茯苓的化学成分研究.doc

茯苓的化学成分研究.doc 茯苓的化学成分研究 [摘要] 对中药茯苓的化学成分进行了研究。利用正相和反相硅胶柱，Sephadex LH-20和制备型HPLC等色谱技术从中分离得到13个化合物，分别鉴定为土莫酸(1)、去氢土莫酸(2)、3β，5α-二羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮(3)、3β，5α，9α-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮(4)、麦角甾-7，22-二烯-3-酮(5)、6，9-环氧麦角甾-7，22-二烯-3β-醇(6)、麦角甾-4，22-二烯-3-酮(7)、麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(8)、麦角甾-7，22-二烯-5，6-环氧-3-醇(9)、β-谷甾醇(10)、核糖醇(11)、甘露醇(12)、齐墩果酸乙酸酯(13)。并运用质谱、核磁等波谱技术对分离得到的化合物进行了结构鉴定。化合物3,13为首次从该种中药中分离得到。 [关键词] 茯苓;化学成分;甾醇 茯苓为担子菌门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，多孔菌科Polyporaceae真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，首载于《神农本草经》，列为上品[1]，有利水消肿，渗湿，健脾和宁心之功效，多用于治疗小便不利，水肿胀满，痰饮咳逆，脾胃气虚，食少便溏，体倦乏力以及心神不安，惊悸，失眠等[2]。 茯苓资源丰富，药理作用显著，因此，20世纪70年代以来，中外学者对它的化学成分进行了广泛的研究。本文从茯苓中分离了13个化合物，均为首次从茯苓中分离得到。 1 材料 Boetius 显微熔点仪(温度未较正);MERCURY-300，400，500，600型核磁共振谱仪测定;ESI用Agilent 1100LC/MSD Trap SL 型质谱仪;柱色谱以及薄层色谱用硅胶为青岛海洋化工厂生产;Sephadex LH-20为Pharmacia 产品;反相填料用ODS(YMC公司产品); Luntech制备型HPLC以及YMC-Pack ODS-A反相制备柱(20 mm×250 mm，5 μm)。所用试剂均为纯，由北京化学试剂厂生产。 茯苓由江苏康缘药业股份有限公司提供，由中国医学科学院药物研究所马林研究员鉴定为茯苓P. cocos，标本保存于药物研究所标本室，标本号ID-S2517。 2 提取分离 茯苓白色菌核20 kg，用95%乙醇加热回流提取3次，每次分别提取2，1，1 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏250 g。将浸膏用水分散后分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯部分101 g，正丁醇部分77 g，水部分68 g。乙酸乙酯部分与硅胶拌样(1 000 g)后依次用99?1，49?1，19?1，9?1，0?1的氯仿-甲醇系统洗脱，得到5个部分，分别为Fr.1,Fr.5。其中Fr.2采用硅胶柱色谱分离，氯仿-丙酮(99?1,1?1)梯度洗脱得到Fr.2A,Fr.2G。Fr.2B经制备型HPLC纯化得到化合物1(3 mg)，2(13 mg)，Fr. 2A用Sephadex LH-20纯化后经制备型HPLC纯化，分别得到化合物3(3 mg)，4(4 mg)。 Fr.1采用硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮(99?1,0?1)梯度洗脱得到Fr.1A, Fr.1F。其中Fr.1A经Sephadex LH-20反复纯化得到化合物6 (9 mg)。Fr.1B经制备型HPLC纯化得到化合物5(16 mg) ，7(8 mg)，8(6 mg) ，10(6 mg)。Fr.1D用Sephadex LH-20反复纯化，后经制备 4 mg)，13(8 mg)。 型HPLC分离，分别得到化合物9( Fr.5首先采用RP-C18反相柱色谱分离，甲醇-水(1?4,9?1)梯度洗脱得到Fr.5A, Fr.5F。Fr.5A和Fr.5D经重结晶后分别得到化合物12 (8 mg)，11(5 mg)。 3 结构鉴定 化合物1 白色晶体(甲醇)，mp 253,256 ? 。ESI-(+)-MS m/z 509[M+Na]+。IR(KBr)νmax:1 681cm-1。