亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP-临床医学论文

亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞达p38MAPK和MCP-临床医学论文 【关键词】亚硒酸钠;p38丝裂原活化蛋白激酶;单核细胞趋化蛋白 Roleofsodiumseleniteinregulatingexpressionsofp38MAPKandMCP1inratmesangialcells 【Abstract】 AIM:Toobservetheeffectofsodiumseleniteonexpressionsofp38mitogenactivatedprotEinkinase(p38MAPK)andmonocytechemoattractantprotEIn1(MCP1)inratmesangialcelllineHBZY1,andtostudythemechanismofsodiumseleniteinpreventingdiabeticnephropathy.METHODS: CelllineHBZY1wasincubatedwithhighglucose,highinsulin,H2O2andadvancedglycosylationendproducts(AGEs),respectively(controlgroup);simultaneously,thecelllineHBZY1pretreatedwithsodiumselenitewasalsoincubatedwiththeabovefactors(experimentalgroup).Theexpressionsofp38MAPKandMCP1weredetectedandcomparedinthe2groups.RESULTS: Fourfactorsincreasedtheexpressionsofp38MAPKandMCP1indepently;sodiumseleniteinhibitedtheexpressionsofp38MAPKandMCP1bythe4factorsdistinctly.CONCLUSION: Sodiumselenitecansuppresstheexpressionsofp38MAPKandMCP1inthecelllineHBZY1,whichsuggeststhatsodiumselenitemayplayasignificantroleinthepreventionofdiabeticnephropathybytheinhibitionoftheexpressionsofp38MAPKandMCP1inthecelllineHBZY1. 【Keywords】 sodiumselenite;p38mitogenactivatedproteinkinase;monocytechemoattract antprotein1;mesangialcells;diabeticnephropathy 【摘要】目的:观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1表达p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和单核细胞趋化蛋白1(MCP1)的影响，从而研究硒在防治糖尿病肾病(DN)中的作用机制.方法:分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终末产物(AGEs)刺激HBZY1细胞;先给予100nmol/L亚硒酸钠预处理后，再分别以上述4种刺激因素孵育HBZY1细胞，分别检测HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达并比较.结果:4种刺激因素均可作为独立因素，导致HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达量增加;亚硒酸钠能抑制上述4种因素所致的p38MAPK和MCP1的表达.结论:亚硒酸钠通过抑制p38MAPK和MCP1在HBZY1细胞的表达,从而有效防治DN的发生发展，表明硒在DN的防治过程中发挥积极作用. 【关键词】亚硒酸钠;p38丝裂原活化蛋白激酶;单核细胞趋化蛋白1;系膜细胞;糖尿病肾病 【中图号】R587.24 0引言 近年来国外研究表明单核细胞趋化蛋白 1(monocytechemoattractantprotein1，MCP1)与糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)有密切关系,1,.p38MAPK是细胞信号传递的交汇点或共同通路,2-3,，但它在DN发生中的作用及其与MCP1关系仍不十分清楚;硒是机体必需微量元素之一，其缺乏可加 剧DN的氧化应激，并可产生拟高血糖病理状态，从而加剧DN的发生发展,4,.但其是否作用于p38MAPK和MCP1国内外未见文献报道.我们分别给予高葡萄糖(HG)、高胰岛素(HI)、过氧化氢(H2O2)和糖基化终末产物(AGEs)孵育HBZY1细胞，观察HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达以及亚硒酸钠对HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达的影响.从而明确二者在DN形成中的作用及硒在防治DN中的作用机制. 1材料和方法 1.1材料大鼠肾小球系膜细胞系(HBZY1，中国典型培养物保藏中心CCTCC);新生牛血清、RPMI1640培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)(北京中山生物技术有限公司);亚硒酸钠(KarolinskaInstitute赠送);柱离心式总RNA抽提试剂盒、RTPCR两步法试剂盒、PCR相对分子量(TaKaRa公司);PCR引物合成(上海博亚生物技术有限公司)，蛋白质相对分子量标记物(BioRad公司);磷酸化p38MAPK兔多抗((Pr omega公司). 1.2方法 1.2.1细胞系HBZY1的培养HBZY1细胞常规培养于200mL/LRPMI1640培养液中，培养条件为37?，饱和湿度50mL/LCO2，每2~3日用0.2g/L乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代.HBZY1细胞长满培养瓶底40%后分为9组，以无血清培养液饥饿24h,然后按实验分组加入刺激(及干预)因素. 1.2.2体外制备AGEs参考文献,5,，按牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)50g/L，与葡萄糖90g/L，0.5mmol/LEDTA及0.2mmol/LPBS(pH7.4)混匀后过滤除菌，37?