山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长

山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长 中 国兽 医学 报第 19 卷 第 3 期V o l. 19, N o. 3 1 9 9 9 年 5 月C h in e se Jo u rn a l o f V e te r in a ry Sc ien ce 1 9 9 9 M ay 3山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长 ()周欢敏 内蒙古农牧学院动物科学系, 呼和浩特 010018 () 张 涌 西北农业大学发育生物学研究室 ( )( )( 摘要 山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞在以 DM EM 为基础, 添加 H E P E S 20 mm o lL 、FC S 10% 、F SH 40 ƒ (( ( )))( )) ƒ、次黄嘌呤 2 ƒ、异双丁酰环腺苷酸 2 ƒ、2ƒ、氢化可的松 40 ƒ和50 m gL mm o lL mm o lL IGF I ΛgL ΛgL () 的培养液中得以存活并生长。在二维培养体系中, 卵泡在体外的生长模式和体内有很大差别。 50 ƒIT S ΛgL 最显著的特征是卵泡不像在体内那样保持完整的立体结构一直到结束。 绝大部分卵泡不同程度地发生基膜 溶解和破裂, 颗粒细胞向四周扩展并贴壁, 形成单层。由于卵泡原有三维立体结构的破坏, 易于导致卵母细胞 的迁移。在生长方式上以数个卵泡聚集生长对其卵母细胞的生长似乎较为有利。卵泡卵母细胞在体外培养 9 , 其直径可达 150 以上, 达到了成熟时体积, 存活率为 53% 。实验证明, 山羊无腔卵泡卵母细胞在合适的 dΛm 培养体系中, 能在体外存活并生长, 并能发育到成熟时的大小。 关键词 山羊 无腔卵泡 卵母细胞 体外生长 中图分类号136 9541432827 SQ 啮齿动物无腔卵泡卵母细胞的体外培养体系3?1 稀释后转入 4?慢消化 10, 15 m in , 之后离 1 , 7 8 ( ) 已基本建立, 并在小鼠获得了后代。但家畜 心 1 000 , 3 次, 洗去消化酶, 再经网筛ƒ2rm in 卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外培养仍处于探索阶 () Ø 450 过滤后拣卵。Λm 9, 10 11段。 对牛和猪 的无腔卵泡卵母细胞的体外 112 无腔卵泡的选择 将分离出来的各级卵泡 培养研究表明, 家畜无腔卵泡卵母细胞在体外条 转移到含适量 培养液的表面皿内。 选择DM EM 件下也具有发育能力, 但在山羊这方面研究尚属 正 常 完 整 的 直 径 ? 150 Λm、卵 母 细 胞 直 径 ? 90空白。 本研究采用二维培养法培养山羊卵巢无腔 ( ) Λm 的卵泡 图 1 A , 在 DM EM 培养液中洗涤 2 卵泡卵母细胞, 以期建立其体外发育的培养体系, , 3 次, 再转移到含新鲜培养液的表面皿内, 臵于 认识山羊卵泡卵母细胞的体外发育过程和规律, 培养箱内备用。CO 2 为其体外成熟研究直至利用奠定基础。 113 无腔卵泡的培养 11311 培养液 以 为基础, 添加不同的 DM EM 1 材料与方法 培 养 成 分: + 20 ƒ+ 10%DM EM mm o lL H E P E S FC S+ 2 mm o lƒL 次黄嘌呤+ 2 mm o lƒL db cAM P111 无腔卵泡的分离 卵泡取自当地 60 日龄前 丙 酮 酸 钠++ 50 123 ƒ0 40 m gƒL F SH + mm o lL () 沙能奶山羊卵巢。将卵巢切碎 Ø 1, 2 , 臵于mm ΛgL IT S + 50 ΛgL IGF 2I+ 40 ΛgL 氢 化 可 的 ƒƒƒ ( ) 011% 胶原蛋白酶 typ e K S IGM A 和 40 U ƒmL 松+ 75 ƒ青霉素+ 50 ƒ链霉素。ΛgL ΛgL ( ) 酶 华美生物工程公司混合消化液内, 于DN A 11312 二维培养体系 采用微滴法培养。每个塑 3815?、5% 、100% 湿度的培养箱内消化 20,CO 2( ) 料 培养皿 Ø 315 铺 5 个微滴, 每个微滴 100cm 25 。在消化的中途和结束, 以直径略大于组织 块 m in ΛL 。每个微滴接种 5, 10 枚卵泡, 上盖矿物油后, 的 玻 璃 吸 管 各 悬 浮 20 次 左 右, 再 以 DM EM ( 臵于 培养箱内培养 3815 ?, 5% , 100%CO 2 CO 2 ) 湿度。 于培养的第 2 天换新鲜培养液, 每次换液收稿日期: 1998209215 23, 以后每隔 3 换液 1 次。