1H-NMR(pyridine-d5，300 MHz) δ:1.00(3H，s，H-28)，1.06(3H，s，H-29)，1.14(3H，s，H-19)，0.96，0.98(各3H，d，J=6.6 Hz，H-26，27)，1.23(3H，s，H-18)，1.47(3H，s，H-30)，2.31(1H，m，H-25)，2.91(1H，d， J=11.4 Hz，H-17)，2.94(1H，m，H-20)，4.54(1H，t，J=6.0 Hz，H-16)，3.46(1H，t，J=6.0 Hz，H-3) 4.82，4.98(各1H，s，H-31);13C-NMR(pyridine-d5，125 MHz) δ:179.3(C-21)，156.0 (C-24)，134.8(C-9)，135.2(C-8)，27.4(C-7)，21.4(C-11)，106.8(C-31)，77.9(C-3)，76.5 (C-16)，57.1 (C-17)，49.1 (C-14)，48.8 (C-20)，46.8 (C-13)，44.4 (C-15)，51.2 (C-5)，39.8 (C-4)，37.9 (C-10)，30.2 (C-12)，34.7 (C-25)，33.6 (C-23)，31.9 (C-22)，36.9 (C-1)，29.2 (C-28)，25.7 (C-30)，29.1 (C-2)，19.4 (C-6)，17.0 (C-29)，20.1 (C-19)，22.1 (C-26)，21.9 (C-27)，17.9 (C-18)。参考文献[3]数据，化合物1鉴定为土莫酸。 化合物2 白色粉末，mp 272,275 ? 。ESI-(+)-MS m/z 507[M+Na]+。IR(KBr)νmax:1 706cm-1。1H-NMR(pyridine-d5，300 MHz)δ:5.62(1H，br s，H-7)，5.39(1H，m，H-11)，4.83，4.97 (各1H，s，H-31)，4.53(1H，m，H-16)，3.45(1H，d，J=7.2 Hz，H-3)，1.42(3H，s，H-30)，1.18(3H，s，H-18)，1.09(3H，s，H-29)，1.07 (3H，s，H-19)，1.01(3H，s，H-18)，0.99，0.96(各3H，d，J=7.5 Hz，H-26，27);13C-NMR (pyridine-d5，100 MHz) δ:178.6 (C-21)，156.1 (C-24)，146.6(C-9)，142.8 (C-8)，121.3(C-7)，116.1(C-11)，107.0(C-31)，78.0(C-3)，76.4(C-16)，57.6(C-17)，49.8 (C-5)，49.5(C-14)，48.6(C-20)，45.1(C-13)，44.4(C-15)，39.3(C-4)，37.9(C-10)，36.2 (C-12)，34.1(C-25)，33.2(C-23)，31.5(C-22)，30.6(C-1)，28.7(C-28)，26.7(C-30)，26.6 (C-2)，23.4(C-6)，23.0(C-19)，22.0(C-26)，21.9(C-27)，17.6(C-18)，16.6(C-29)。参考文献[3]数据，化合物2鉴定为去氢土莫酸。 化合物3 无定形粉末，HREI-MS m/z 427[M-H]-。1H-NMR(pyridine-d5，300 MHz) δ:5.92(1H，s，H-7)，5.29(1H，dd， J=15.0，7.1 Hz，H-23)，5.21(1H，dd，J=15.0，7.5 Hz，H-22)，4.70(1H，m，H-3)，1.09(3H，d， J=6.6 Hz，H-21)，1.04(3H，s，H-19)，0.95(3H，d， J=6.6 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.0 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.0 Hz，H-26)，0.58(3H，s，H-18);13C-NMR(pyridine-d5，150 MHz) δ:200.1(C-6)，164.1(C-8)，135.2(C-22)，132.4 (C-23)，120.7(C-7)，77.4(C-5)，67.1 (C-3)，56.0(C-17)，55.8(C-14)，44.7(C-9)，44.3(C-13)，43.1(C-24)，41.3(C-20)，40.6(C-12)，39.2(C-4)， 37.8(C-10)，33.4(C-25)，31.7(C-1)，31.3(C-2)，28.3(C-16)，22.8(C-15)，22.1(C-11)，21.4(C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，17.8(C-28)，16.4(C-19)，12.3(C-18)。参考文献[4-5]中的数据，化合物3鉴定为3β，5α-二羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮。 化合物4 无定形粉末，HREI-MS m/z 443[M-H]-。1H-NMR(pyridine-d5，300 MHz) δ:5.94(1H，s，H-7)，5.25(1H，dd，J=7.5，10.5 Hz，H-23)，5.21(1H，dd，J=7.5，10.5 Hz，H-22)，4.93(1H，m，H-3)，1.15(3H，s，H-19)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.96(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86,0.84(6H，d，J=6.0 Hz，H-26，27)，0.63(3H，s，H-18);13C-NMR(pyridine-d5，150 MHz) δ:199.1(C-6)，164.1(C-7)，135.2(C-22)，132.4 (C-23)，120.3(C-8)，79.8 (C-5)，75.0(C-9)，66.8(C-3)，56.1(C-17)，56.0 (C-14)，45.3(C-13)，43.1(C-24)，42.2(C-10)，40.6(C-20)，40.6(C-12)，38.2(C-4)，33.3(C-25)，31.5(C-2)，28.9 (C-11)，28.3(C-16)，26.4(C-1)，22.7(C-15)，21.3 (C-21)，20.4(C-27)，20.1(C-19)，19.8 (C-26)，17.9(C-28)，12.4(C-18)。