柴地合方对慢性应激大鼠大脑前额皮质和海马单胺类神经递质的影响

柴地合方对慢性应激大鼠大脑前额皮质和海马单胺类神经递质的影响 柴地合方对慢性应激大鼠大脑前额皮质和 海马单胺类神经递质的影响 郁模型,慢性给予柴地合方,采用高效液相色谱系统(HPLC)加电化学检 测器(ECD)检测前额皮质和海马组织中单胺类神经递质及相关代谢产物的含量.结果:慢性应激 大鼠前额皮质中去甲肾上腺素(NE),5羟色胺(5-HT)和3,4一二羟基苯乙酸(DOPAC)含量显着降 低,柴地合方可以翻转这种降低;慢性应激大鼠海马中NE,5一HT含量显着降低,柴地合方可以部分 逆转降低水平.结论:柴地合方可升高慢性应激模型大鼠前额皮质和海马中NE和5-HT水平,这 可能是其抗抑郁的之一. 关键词:柴地合方;抑郁症;慢性应激;单胺类神经递质 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1000—2219(2005)01—0034—03 柴地合方是名老中医聂惠民教授根据抑郁症的 发病机制,由经方柴胡加龙骨牡蛎汤与百合地黄汤 合方化裁而成,临床应用表明其对抑郁症具有较好 的治疗作用.笔者采用小鼠强迫游泳试验,小鼠悬一 尾试验和大鼠慢性应激等抑郁模型对其抗抑郁作用 进行评价,结果显示其具有良好的抗抑郁样活性. 在此研究基础上,结合抑郁症发病的生物学机制和 抗抑郁作用起效的”单胺假说”,研究观察了柴地合 方对慢性应激大鼠脑组织前额皮质和海马单胺类神 经递质及其代谢产物的影响,以此探讨其抗抑郁作 用的部分神经生物学机制. 1材料 1.1动物二级雄性SD大鼠24只,体质量240, 260g,购于北京维通利华实验动物养殖中心,饲养 于中国医学科学院基础研究所实验动物中心. 1.2药物柴地合方,由柴胡,黄芩,人参,半夏,百 合,生地黄等药物以8:3:3:4:20:20的配伍比 例组成,采用水煎浓缩为生药浓度2.2g/IIll的提取 液. 1.3仪器Waters510高效液相色谱系统,Waters 464电化学检测器(Waters公司),WDL-95色谱工作 站(中国科学院大连化学物理研究所色谱 中心),超声波粉碎器MSE150型,台式高速离心机 作者简介:张有志(1971一),医学博士,助理研究员. 1北京中医药大学基础医学院 2中国医学科学院基础医学研究所 34 (军事医学科学院实验仪器厂)等. 1.4试剂去甲肾上腺素(NE),多巴胺(DA),3, 4一二羟基苯乙酸(DOPAC),5一羟色胺(5-HT),5一羟 基吲哚乙酸(5-HIAA),高香草酸(HVA),3,4一二羟 苄胺(DHBA)(以上均为Sigma公司产品),B-8离 子对试剂(天津化学试剂公司),二正丁胺(上海化 学试剂采购站进口分装);其余试剂均为国产色谱 纯或纯. 2 2.1慢性应激抑郁模型的建立参照不可预知的 慢性应激模型…和慢性不可预知的温和性应激模 型?31的模型复制和行为测试方法建立.动物随机 分为3组,每组6只.正常对照组,每笼3只饲养, 正常进食饮水,不给任何刺激.其他两组分别为慢 性应激模型组和慢性应激模型+柴地合方(7g/kg, 根据行为学结果确定)治疗组,每笼1只孤养,并接 受21d长期应激刺激,刺激包括:冰水游泳(4~C,5 nlin),夹尾(3rain),禁水(40h),禁食(40h),配对 饲养(24h),潮湿饲养(将200ml水加入有锯木屑 的笼底,24h),束缚(15h)和通宵照明刺激(12h), 每1,2d随机给予一种刺激. 应激刺激同时5ml/kg慢性灌胃给药,模型组 每13给服9.0g/L氯化钠注射液,柴地合方治疗组 给服柴地合方,正常组不给任何药物和灌胃动作刺 激. 2.2取材方法断头处死动物后,剥离出全脑,在 冰上迅速分离出前额皮质和海马,称质量后置Epp 管中用液氮快速冷冻后,放人一80~C冰箱保存至测 定. 2.3测定方法 2.3.1样品的处理:根据脑组织质量不同加人不同 体积的溶液:?前额皮质:160mg以下加入0.1M HC104475和2ng/的DHBA25p+l,160mg以 上加入0.1MHC104665和2ng/的DHBA35 ;?