ofimmaturetooth，Lane5,8 Group2:dentalpulp ofmaturetooth，Lane9,12 Group3:dentalpulp MarkerforNotch2 is for isDLl00( DL2000，Marker13-actin M:Marker Notch2:551bp 13-actin:439bp 图10，Notch2 mRNA在各组组织中的表达 10，the ofNotch2mRNAinthetissuesofthethree Fig expression groups 表1，RT-PCR检测各组组织中Notch2mRNA表达的图像分析结果 Tab1，the resultofNotch2mRNA inthethree image analysis expression groups P 0(013 注:’与第2组相比，t--2(718 P 0(046 ?与第2组相比，t 2(116 2、D(catenin的RT-PCR实验结果 mRNA在年轻恒牙的牙乳头、牙髓和成熟恒牙的牙髓组织中均有表 B(catenin 达，但表达强度不同。两样本t检验分析表明，13(eatenin的表达强度在年轻恒牙 牙髓组织明显高于其在年轻恒牙牙乳头组织以及成熟恒牙牙髓组织的表达强度， 统计学上有显著性差异 P O(05 。 见图11，图12和表2 Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1I 12 750bp 争catenht 100bp 鼬bp II-acan 200bp mRNA的RT-PCR产物电泳结果 图11，各组组织中p(catenin与13-actin forRT-PCR and inthe Figll,Eleetrophoresisfigure productsof[I-eateninIkactin tissuesofthree groups 注:泳道10为第l组，年轻恒牙的牙乳头组织;泳道5,8为第2组， 年轻 恒牙的牙髓组织;泳道弦12为第3组，成熟恒牙的牙髓组织;上图的Marker 是 DL2000，下图的Marker是DLl00。 ofimmaturetooth,LalleI--4 Note:Groupl:apicalpapilla immature of tooth，Lane5,8 Group2:dentalpulp 21 mRNA表达的图像分析结 果 表2，RT-PCR检测各组组织中p(catenin Tab2，the resultof mRNA inthethree imageanalysis p-cateninexpression groups P -0(032 注:’与第2组相比，户(2(284 ?与第2组相比，t 2(354P 0(028 mRNA表达的相关分析 3、Notch2和p―catenin 牙髓及成熟恒牙牙髓组织中的表达均无相关性，P O(05 表3 。 表3，Notch2和p-catenin在各组组织中表达的相关性分析结果 Tab3，thecorrelationresultofNotch2and mRNA inthethree p-catenin analysis expression groups 三、Western(blot结果 p(catenin蛋白在年轻恒牙的牙乳头组织、牙髓和成熟恒牙的牙髓三 组组织中 度值比值的总体均数不等，D(catenin在年轻恒牙牙髓组织中的表达明显高于其在 年轻恒牙牙乳头组织以及成熟恒牙牙髓组织中的表达，统计学上有显著性差异 P 0(05 。 见图13，14和表4 l 2 3 ? 5 6 7 8 9 p-catenin p-acfin????―卜-??‘-一--??_43KD ‘ ?,一 一 图13，IB-catenin与IB-actin在各组组织中的蛋白表达 of and inthetissuesofthethree p-catenin Figl3，Expressionp-actin groups 注:泳道1-3为第l组，年轻恒牙的牙乳头组织;泳道4~6为第2组， 年轻 恒牙的牙髓组织;泳道7~9为第3组，成熟恒牙的牙髓组织。 