巨噬细胞和视神经再生.doc

巨噬细胞和视神经再生.doc 巨噬细胞和视神经再生 【摘要】 视神经的再生主要是指视神经切断以后的再生反应。巨噬 细胞在视神经再生中的作用开始受到人们的重视。视神经小胶质细 胞/巨噬细胞具有吞噬和杀伤，合成和分泌多种活性因子的与视神经 再生的内环境密切相关的多种功能。注射巨噬细胞以及巨噬细胞调 理液能促进视神经再生。 【关键词】 巨噬细胞;视神经再生;视网膜小胶质细胞 ,Abstract, The meaning of optic nerve regeneration is the regrowth reaction after optic nerve amputation.People has attached importance to the effect of macrophages in optic nerve regeneration.Retinal neural microglia/macrophages have multiple functions of phagocytosis and destruction,synthesis and secretion of a variety of factors which are closely related to the optic nerve regeneration environment.Injection of macrophages and macrophage conditional medium can promote the optic nerve regeneration. ,Key words, macrophage;optic nerve regeneration;retinal neural microglia 视神经再生是指存活的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)生长出新的轴突到中枢神经系统的特定靶位置并恢复正 常功能,它包含四层含义:神经保护、轴突延长、与靶组织再联系、 功能恢复。视神经切断以后的再生反应现为“芽生”通过损伤的部 位到达远端的靶区。功能再生是指再生的纤维进入原来的或新的靶 组织，重新建立突触联系，恢复失去的功能。20世纪80年代以 前，人们普遍认为哺乳动物成熟的中枢神经细胞和周围神经不同， 损伤后无法再生，作为中枢神经系统一部分的视神经也不例外。直 到1980年Richardson等,1,研究发现绝大多数哺乳动物的中枢神 经细胞能够再生长入被埋植于大脑，脊髓或视神经内的周围神经移 植物中，并经过移植物到达靶区。这一发现推翻了以往的观点，显 示了中枢神经系统的神经细胞能够再生，成为中枢神经再生研究历 史上的里程碑。从此，人们对视神经再生的可能性和条件性进行了 广泛而深入的研究。 普遍认同的观点是，中枢神经系统受损后内环境的改变阻止了神 经细胞的再生。据推测,2~4,，这可能与神经细胞如星形胶质细胞 和少突细胞等受损后所引起的不适当反应有关，而此不当反应被认 为与巨噬细胞募集和增殖活化的延迟及受限所致。周围神经受损后 往往能引发有效的巨噬细胞激活与募集，从而自发地再生。 Schwartz等,5,指出其他组织恢复的原则同样适用于CNS包括视 神经，他认为，巨噬细胞在任何受损组织中都能发挥维持、恢复和 防御的基础作用，而巨噬细胞的募集(可能也包括激活)在导致再生的一系列事件中居于最上游的位置。在损伤的周围神经系统，再生可自然发生。其变性和再生似乎是由巨噬细胞介导和控制的。实验,6,7,发现大鼠晶状体受损后能使视网膜神经节细胞(RGC)的存活数量增加8倍，视神经新生轴突数增加100倍，并使得轴突生长入通常被抑制禁止的区域，其机制与神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)无关，而与激活的巨噬细胞有关。晶状体受损能刺激巨噬细胞激活和聚集，且在晶状体未受损时注射能激活巨噬细胞酵母聚糖A(Zymosan A)也促进了RGC轴突再生并长入远处视神经断端。因此，巨噬细胞在视神经再生中的作用开始受到人们的重视，巨噬细胞激活与聚集很可能是神经再生的关键步骤之一，对再生和成长支持的许多继发步骤有重大的作用。 