参考文献[5-6]中的数据，化合物4鉴定为3β，5α，9α-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮。 化合物5 白色针状晶体(甲醇)，ESI-(-)-MS m/z 395[M-H]-。1H-NMR(pyridine-d5，300 MHz) δ:5.16(1H，s，H-7)，5.25,5.21 (2H，t，J=12.0 Hz，H-22，23)，1.26(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.86(3H，d， J=6.6 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.60(3H，s，H-18);13C-NMR(pyridine-d5， 125 MHz) δ:210.2(C-3)，139.6 (C-8)，136.2(C-22)，132.1 (C-23)，117.5(C-7)，56.1(C-17)，52.2(C-14)，49.0 (C-9)，44.4(C-4)，43.5 (C-13)，43.1(C-24)，43.0 (C-2)，40.8(C-20)，39.5(C-12)，38.8 (C-5)，38.3(C-1)，34.6(C-10)，33.4(C-25)，30.0(C-6)，28.5(C-16)，22.9(C-15)，21.9 (C-11)，21.4(C-26)，20.2(C-27)，19.8 (C-21)，17.8(C-28)，12.3 (C-19)，12.3(C-18)。参考文献[7]中的数据，化合物5鉴定为麦角甾-7，22-二烯-3-酮。 化合物6 白色针状晶体，ESI-(+)-MS m/z 413[M+H]+。1H-NMR(pyridine-d5，300 MHz) δ:5.74 (1H，br s，H-7)，5.29,5.22(2H，m，H-22，23)，4.32(1H，s，H-3)，3.03(1H，d，J=12.3 Hz，H-6)，1.69(3H，s，H-19)，1.08(3H，d，J=6.0 Hz，H-21)，0.96(3H，d， J=3.3 Hz，H-28)，0.91-0.80(6H，m，H-26，27)，0.67(3H，s，H-18);13C-NMR (pyridine-d5，125 MHz) δ:141.5(C-8)，136.2 (C-22)，132.1 (C-23)，120.5(C-7)，76.1(C-9)，74.2(C-6)，67.6(C-3)，56.1(C-17)，52.2 (C-14)，43.8(C-13)，43.7 (C-10)，43.1(C-24)，42.0(C-20)，40.9(C-12)，39.9(C-4)，38.0(C-5)，33.8(C-25)，33.3(C-1)，32.6(C-2)，28.5(C-16)，23.5(C-11)，22.4 (C-15)，21.4 (C-21)，20.1 (C-26)，19.8(C-27)，18.8(C-19)，17.8(C-28)，12.5(C-18)。 参考文献[8]中的数据，化合物6鉴定为6，9-环氧麦角甾-7，22-二烯-3β-醇。 化合物7 白色针状晶体(甲醇)，ESI-(-)-MS m/z 395[M-H]-。1H-NMR (pyridine-d5，300 MHz) δ:5.72(1H，br s，H-4)，5.29,5.22(2H，m，H-22，23)，1.21(3H，s，H-19)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)， 0.92(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.70(3H，s，H-18);13C-NMR (pyridine-d5，125 MHz) δ:199.7 (C-3)，171.8(C-5)，138.1 (C-22)，129.4 (C-23)，123.7(C-4)，56.0(C-14)，55.9(C-17)，53.8(C-9)，43.1 (C-20)，42.4 (C-13)，41.9(C-24)，39.6(C-12)，36.3(C-1)，35.6(C-8)，34.6(C-10)，34.0 (C-2)，32.9(C-6)，32.7(C-7)，31.5(C-25)，28.1(C-16)，24.2(C-15)，21.0(C-11)，20.5(C-27)，19.4(C-26)，18.8 (C-21)，17.6(C-28)，17.4 (C-19)，11.9(C-18)。参考文献[4]中的数据，化合物7鉴定为麦角甾-4，22-二烯-3-酮。 