ofimmatureteeth，Lane1--3 Note:Groupl:apicalpapilla ofimmatureteeth，Lane4-6 Group2:dentalpulp ofmatureteeth，Lane7,9 Group3:dentalpulp 图14，p(catenin蛋白在各组组织中的表达 in 14，the of thetissuesofthethree Fig expressionp-cateninprotein groups 表4，Western blot检测各组组织中13-catenin蛋白表达的图像分析结 果 Tab4，the resultof inthethree imageanalysis p-cateninproteinexpression groups 注:’与第2组相比，t (6(550P 0(001 P 0(001 ?与第2组相比，t 4(822 讨论 小鼠胚胎的研究发现，从蕾状期到帽状期 E13(5 ，位于牙胚顶端的蕾状期牙胚 细胞停止分裂并形成一个上皮来源的信号中心，即釉结。釉结可在帽状期 E14 分泌生长因子和其他各种信号分子，在调控牙齿形态发生中起到核心作用。在牙 胚发育早期，Notch2表达于牙胚上皮来源的星网状细胞层中，但在周边基底上皮 细胞层中不表达。E14，Notch2仅在半数的星网状细胞中表达，且在釉结和颈环 结构中表达微弱或不表达。牙胚发育阶段的一个重要特点是，Notch2在牙 胚间充 质细胞不表达。而Harada等【2l】认为，Notch2则高表达于星网状细胞和外釉上皮 细胞。Mitsiadis等人研究发现Notch (在人类牙齿发育过程中的蕾状期，帽状期， 钟状期都有表达【91。他们首次报道Notch受体在正常成年鼠及人类已发育的牙髓 中无表达，但牙髓损伤后表达上调。其中Notch2的表达是在牙冠部近损伤部位及 较远处 如牙根 的牙髓间充质细胞里;在牙髓细胞里Notch2的表达是占优势的， Notch2的表达不仅在牙冠部接近损伤处的牙髓细胞里被激活，也在远处的牙根里 激活，提示根尖周存在着在牙髓损伤后能够再次分化为不同类型牙髓细胞的重要 细胞群。在远离损伤处的牙髓细胞里的Notch2的激活可能提示着Notch信号参与 损伤处细胞的增殖,迁移【9】。 wm信号通路在胚胎发育过程中的作用已被公认，其核心因子B(catenin与牙 胚发育之间有着密切的关系。正常情况下细胞内游离的13(catenin极少，wnt信 水平的调节主要通过一个多因子复合物完成【22’231。复合物功能正常时，可磷酸化 降解B(catenin，使其游离水平降低。当Writ信号传入时，通过一系列结合产生 效应使复合物合成被抑制，从而B(catenin无法磷酸化降解，于是细胞内游离状态 的p(catenin增加，达到一定量时，p(catenin可进入细胞核内引起下游 基因转录。 Liu等【刎等人研 p(catenin在细胞中的水平而在牙胚发育过程中有重要作用【12】。Fei 究发现小鼠胚胎口腔上皮p(catcnin的突变导致大的，畸形牙蕾及异位牙齿的形 成。因此，目前认为p(catenin在牙胚发育过程中是必需的，且在不同的发育阶段 有着精确的时空表达。 Sonoyama等t25】发现在年轻恒牙的牙髓和牙乳头之间有一层多细胞层，因此用 镊子可以很容易地将牙乳头与牙髓分离。本实验即采用了这种方法分别对年轻恒 牙的牙髓和牙乳头进行研究。结果显示Notch2在年轻恒牙的牙髓组织中 mRNA水 平及p(catcnin在年轻恒牙的牙髓组织中mRNA和蛋白水平的表达比在牙乳头组织 中的高，P 0(05。我们分析，由于牙乳头起源于外胚间叶组织，牙乳头细胞为未 分化的间充质细胞，有少量微细的胶原纤维分散在细胞外基质。另外，本研究中 选取的年轻恒牙为牙根发育2,3和3,4的牙齿，这一阶段牙根发育即将完成，接近或 者已经牙齿萌出，与牙髓相比，这阶段的牙乳头中的血管和细胞成分较少。因此 织的各自结构特点相符合。推测若选取的牙齿标本处于牙根刚开始发育期，则可 能会有不同的结果，但因这部分牙齿仍未萌出，临床上不宜获得，样本例数少， 故本研究未将其纳入。尽管Notch2和13(eatenin在年轻恒牙牙乳头组织中的表达不 及牙髓，但仍然提示我们二者在未分化的间叶细胞有表达。临床上对年轻恒牙的 部分根髓坏死或全部根髓坏死病例进行牙根形成术或根尖诱导成形术时，牙根部 牙本质的沉积以及根尖部硬组织的沉积，可能与二者的作用密切相关。 本研究发现在人健康的年轻恒牙和成熟恒牙的牙髓组织中有Notch2和p( catenin的mRNA及蛋白表达，且在年轻恒牙中的表达强于成熟恒牙。