恒温培养箱卵孵育60d.0.1mol/LPBS(pH7.4)中透析48h，测定蛋白含量及荧光强度，分装后存于-80?冰箱保存备用. 1.2.3实验分组分别以一定浓度HG,HI,H2O2和AGEs刺激细胞系HBZY1一定时间;先给予亚硒酸钠100nmol/L预处理HBZY1细胞48h后，再分别以上述4种刺激因素(浓度、时间同前)孵育HBZY1细胞，同时设对照组.分组情况如下:?对照组:用等体积PBS培养细胞;?HG组:用25mmol/L葡萄糖刺激HBZY1细胞72h;?HI组:用100nmol/L胰岛素刺激HBZY1细胞24h;?H2O2组:用100μmol/LH2O2刺激HBZY1细胞1h;?AGEs组:用100mg/LAGEs刺激HBZY1细胞6h;?亚硒酸钠+HG组:依次以100nmol/L亚硒酸钠和25mmol/L葡萄糖分别刺激HBZY1细胞48h和72h;?亚硒酸钠+HI组:依次以100nmol/L亚硒酸钠和100nmol/L胰岛素分别刺激HBZY1细胞48h和24h;?亚硒酸钠+H2O2组:依次以100nmol/L亚硒酸钠和100μmol/LH2O2分别刺激HBZY1细胞48h和1h;?亚硒酸钠+AGEs组:依次以100nmol/L亚硒酸钠和100mg/LAGEs分别刺激HBZY1细胞48h和6h. 1.2.4RTPCR法检测MCP1mRNA表达以柱离心式总RNA抽提试剂盒提取细胞系HBZY1总RNA，测定总RNA浓度，计算纯度，A260nm/A280nm均在1.8,2.0之间.MCP1引物序列按文献,6,:上 游引物:5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′;下游引物:5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′，扩增片段长度258bp.βactin引物序列:上游引物:5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′;下游引物:5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′，扩增片段长度228bp.以两步法RTPCR试剂盒进行反转录扩增，扩增条件:94?变性30s，55?退火1min,72?延伸1min,共35个循环，72?最后延伸7min.每次PCR反应至少重复3次.PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果经图象分析系统扫描存图，并对目的条带进行密度分析. 1.2.5Westernblot法检测p38MAPK蛋白表达培养的细胞系HBZY1，经4?胞浆蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4?离心10min，沉淀加入4?预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12000g4?离心30min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量.磷酸化p38MAPK表达量采用Westernblot法检测，核蛋白中加入等体积2×上样缓冲液煮沸5min.进行10mol/LSDSPAGE，将蛋白转至PVDF膜后用5g/LBSA室温下封闭2h，分别用1?2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4?孵育过夜，用PBS充分洗涤，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1?5000，37?孵育1h，用PBS充分洗涤，DAB显色试剂盒显色.结果经图象分析系统对目的条带进行扫描存图并进行密度分析. 统计学处理:资料采用SAS8.0进行统计分析，组间两两比较用非参数统计分析，P<0.05即认为有统计学差异. 2结果 2.1细胞系HBZY1MCP1mRNA表达细胞系HBZY1MCP1mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析，HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素使细胞系HBZY1MCP1mRNA表达量均明显增加(P<0.01，表1，图1). 表1各组细胞系HBZY1MCP1RTPCR和磷酸化p38MAPKWesternblot半定量结果(略) 2.2细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分，HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素激活p38MAPK，使细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01，表1，图2). 图1RTPCR法检测各组细胞系HBZY1MCP1mRNA和βactinmRNA表达(略) 图2Westernblot法检测各组细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白和βactin蛋白表达(略) 2.3细胞系HBZY1MCP1mRNA表达细胞系HBZY1MCP1mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.亚硒酸钠预处理后，再分别给予以上4种刺激因素孵育细胞系HBZY1，可见MCP1m RNA表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组明显减少(P<0.01，表1，图1). 2.4细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达的影响HBZY1细胞磷酸化p38MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半 定量分析.先以亚硒酸钠预处理细胞系HBZY1后，再分别给予上述4种刺激因素刺激细胞系HBZY1，可见磷酸化p38MAPK蛋白表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组显著减少(P<0.01)，但与对照组比较仍有显著差异(P<0.01，表1，图2). 3讨论 本研究结果显示HG,HI,H2O2和AGEs均可单独诱导细胞系HBZY1，使其MCP1mRNA表达量明显增加.4种刺激素诱导HBZY1细胞MCP1mRNA表达增加的机制，结合文献和实验结果我们认为有以下几点:?高糖有直接刺激MCP1mRNA及蛋白表达增高的作用，该作用是PKC，MAPKs所介导，这可能是DN时肾小球中单核巨噬细胞浸润的重要原因;?