化合物8 白色针状晶体(甲醇)，ESI-(+)-MS m/z 453[M+Na]+。1H-NMR 400 MHz) δ:5.76(1H，dd，J=4.8，2.4 Hz，H-7)，(pyridine-d5， 5.27(1H，dd，J=15.2，7.6 Hz，H-23)，5.19(1H，dd，J=15.2，7.6 Hz，H-22) ，4.83(1H，m，H-3)，4.32(1H，br s，H-6)，0.67(3H，s，H-18)，1.52(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.97(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.88(3H，d， J=6.8 Hz，H-27)，0.87(3H，d， J=6.8 Hz，H-26);13C-NMR(pyridine-d5，125 MHz) δ:33.6(C-1)，32.4(C-2)，67.4(C-3)，40.1 (C-4)，75.9(C-5)，74.1(C-6)，120.3(C-7)，141.3(C-8)，43.5(C-9)，37.8(C-10)，22.2 (C-11)，39.7(C-12)，42.8(C-13)，55.0(C-14)，23.3(C-15)，28.3(C-16)，55.9(C-17)，12.3 (C-18)，18.6(C-19)，40.7(C-20)，21.2(C-21)，136.0 (C-22)，131.9(C-23)，43.1(C-24)，33.1 (C-25)，19.9(C-26)，19.6(C-27)，17.6 (C-28)。参考文献[5-6]中的数据，化合物8鉴定为 麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇。 化合物9 白色粉末，mp 229,231 ?。ESI-(+)-MS m/z 413[M+H]+。1H-NMR(pyridine-d5，500 MHz) δ:5.21,5.17(3H，m，H-7，22，23)，4.32(1H，m，H-3)，3.05(1H，t，J=12.5 Hz，H-6)，0.65(3H，s，H-18)，1.05(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=5.0 Hz，H-21)，0.85(3H，d，J=5.0 Hz，H-28)，0.82(3H，d，J=5.0 Hz，H-27)，0.79(3H，d，J=5.0 Hz，H-26);13C-NMR(pyridine-d5，125 MHz) δ:32.6(C-1)，30.6(C-2)，67.6(C-3)，39.9 (C-4)，76.1(C-5)，74.2(C-6)，120.5(C-7)，141.5(C-8)，43.7(C-9)，38.0(C-10)，22.4(C-11)，40.9(C-12)，43.0(C-13)，55.2(C-14)，23.4(C-15)，28.5 (C-16)，56.1(C-17)，12.5(C-18)，18.8(C-19)，40.0(C-20)，21.4(C-21)，136.2(C-22)，132.1 (C-23)，41.9 (C-24)，33.3(C-25)，20.1(C-26)，19.8 (C-27)，17.8(C-28)。参考文献[9]中的数据，化合物9鉴定为麦角甾-7，22-二烯-5，6-环氧-3-醇。 化合物10 白色针状结晶(CHCl3)，mp 126,127 ?。薄层色谱与β-谷甾醇一致，故该化合物确定为β-谷甾醇。 化合物11 白色块状结晶(H2O)，mp 110,112 ?。13C-NMR (D2O，125 MHz)δ:73.7，73.3，73.0，65.9，65.8。薄层色谱与核糖醇一致，故鉴定为核糖醇。 化合物12 白色针状晶体(丙酮)，mp 166,168 ?。ESI-(+)-MS m/z 205[M+Na]+;13C-NMR显示分子中有3个连氧碳δ:71.4，69.8，63.9。薄层色谱与甘露醇一致，故化合物12鉴定为甘露醇。 化合物13 白色粉末(甲醇)，mp 265,268 ?。ESI-(-)-MS m/z 497[M-H]-。1H-NMR(CDCl3，300 MHz) δ:5.27(1H，s，H-12)，4， 49(1H，t，J=8.0 Hz，H-3)，2.04(3H，s，-COCH3)，1.12(3H，s)， 0.93,0.84(15H，br s)，0.74(3H，s);13C-NMR(CDCl3，100 MHz) δ: 37.7(C-1)，27.6 (C-2)，80.9(C-3)，39.2(C-4)，55.2(C-5)，18.1(C-6)，33.0(C-7)，38.0(C-8)，47.5(C-9)，36.9(C-10)，22.8(C-11)， 122.5(C-12)，143.6(C-13)，41.5(C-14)，25.9(C-15)，23.5 (C-16)， 46.5(C-17)，40.8(C-18)，45.8(C-19)，30.6(C-20)，33.7(C-21)， 32.4(C-22)，28.0 (C-23)，16.6(C-24)，15.4(C-25)，17.1(C-26)， 23.5(C-27)，171.0(C-28)，32.4(C-29)，23.3(C-30)，184.1(CH3CO)， 21.3(CH3CO)。