海马:加入0.1MHC104380和2ng/的 DHBA20.冰浴条件下超声匀浆30S,然后在常 温下1l000r/rain离心lOmin,上清液用于神经递 质测定. 2.3.2神经递质检测:采用高效液相色谱系统 (HPLC)-电化学检测器(ECD)检测5-HT,NE,DA 及相关代谢产物5一羟基吲哚乙酸(5.HIAA),3,4.二 羟基苯乙酸(DOPAC),取上清液lOl进样测定,各 神经递质含量以ng/g组织湿质量计算. 色谱条件:色谱柱为4mm×150mill,Nova.pak c.8,5tim(大连色谱中心填装);流动相为50mM, pH值3.5的柠檬酸一乙酸钠缓冲液(内含1.0mM B.{;离子对试剂,1.8mM二正丁胺,0.3mM Na,EDTA.40ml/L甲醇),流速1.0ml/min;玻璃碳 工作电极,检测电压为+O.75V.液组成:lO 的0.1MHC10中含NE5ng,DHBAlng,DOPAC5 ng.DA5ng,5HIAAlOng和5-HTlOng. 2.4数据处理方法所有数据以”?s”表示,组 间差异采用单因素方差分析. 3结果 3.1前额皮质组织模型组大鼠NE,5-HT和 DOPAC含量与正常组比较显着降低(P<0.05或P <0.01);柴地合方组大鼠NE,5一HT和DOPAC与模 型组比较含量显着升高(P<0.01);DA,5一HIAA, HVA含量各组之间比较,差异无显着性(尸> 0.05).见表l. 3.2海马组织模型组大鼠NE,5-HT含量与正常 组比较显着降低(P<0.01);柴地合方组大鼠NE, 5一HT含量与模型组比较有升高趋势,但差异无显着 性(P>0.05);5-HIAA,HVA含量各组之间比较,差 异无显着性(P>0.05).DA及其代谢产物DOPAC 含量过低,数据缺乏准确性,故未附.见表2. 表1柴地合方对大鼠前额皮质单胺类神经递质及其代谢产物的的影响(ng/g,?s) 与正常组比较,?P<0.o5,??P<0.01;与模型组比较,?P<0.o5,??P<0.01(下同) 表2柴地合方对大鼠海马单胺类神经递质及其代谢产物的的影响(ng/g,x?s) 4讨论 抑郁症属于中医郁证范畴,中医认为抑郁症的 病因大多由于谋虑不遂,忧思气结,精神紧张或悲愁 恐惧等导致五志过极,七情内伤所致,并与素体虚 弱,性格内向或肝气易结的体质因素密切相关.在 病机方面,中医认为抑郁症的病位主要在心,脑,但 其发生与脾,胃,肝,三焦,肾和胆等脏腑有关,尤其 是与脾胃和肝脏密切相关,气机郁滞是本病最重要 的病理特征;在病势和病机转化,本病大多具有肝失 疏泄,气机郁滞,El久郁而化火,导致正虚邪盛的特 点.柴地合方可针对抑郁症虚实夹杂的复杂病机, 以柴胡加龙骨牡蛎汤疏肝解郁,和解少阳枢机,通达 三焦,泻热安神;百合地黄汤养阴清热安神.两方协 同,共同起到疏肝解郁,调畅气机,养阴清热安神,调 理脾胃和镇静安神的作用. 20世纪60年代,临床偶然发现抗结核药异丙 肼由于抑制单胺氧化酶(MAO)的活性,升高突触内 单胺含量,有抗抑郁作用;降压药利血平由于存在 耗竭单胺神经递质的不良反应,可使临床约10%的 病人出现抑郁表现J.这使得Schildkraut和Bun— ney等在1965年几乎同时提出抑郁症发病的”单胺 假说”(monoaminehypothesis)J.随后研究表明, 多数抗抑郁药物或疗法可以增加突触内单胺含量, 而在此理论指导下的抗抑郁药物的研制推动了”单 胺假说”的形成和发展.抑郁症的”单胺假说”认为 抑郁症的生物学基础是脑内单胺递质5一FIT和(或) 35 NE的缺乏.在过去的近4O年,这个假说得到了越 来越多的实验和临床证据J... HPLC.ECD检测单胺类神经递质具有高灵敏度 和高选择性的优点,ECD能检测具有电化学活性的 物质,因此它可测定大量非电活性物质中的痕量电 活性物质.单胺类神经递质及其代谢产物均具有电 化学活性,因此HPLC—ECD被广泛用用生物样品中 单胺类递质及其代谢产物的测定【l?. 本研究检测了大鼠大脑前额皮质和海马单胺类 神经递质及其代谢产物,结果发现,慢性应激抑郁模 型大鼠前额皮质的NE,5-HT和DA代谢产物 DOPAC含量显着降低,海马的NE和5-HT水平亦降 低,这与临床抑郁症的生物学特点基本一致.