ƒd 第 1 作者: 周欢敏, 男, 1959 年生, 博士, 副教授 ( ) 3 农业部生物技术重点项目 95 牧201204201114 无腔卵泡的测量 在卵泡培养之前, 测定其 (大小, 此时作为卵泡生长的 0 时, 其大小即为卵泡, 交织成不规则的网状 图 的边缘出现放射状结构 )的 0 时体积。从培养的 0 时起, 于培养的第 3 天和 1。卵泡行贴壁生长, 颗粒细胞贴附到培养皿底 B 第 9 天分别各测定 1 次。在相差显微镜下, 卵泡两 面。随着培养的延续, 颗粒细胞向外周扩展。一般 情况下, 大部分卵泡在培养 24 内就出现了这种 端基膜外缘最大距离代表卵泡的直径, 卵母细胞h 两端最大距离为卵母细胞的直径, 包括透明带。现象, 一少部分在 48 内出现, 个别卵泡可延迟 h 到 72 。 在实体镜下, 卵泡呈丘状, 并逐渐拉平。 115 培养卵泡的鉴定 正常发育的卵泡, 其卵母 h ( )细胞呈圆形, 位于卵泡的中央或略偏于一侧。胞质 颗粒细胞不断向四周扩展生长 图 1。 最后, 卵C 均匀, 色泽鲜明, 具有健康的透明带, 薄厚均匀一 母细胞由培养 0 时的隐蔽状态逐渐变得清晰, 由致。 颗粒细胞联系紧密, 圆而光滑, 不过早脱离卵 卵泡的中央移向边缘或上升到卵泡的顶部, 部分 ()母细胞。 凡卵母细胞变形、过暗或过淡, 透明带严 卵泡的卵母细胞游离出来 图 1。取这种生长方D 重变形, 颗粒细胞过早脱离均视为退化。 式的卵泡均不能像体内那样保持卵泡的完整立体 , 作 t 检试 验 数 据 经 统 计 分 析116 统 计 分 析 结构和形态。 验。卵泡在体外生长的另一特征是 2 个或 2 个以 上的卵泡常常在培养的 24 内相互聚集在一起,h ()粘附成团状 图 1。取这种生长方式的卵泡能较 E 2 结果 长时间地保持其结构的完整性, 基膜消失和卵泡 211 山羊无腔卵泡的体外生长特征 二维培养 条颗粒细胞散开的现象出现得较晚。试验中发现, 一 在件下, 无腔卵泡的体外生长和体内生长方式存 旦颗粒细胞散开, 极易形成单层, 具有很强的贴壁 很大差异。在培养的 24 或 48 内, 卵泡的基 h h 膜 生长能力。培养后期, 卵泡卵母细胞的生长方式类出现溶解, 其特征表现为在卵泡的周边出现一 层似于体内, 除了体积逐渐增加外, 随着卵泡的生 透亮的晕圈, 基膜变得薄而不清。 随后, 在卵泡 长, 卵母细胞渐渐移向卵泡内一侧。卵泡卵母细胞 图 1 山羊无腔卵泡卵母细胞的体外生长模式 1 培养前卵泡卵母细胞; 1 卵泡基膜出现溶解现象; 1 卵泡颗粒 A B C 细胞向周围扩展; 1 卵母细胞游离出卵泡之外; 1 卵泡卵母细胞的聚集生长; 1 培养结束时的卵母细胞D E F 的这种行为在单个培养的卵泡中也常见。, 虽然卵母细胞能与颗粒细胞保触。在培养过程中 持联系, 卵母细胞也能生长, 但在后期容易变扁而 212 山羊无腔卵泡卵母细胞的体外生长 在二 不能保持其球形结构。试验中发现, 第 1 种情况有 维培养条件下, 在培养液环境中经 9 的培养, 卵d 利于卵母细胞的生长。取这种生长方式, 既能维持泡卵母细胞的直径可达 150 以上, 其培养结 Λm 卵母细胞的形态, 又能与其周围颗粒细胞保持紧 果见表 1。 密联系, 而后者对卵母细胞生长是极为重要的。 试验发现, 卵泡成簇培养时, 在培养的初期数表 1 山羊无腔卵泡卵母细胞的体外生长结果 个卵泡粘附在一起呈团状的生长模式, 即使是多 不同培养时间卵母细胞直径Λm ƒ 样本数 存活率 个卵泡分散培养, 也易于发生这种现象。取这种生 % ƒ个ƒ 0 d 3 d 9 d 长方式, 一般不会出现卵母细胞的过早裸露, 因为 80 100 5381100?117 91188?219 153130?010 它不容易游离于卵泡之外, 而且颗粒细胞也不会 过早地扩散。从理论上讲, 这对卵泡及其卵母细胞 3 讨论 的生长和发育是有益的, 保持了二者之间的缝隙 连接。这种生长方式是否类似于体内经腔期发育, 311 关于无腔卵泡的生长模式 在二维培养体 系尚未证实。 之所以强调经腔期发育是因为它在体 中, 山羊无腔卵泡在体外和体内的生长模式表 现 内生理状态下对卵母细胞成熟能力的获得是必要 迥异。 最显著的特征是卵泡不像在体内那样保 持 的。 完整的立体结构一直到生长结束。 尽管所选择 的 卵泡均具有完整的基膜, 但在培养过程中绝大 部从本试验结果看, 卵泡或单个或成团生长, 以 分卵泡不同程度地发生基膜溶解或破裂, 不能 保卵泡基膜不过早溶解或消失、颗粒细胞不迅速扩 持原有形态, 颗粒细胞向四周扩展并贴壁, 形成 单展而避免形成单层、卵母细胞在培养的中后期前 层。 这种模式在卵泡的二维培养体系中属常见 现不迁移而过早地暴露于卵泡之外为宜。 卵母细胞 (象。