免疫组化

免疫组化 免疫组化#实验# 一、 实验目的: 1、学习了解免疫组织化学实验原理, 2、掌握免疫组化实验一般性步骤。 二、 实验器材: 已固定好的未脱蜡的组织切片、光学显微镜、二甲苯、梯度酒精、PBS缓冲液、双氧水、一抗工作液、二抗工作液、辣根过氧化物酶、DAB、盐酸乙醇、苏木精染液、自来水、蒸馏水、中性树胶、载玻片、盖玻片、染色缸、镊子等。 三、 实验步骤: 1、 已固定好的未脱蜡的组织切片脱蜡步骤如下表: 100% 100% 95% 80% 70% 50% XI X? 1:1 ,二甲苯, ,二甲苯, AI A? AI AI AI AI 7min 7min 7min 2min 2min 1min 1min 1min 1min 注:表格中第1行为脱蜡步骤中使用的试剂，第2行则为每步所对应的脱蜡时间，脱蜡从左到右依次进行。 2、脱蜡后蒸馏水槽中流水冲洗2次，5min/次。水速不能过快否则容易将组织切片冲掉。 3、PBS浸洗3次，5min/次。最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。 4、3%HO,无色液体,去离子水孵育15min。(以消除内源性过氧化物酶22 活性，防止过氧化物酶造成的非特异性背景染色,孵育时间不能过长，否则易造成脱片) 5、PBS浸洗3次，5min/次，最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。 O 6、滴加适当比例稀释的一抗， 4C湿盒孵育过夜,一般12-18h即可,。,滴加一抗时要设臵阴性对照一个。阴性对照可滴加PBS。, 7、取出湿盒室温静臵30min。 8、PBS浸洗3次，5min/次，最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。 9、滴加生物素标记的二抗工作液，室温孵育2h。 10、PBS浸洗3次，5min/次最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。 O 11、滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，37C湿盒孵育30min。 12、PBS浸洗3次，5min/次，最后一次冲洗后用滤纸将残液吸净。 13、滴加稀释好的DAB显色液，室温显色7min。镜检控制显色程度。 14、蒸馏水洗以终止反应。 15、将切片放在酸性苏木精中复染3min,染核 淡蓝色最好,。 16、HCl-乙醇中分色40-50s镜检,核染色不深适中，目的物质着色明显最佳, 17、自来水蓝化,15min,，后入蒸馏水洗一次。 18、脱水步骤如下: 50%AI 1:1 70% 80% 95% 100% 100% XI X? (酒精) AI AI AI AI A? ,二甲苯, ,二甲苯, ,,,,,,,,,1 1 1 1 2 2 7 7 7 注:表格中第1行为脱水步骤中使用的试剂，第2行则为每步所对应的脱水时间，脱水从左到右依次进行。 19、用中性树胶进行封片操作，并于显微镜下观察。 四、 实验结果及分析: 1、细胞核和细胞浆染色不太分明，可能原因是盐酸乙醇分色时间不足，致使苏木素染色后细胞核中结合的染料过量。 2、本组实验并没有进行抗原修复，但与没有进行复染的小组相比，特异性显色的细胞,棕黄色,并不是太多，所以排除抗原修复这方面的原因，但是否是由于复染引起有待进一步确定。 五、 实验中的注意事项: 1、HO孵育时间不能过长，否则容易造成脱片现象。由于本实验中采用22 的是防脱切片，所以在实验过程中没有过多注意这方面的问题。 2、为了长期保存，我们一般用中性树胶封片，切记要避免产生气泡，可用方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手用镊子夹住盖片某一拐角，而另一手用镊子拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止,当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 3、自来水蓝化过程中，保证水的流速不能太快，以免产生脱片现象。