采用 柴地合方慢性给药可以显着逆转应激大鼠前额皮质 的NE,5-HT和DOPAC含量的降低,与应激对照组 比较,差异极显着,与正常对照组比较,没有显着性 差异.柴地合方慢性给药虽对应激大鼠海马的单胺 递质没有显着改变,但NE和5-HT水平有升高趋 势,与正常组比较没有显着性差异.本研究结果表 明长期给服柴地合方可以升高慢性应激模型大鼠前 额皮质和海马中NE和5-HT水平,这可能是其抗抑 郁的重要机制之一. 参考文献: [1]KatzIU,RothKA,CarrollBJ.Acuteandchronic 8tre88effectsonopenfieldactivityintherat:Implicationsfora modelofdepression[J].NeurosciBiobehavRev,1981,5(2): 247—251. [2]WillnerP,”lowellA,SampsonD,eta1.Reductionof sucro6epreferencebychronicunpredictable=fiIdstress,andits restorationbyanicyclicantidepressant[J].Psychopharmacelogy (Bed),1987,93(3):358—364. [3]SwainMG,LeT.Chroniccholestasisinrat-qinduces anhedoniaandalossofsocialinterest[J].Hepatology,1998,28 (1):6—1O. 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(收稿日期:2004—08—27) Effect0fChaiDiHefangonMonoamineNeurotransmitters inthePrefrontalCortexandHippocampusofChronicStressRats ZHANGYou-zhi.NlEHui.min.zHANGDe.chang (InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences, theChinesePeople’SLiberationArmy,Beijing100850,China) Abstract:Objective:ToexploretheeffectofChaiDiHefangonmonoamineneurotransmittersforprobinginto itsantidepressantmechanism.Method:TheratchronicstressdepressionmodelwassetupandChaiDiHefangwas chronicallyadministered.ThelevelsofmonoamineneurotransmittersandtheirmetabolitesdetectedbyHLPC-ECD. Result:ThelevelsofNE,5一 HTandDOPACintheprefrontalcortexofchronicstressratsdecreased,andChai Di Hefangcouldreverethem.ThelevelsofNEand5-HTinthehippocampusofchronicstressratsdecreased,and ChaiDiHefangcouldreversethanpartly.Conclusion:ChaiDiHefangCanincreasethelevelsofNEand5一HTin theprefrontalcortexandhippoeampusofchronicstressrats.Thismaybeitspartantidepressantmechanism. Keywords:ChaiDiHefang;Depression;Chronicstress;Monoamineneurotransm/tter