参考文献[10]中的数据，化合物13鉴定为齐墩果酸乙酸 酯。 [参考文献] [1] 肖培根. 新编中药志[M]. 3版. 北京:化学工业出版社，2002: 890. [2] 仲兆金，刘浚. 茯苓有效成分三萜的研究进展[J]. 中成药， 2001，23(1):58. [3] Zhou L，Zhang Y C，Ka-yun N G，et al. Cytotoxic and anti-oxidant activities of lanostane-type triterpenes isolated from Poria cocos[J]. Chem Pharm Bull，2008，56 (10):1459. [4] Takaaki I，Yasunori Y，Masao K. Sterol constituents from the fruit bodies of Grilola frondosa (Fr.) S. F. Gray[J]. Chem Pharm Bull，1997，45 (11):1756. [5] Yoshihisa T，Minoru U，Toshiaki T，et al. Glycosides of ergosterol derivatives from Hericum erinacens[J]. Phytochemistry， 1991，30 (12):4117. [6] Hirokazu，Kawagishi，Ryosuke K，et al. Cytotoxic steroids from the mushroom Agaricus blazei[J]. Phytochemistry， 1988，27 (9):2777. [7] Jain A C，Gupta S K. The isolation of lanosta-7，9(11) 24-trien-3β，21-diol from the fungus Ganoderma austral[J]. Phytochemistry， 1984，23(3):686. [8] 陈晓梅，杨峻山，郭顺星，等. 石斛小菇中的甾醇类化合物[J]. 药学学报，2000，35(5):367. [9] 石磊，曹瑞敏，卢士香，等. 榛蘑中一种新化合物的提取、分离 及鉴定[J]. 白求恩医科大学学报，1998，24(4):343. [10] 甘秀海，周欣，陈华国，等. 黑骨藤中极性部位化学成分研究 [J]. 中国中药杂志，2009，34(24):3225. Chemical constituents of Poria cocos YANG Peng-fei LIU Chao WANG Hong-qing LI Jia-chun WANG Zhen-zhong XIAO Wei2 ， CHEN Ruo-yun1* (1.State Key Laboratory for Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050， China; 2.Jiangsu Kanion Phaemaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China) [Abstract] The chemical constituents of Poria cocos were studied by means of silica gel， ODS column chromatography， Sephadex LH-20 and preparative HPLC. Thirteen compounds were isolated from this plant. By analysis of the ESI-MS and NMR data， the structures of these compounds were determined as tumulosic acid(1)， dehydrotumulosic acid(2)， 3β， 5α-dihydroxy-ergosta-7， 22-dien-6-one(3)， 3β， 5α， 9α-trihydroxy-ergosta-7， 22-diene -6-one(4)， ergosta-7， 22-diene-3-one(5)， 6， 9-epoxy-ergosta-7， 22-diene-3-ol(6)， ergosta-4，22-diene-3-one(7)， 3β， 5α， 6 β-trihydroxyl-ergosta-7，22-diene(8)， ergosta-5， 6-epoxy-7， 22-dien-3-ol(9)， β-sitosterol(10)， ribitol(11)， mannitol (12)， and oleanic acid 3-O-acetate(13)， respectively. Compounds 3-13 were isolated from the P. cocos for the first time. [Key words] Poria cocos; chemical constituents; sterol doi:10.4268/cjcmm20140615