曾有报道称微滴法或常规培养 均属二维培 在培养的后期, 从卵泡的中央逐渐迁移至卵泡的 ) 养易于造成卵泡的塌陷。 从本试验观察, 山羊无 边缘是卵泡体外生长的特有表现。在某种程度上, 腔卵泡的这种现象的发生似乎更频繁。 它类似于体内的发育行为, 这可能有益于卵母细 与体内所不同的是无腔卵泡 被 分 离 出 来 之 胞的成熟。 后, 失去了周围的硬支撑环境, 虽然卵泡尚有基膜 312 关于卵泡细胞的体外存活 预试验发现, 在保护, 暂时能保持其三维立体结构, 但此时卵泡还 培养液中添加 2和氢化可的松后, 卵泡的体 IGF I 没有形成内膜和外膜, 卵泡卵母细胞的透明带尚 外存活时间延长, 一直到培养的结束。在不含这 2 未完全发育, 卵泡几乎呈半流体状, 极易变形, 镜种成分的培养液中, 卵泡卵母细胞只能存活 3 , d 下拣卵时就能观察到这种现象。 所以在二维培养 至 多 不 超 过 7 , 卵 母 细 胞 的 直 径 增 长 也 很 慢。 d 时, 卵泡与培养皿底面粘着后, 必然会在底部形成 12 等报道在仓鼠腔前卵泡的体外培养时, 不R o y 一个大的接触平面, 基膜极易贴壁。在基膜溶解或 管是否用促性腺激素处理, 缺乏胰岛素都会导致破裂后, 颗粒细胞扩展, 形成单层, 似乎颗粒细胞 各期卵泡在 24 内退化。 因此认为, 胰岛素是卵 h 在行为上也尽力寻找附着物。 这种行为对卵泡三 泡体外存活的必要成分, 而氢化可的松能促使细 维立体结构完整性的维持是极其不利的。胞的粘着和增殖。 在本研究中使用 2取得了 IGF I 由于卵泡原有三维立体结构的破坏, 易于导 相同的效果。 试验中发现, 对卵泡的体外存F SH 致卵母细胞的迁移。 卵母细胞的这种行为有 3 种 活能力未显示出明显的促进作用, 在卵母细胞的( ) 情况: 1卵母细胞迁移至卵泡的顶部, 但并不游 生 长 能 力 上, 其 影 响 也 不 是 很 大, 尽 管 比 不 含离出卵泡之外, 卵母细胞的上表面仍有颗粒细胞 组的增长幅度有所提高, 但无明显差异。 也 F SH 覆盖, 其余部位依然能与其周围的颗粒细胞保持 可能是由于未添加 组的血清中的促性腺激F SH ( ) 接触; 2卵母细胞从卵泡的侧面渗出, 在这种情 素起了作用。但是添加嘌呤类物质以后, 在培养的况下卵母细胞易于暴露于卵泡外面而使其部分或 24 甚至 48 内, 卵泡颗粒细胞间的联系显得更 h h ( ) 全 部裸露; 3卵母细胞的底部与培养皿底面接 加 紧密, 基膜的结构也相对完整些。 这和 Epp ig 13等 的报道是一致的。然而对牛腔前卵泡的体外 5 2, , , C a r ro ll J W h it t ingh am D GW oo d M J et a l. E x t rao va r ian 培养表明, 添加 可使其直径增长加快, 颗粒F SH p ro duc t io n o f m a tu re v iab le m o u se oo cy te s f rom f ro zen 14 细胞增多。 虽然预试验结果未显示出 对 F SH p r im a ry fo llic le s. J R ep ro d F e r t il, 1990, 90: 321, 327 卵泡作用的明显优势, 但并不能因此就作出定论。 6 , , . K im ISh ah ac C G reenw a ld G SA sp ec ie s d iffe rence 也许是添加了 2和氢化可的松之后, 促进了 IGF I be tw een h am ste r and ra t in th e affec t o f eo st ro gen s o n g row th 卵泡对 应答反应才使卵泡得以存活并生长。 . , 1984, 72: 179,F SH o f la rge p rean t ra l fo llic le sJ R ep ro d F e r t il 15 185 实际上, 这一作用在试验中得到了证实。L isa 77 , , . L isa C Sh illa C T hom a s J CI n v i t ro fo llicu lo gene sis o f ra t 等 也认为, 胰岛素对大鼠所有各级卵泡的存活 . , 1995, 136: 3369, 3377p rean t ra l fo llic le sE ndo c r ino lo gy 是必要的, 还能 提 高 生 长 卵 泡 对 的 应 答 反F SH , ′. 8 Epp ig J J O B r ien M JD eve lopm en t in v i tro o f m o u se 应。 