大量AGEs可以和系膜细胞上的AGEs受体(RAGE)相互作用，使IκB磷酸化而导致NFκB激活;新近的研究表明,8,，AGEs与AGEs受体(RAGE)相互作用可消耗细胞内谷胱甘肽，产生大量的氧自由基，从而导致细胞内信号传导改变，激活核转录因子NFκB/AP1.同时NFκB也是调节RAGE表达的一个启动子，它的位点1和位点2的激活可使RAGE表达上调，NFκB的激活作为一种正反馈，又进一步促进了AGEs与RAGE的结合，导致NFκB的持续活化，而活化的NFκB可以上调MCP1mRNA和蛋白表达，从而在糖尿病所致肾脏损害中发挥重要作用;?过氧化氢可导致系膜细胞氧化应激加剧，诱导细胞内ROS产生，从而迅速激活NFκB，上调MCP1表达，在DN发生发展早期起重要作用,8,;?HI可能是通过激活PKC，MAPKs信号通路，引起系膜细胞氧化还 原状态发生变化，使细胞内ROS产生增加，导致NFκB激活，从而使MCP1表达上调. MCP1介导糖尿病肾小球损伤.MCP1不仅对血液中单核细胞有很强的趋化活性，也能通过激活转录因子NFκB和AP1来诱导非炎症细胞产生细胞因子和黏附分子，在诱导单核细胞迁入内皮下间隙及渗入肾小球的过程中起重要作用,7-8,;同时，渗入到肾小球的单核巨噬细胞反过来又刺激局部肾小球细胞，在巨噬细胞衍化生长因子如PDGF和TGFβ等作用下导致系膜增生和细胞外基质聚集;此外通过炎症细胞因子作用，还可上调黏附分子和趋化因子的分泌，从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球,7,.近年来通过细胞实验及对人和实验动物DN的研究发现，MCP1在DN的发病机制中起重要作用. p38MAPK可被多种细胞外刺激激活，导致细胞生长、增殖、分化和调控某些因子表达,9-11,.本研究以糖尿病时存在的4种应激因素孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1，可见p38MAPK被激活，磷酸化表达增加. 硒是机体必需微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，缺硒可出现拟高血糖症病理状态，引起白蛋白尿和肾小球硬化，从而加剧DN的发生发展;补充硒不仅可预防氧化应激，而且可防止肾脏损伤,4,12,.本研究结果还显示，亚硒酸钠具有类似p38MAPK抑制剂所产生的作用，其机制可能是:?通过保护系膜细胞免遭氧化损伤而抑制MCP1的分泌;?通过抑制p38MAPK信号通路而抑制MCP1在系膜细胞的表达.表明亚硒酸钠可能通过抑制p38MAPK而延 缓DN的发生发展，但亚硒酸钠是否通过抗氧化而抑制p38MAPK亦 或作用于信号通路的其它环节尚需进一步深入探讨，提示硒在防治 DN发生发展过程中发挥着积极作用. 【参考文献】 ,1, BanbaN,NakamuraT,MatsumuraM,etal.PossiblerelationshipofmonocytechemoattractantprotEin1withdiabeticnephropathy ,J,.KidneyInt,2000,58(2):684-690. ,2, SakaiN,WadaT,FuruichiK,etal.Involvementofextracellularsignalregulatedkinaseandp38inhumandiabeticnephropathy,J,.AmJKidneyDis，2005， 45(1):54-65. ,3, XuZG,KimKS,ParkHC,etal.Highglucoseactivatesthep38MAPKpathwayinculturedhumanperitonealmesothelialcells ,J,.IntSocNep,2003,63(3):958-968. ,4, ReddiAS,BollineniJS.SeleniumdeficientdietinducesrenaloxidativestressandinjuryviaTGF〔beta〕1innormalanddiabeticrats ,J,.KidneyInt,2001,59(4):1342-1353. ,5, MakitaZ,VlassaraH,CeramicA,etal.Immunochemicaldetectionofadvanced glycosylationendproductsinvivo,J,.JBoilChem,1992,267:5133-5138. ,6,LynnEG,SiowYL,KarminO.VerylowdensitylipoprotEInstimula testheexpressionofmonocytechemoattractantprotEin1mesangialcells,J,.KidneyInt,2000,57(4):1472-1483. ,7, ChristianeV,RalphD,FEIJ,etal.MCP1inducesinflammatoryactivationofhumantubularepithelialcells:involvementofthetranscriptionfactors,nuclearfactor,kappa,Bandactivatingprotein1 ,J,.Nephrology,2002,13(6):1534-1547. ,8,HaHJ,YuMR,JinCY,etal.Roleofhighglucoseinducednuclearfactor,kappa, Bavtivationinmonocytechemoattractantprotein1expressionbymesangialcells,J,.JAmSocNephrol,2002,13(4):894-902. ,9, WilmerWA,DixonCL,HebertC.Chronicexposureofhumanmesangialcellstohighglucoseenvironmentsactivatesthep38MAPKpathway ,J,.IntSocNep,2001,60(3):858-871. ,10, DaiT,NatarajanR,NastCC,etal.Glucoseanddiabetes:Effectsonpodocyteandglomerularp38MAPK,heatshockprotein25,andactincytoskeleton,J,.KidneyInt，2006，69(5):806-814. ,11,张坚，李圣青，戚好文，等.p38MAPK在大鼠急性肺损伤 模型中的表达及抗氧化剂NAC的影响,J,.第四军医大学学报，2004， 25(15):1353-1355. ,12, ShengXQ,HuangKX,XuHb,etal.Newexperimentalobservationontherelatio nshipofseleniumanddiabetesmellitus ,J,.JBiolTraceElemRes,2004,99(13):241-254