年轻恒牙的 牙髓组织疏松，牙冠部的成牙本质细胞呈高柱状，牙根部的成牙本质细胞呈立方 形，处于分泌的旺盛期，成纤维细胞多，而且分布广泛，牙髓血管内皮细胞 丰富， 生活力旺盛【261。而成熟恒牙牙髓组织中的细胞成分逐渐减少。成牙本质细胞由高 柱状变为矮柱状或扁平，部分成牙本质细胞凋亡，剩余的成牙本质细胞对刺激的 年轻恒牙和成熟恒牙的牙髓组织中的表达有所不同。尽管成熟恒牙牙髓组织中 Notch2和13(catenin的表达不及年轻恒牙牙髓组织，但二者在成熟恒牙牙髓组织中 均仍有表达，表明二者也参与整个牙髓发育和成熟过程中细胞的增殖、分化过程。 免疫组化结果显示B(eatenin和Notch2在年轻恒牙的牙乳头、牙髓和成熟恒牙 的牙髓三组组织中均有表达，主要定位于成纤维细胞、成牙本质细胞、血管内皮 细胞和牙乳头细胞，证明二者参与了牙齿萌出后的牙根的继续发育和成熟。牙髓 成纤维细胞在适当的刺激下可分化为新的成纤维细胞或成牙本质细胞样细胞【2引， 新分化完成的细胞分泌细胞外基质最终可形成修复性牙本质。牙齿萌出后，牙根 继续发育所依赖的组织为牙髓组织，根尖端的牙乳头和根尖周的上皮根鞘。牙髓 感染或坏死的年轻恒牙在临床上需要做活髓切断术或者根尖诱导成形术进行治 疗，这两种疗法通过残留的生活牙髓，牙乳头及上皮根鞘诱导根尖形成钙化硬组 织，是临床上保存活髓疗法的有力条件。而13(eatenin和Notch2阳性表达于牙乳头 及年轻恒牙的牙髓细胞说明二者可能参与牙髓的损伤修复。Mitsiadis等【9】的研究表 明Notch2参与牙齿炎症损伤后修复过程，其主要表达于牙冠部近损伤部位及较远 处的牙髓间充质细胞里。未分化的间充质细胞可分化为成牙本质细胞，形成修复 性牙本质。所以Notch2与修复性牙本质的形成亦密切相关。应用Notch2诱导修复 性牙本质形成很可能会成为治疗龋病的一种方法，从而为活髓保存治疗提供了又 一可能策略。 Wnt和Notch信号通路中存在多个信号通路的信息交汇点，在细胞的增殖、 分化和程序性细胞死亡等过程中发挥重要的调控作用，两者可通过密切而广泛地 交互作用组成一有机的整体。Ayyanan等【29】在研究人乳腺上皮细胞癌变时发现， 乳腺癌的发生中起着十分重要的作用。Devgan等【30】在对角化上皮细胞进行的研究 达来下调Wnt信号。此外，已经有研究显示Notch信号通路和Wnt信号通路在 口腔鳞状细胞癌的发生上有相关性，Duan等【31】在对稳定转染Notchl信号的人舌 癌细胞系的研究中发现，活化的Notchl信号可在转录水平下调p(catenin，而p catenin在细胞内的低表达可能为引起舌癌细胞周期阻滞和细胞程序性死亡的机 制之一。Yun Hye 及其细胞内域NICD的的水平和转录活性，并且二者共表达加强C2C12细胞的碱 性磷酸酶活性的程度高于它们中的任一个信号的单独作用。Valerie等【33】对ST细 胞进行研究时发现Notchl的过表达阻止BMP2和Wnt生物效应从而来损害成骨 信号通路和Wnt信号通路在一些生物进程上存在交互作用。 本研究运用RT(PCR技术发现在人健康的年轻恒牙牙乳头，牙髓和成熟恒牙 年轻恒牙牙髓组，二者的相关系数厂 O(536，P 0(073，这也可能与样本例数较少 有关。Notch2信号通路与多个信号通路存在相互作用，各种信号形成网络相互调 节，所以二者在牙齿的发育中是否存在交互作用仍有待进一步研究。 在牙髓牙本质复合体形成的过程中，伴随着年轻恒牙牙根的逐渐发育完成， 牙本质逐渐形成，这其中涉及成牙本质细胞的分化，细胞外基质的分泌以及矿化。 27 和D(catenin在人健康的年轻恒牙牙根的不同发育阶段的牙乳头组织、牙髓组织中 表达强度的差别，从而进一步表明Notch2和p(catenin在牙髓牙本质复合体发育 和成熟的过程中可能扮演着重要的角色。保存活髓是最符合生物学观点的牙髓病 治疗方法，对牙髓发育和损伤修复中的信号因子的作用的阐明，有助于为临床研 究活髓保存技术提供新的策蝉341。 ;口结 论?匕 乳头和牙髓组织中均有表达。Notch2和p(catenin在年轻恒牙牙髓组织中的表达强 度高于年轻恒牙牙乳头组织，也高于成熟恒牙牙髓组织。 中的主要表达细胞为成纤维细胞、成牙本质细胞和血管内皮细胞。 意义上的相关关系。 (参考文献?? 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