同样有报道称胰岛素对卵泡最初的存活是必 . , 1996, 54: 177oo cy te s f rom p r im o rd ia l fo llic le sB io l R ep ro d 要的, 但只有胰岛素不足以维持健康卵胞, 还需要 , 339 9 , , , N u t t inck F M e rm illo d P M a ssip A et a l. C h a rac te r iza t io n 其他因子的联合作用, 胰岛素样生长因子也具有 16 : o f in v i t ro g row th o f bo v ine p rean t ra l fo llic le sA p re lim ina ry 同样的作用。在山羊无腔卵泡的体外培养中也 . , 1993, 39: 811, 821studyT h e r io geno lo gy 可能具有同样的作用机制。 , , , 10 F igue iredo J R H u sho f S C J V an den H u rk R et a l. 313 关于卵母细胞的体外生长 本试验结果表 P re se rva t io n o f oo cy te and g ranu lo sa ce ll m o rp ho lo gy in 明, 在培养到第 9 天, 卵母细胞的平均直径增长到 ,bo v ine p rean t ra l fo llic le s cu ltu red in v i tro. T h e r io geno lo gy 1994, 41: 1333, 1346 153130 该体积超过了山羊卵巢卵泡组织学 , Λm 17 11 H irao Y, N aga i T , Kubo M , et a l. I n v i tro g row th and ( ) 形态观察值 125 左右。 后者是经固定处Λm m a tu ra t io n o f p ig oo cy te s. J R ep ro d F e r t il, 1994, 100: 333 理后的测值。 即使活体测量也因研究者的不同而, 339 异, 许多测值不包括透明带厚度, 而且在液体环境 , . 12 Ro y S K G reenw a ld G SH o rm o na l requ irem en t s fo r th e 中测量往往有一定误差。本试验发现, 卵母细胞的 g row th and d iffe ren t ia t io n o f h am ste r p rean t ra l fo llic le s in 2, 144. , 1989, 87: 103lo ngte rm cu ltu reJ R ep ro d F e r t il 直径最大可达 180 。 综合考虑上述若干因素,Λm , . 13 Epp ig J J D ow n s S M T h e effec t o f h ypo xan th ine o n 本试验中卵母细胞的生长体积属于正常范围。m o u se oo cy te g row th and deve lopm en t in v i tro: m a in tenance 2参 考 文 献o f m e io t ic a r re st and go nado t rop ininduced oo cy te . , 1989, 119: 313, 321m a tu ra t io nD ev B io l 1 R y le M . T h e g row th in v i tro o f m o u se o va r ian fo llic le s o f , , , H u lsho f S C J F igue iredo J R B eck e r s J F et a l. E ffec t s o f 14 . d iffe ren t size s in re spo n se to p u r if ied go nado t rop in sJ R ep ro d , 172fe ta l bo v ine se rum F SH and Βeo st rad io l o n th e cu ltu re o f , 1972, 30: 395, 405F e r t il. , 1995, 44: 217,bo v ine p rean t ra l fo llic le sT h e r io geno lo gy 2 . Epp ig J JM o u se oo cy te deve lopm en t in v i t ro w ith va r io u s 226 . , 1977, 60: 371, 388cu ltu re sy stemD ev B io l . H ir sh f ie ld A ND eve lopm en t o f fo llic le s in m amm a lian 15 , , . 3 C an ip a r i R P a lom b i F R am inucc iM E a r ly p ro g ramm ing o f . , 1991, 124: 43, 101o va ryIn t l R ev C y to l . ,m a tu ra t io n com p e tence in m o u se oo cy te g row thD ev B io l . 2Gu idece L CIn su lin lik e g row th fac to r s and o va r ian 16 1984, 102: 519, 524 . , 1992, 13: 641, 669 fo llicu la r deve lopm en tE ndo c r R ev谭Epp ig J J , Sch ro ede r A C. C ap ac ity o f m o u se oo cy te s f rom 4 景和, 孙青原, 杨增明, 等 1 山羊卵母细胞发育的超微结构 研17 ( ) 究 1 解剖学报, 1992, 23 1: 106, 110 p rean t ra l fo llic le s to unde rgo em b ryo gene sis and deve lopm en t to live yo ung af te r g rw th , m a tu ra t io n , and fe r t iliza t io n in v i t ro. B io l R ep ro d, 1989, 41: 268, 276 -Grow th of H irc in e O va r ian Non an tra l Fo ll ic le O ocy te s in vit ro (, Zho u H uanm in F acu l ty of A n im a l S c ienceI nne r M ong lol ia I ns t itu te of A g r icu l tu re and ), 010018A n im a l H u sband ry H oh h ot (), Zh ang Yo ng D ep a r tm en t of D ev e lopm en ta l B iology N or thw es t A g r icu l tu ra l U n iv e rs ity 2A bstrac t T h e h irc ine no n an t ra l fo llic le oo cy te s w e re p ro ved in th e p re sen t exp e r im en t to su rv ive and g row in () ( ) ( ) ( ) 20 ƒƒƒ, 10% , 40 , 2 , DM EM supp lem en ted w ith H E P E S mm o lL FC S F SH m gL h ypo xan th ine mm o lL dbcAM P ( ) () () ()2 21 50 2ƒ, ƒ, 40 ƒ50 ƒ. , mm o lL IGF ΛgL h yd ro co r t iso ne ΛgL and IT S ΛgL In a tw o d im en sio na l cu ltu re sy stem th e in v i t ro . g row th p a t te rn o f th e fo llic le s in a h eap seem ed to be o f benef it to th e oo cy te sA f te r th e fo llic le oo cy te s w e re in v i t ro 9 150 , cu ltu red fo r day s th e oo cy te s h ad g row n up to be o ve r Λm in d iam e te rreach ing th e m a tu ra t io n size w ith 53%. 2th e su rv iva l ra te o f T h e exp e r im en t dem o st ra ted th a t th e h irc ine no n an t ra l fo llic le oo cy te s m ay su rv ive and g row in v i t ro .in a su itab le cu ltu re sy stem up to th e ir m a tu ra t io n size ; 2in v i t ro ; ; Key words h irc ineno n an t ra l fo llic leoo cy teg row th