1 巨噬细胞的起源和视网膜中的分布 1.1 起源 早在19世纪末俄国人Metchnikoff就观察到从海星幼体中胚层分离的一种具有阿米巴变形运动特点的细胞能够将颗粒性异物吞入细胞内，因此提出了吞噬(phagocytosis)这个概念,至20世纪70年代Van Furth以单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocytic systen,MPS)这一概念取代了网状内皮系统，而单核/巨噬细胞则是MPS的基本组成部分。单核/巨噬细胞是骨髓造血干细胞发育分化而来，在骨髓中经历多能干细胞-定向干细胞(髓样干细胞)-单核母细胞(monoblast)-前单核细胞(promonocyte)-单核细胞的发育过程。骨髓中的单核细胞成熟后进入外周血，血肿的单核细胞穿过学馆内皮细胞间隙进入组织则进一步发育分化为巨噬细胞，广泛分布于全身所有表皮和黏膜下组织，在防御感染，自身稳定和免疫监视中都起着重要作用，可抵抗细菌、真菌和病毒等病原体的感染以及清除凋亡细胞和突变细胞。 1.2 分布 巨噬细胞广泛分布于机体内，包括干的Kupffer细胞、结缔组织的巨噬细胞、肺的尘细胞、骨组织的破骨细胞及表皮的Langerhans细胞等。目前许多证据,8,表明小胶质细胞可能是从血液中单核细胞或多能单核前体细胞演变而来，是分布于神经组织包括视神经内的属于神经系统游走巨噬细胞中的一群。 视网膜小胶质细胞有两种类型:基质小胶质细胞和血管周围小胶质细胞。前者是在哺乳动物胚胎约第10周由血液单核细胞或其前体经睫状体扁平部进入视网膜转变而成，表面标志为CD45，MHC?，MHC?;后者是小胶质细胞在胚胎第14周从视神经乳头进驻视网膜后在血管周围形成，具有巨噬细胞表面抗原S22，CD68,9,。 2 巨噬细胞在视神经再生中的功能和作用 视神经再生的困难很多,主要有三个:(1)视神经横断伤后,,,会死亡。将成年大鼠的视神经在近眼球处横断,1周后,,,死亡50%,在1个月末时则达90%。(2)大部分成熟的横断后的,,,不会程序性地再开始轴突延长。(3)视神经内环境中的很多因子在横断伤后表达增加,对轴突生长起抑制作用;而且,许多营养因子缺乏也使轴突难以生长。因此,在神经保护使,,,存活的前提下,视神经再生的研究集中于制造一个适合的环境,主要有三方面,10,:(1)移除髓鞘及其产物如髓鞘相关糖蛋白等对轴突再生的抑制作用。(2)提供额外的神经营养因子,如:脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophin factor，BDNF)，神经营养因子4/5(neurotrophin-4/5，NT-4/5)，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF),酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)等。(3)促进轴突内在的生长潜能。 像所有吞噬细胞一样，视神经小胶质细胞具有吞噬和杀伤，合成和分泌多种活性因子等主要功能。而这些功能无一不与营造上述适合视神经再生的内环境有密切关系。 2.1 巨噬细胞的主要功能 2.1.1 吞噬功能 小胶质细胞在正常视网膜内一般处于静止状态，此时其氧耗量比较低，表面MHC-?类分子水平较低，很少甚至不分泌细胞因子。在损伤早期小胶质细胞即被微小的病理变化所激活后，如中枢神经系统炎症时小胶质细胞接受损伤信号刺激后立即以较快的速度向损伤部位迁移，并附着于受损神经元表面。若损伤轻微易修复则小胶质细胞不转变为吞噬型;若损伤严重则小胶质细胞将转变为吞噬细胞行使吞噬功能,11,。部分小胶质细胞在贴近受损神经细胞后会处于一种介于静止和激活之间的中间状态，它们会很快增殖，消化和降解微小生物，死亡的细胞及其他组织碎片，促进组织修复,12,。 视网膜小胶质细胞转变为吞噬型后能吞噬鞘磷脂,13,包括MAG，并将其分解后进入脂质降解产物的循环,14,。CNS髓磷脂是髓鞘的化学成分，是由成熟少突胶质细胞的质膜生长形成的，未成熟的少突胶质细胞无形成髓鞘的能力，发育过程中其在阻止神经发芽及稳定视通路的神经纤维轴突数中起了一定作用。用X线照射或用有丝分裂抑制剂有效抑制新生大鼠脊髓内少突胶质细胞的发生和形成髓鞘,则大鼠损伤后视神经可获成功再生,15,。体外实验证实髓磷脂连接蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)也具抑制神经细胞轴突生长的作用。MAG是含量很高的一种髓磷脂蛋白。1994年，Mclerracher等指出在试管内MAG能抑制神经突生长。 Eric等,16,用挤压后的15d鸡胚的视网膜-视神经移植物做实验。采用CALI法消除MAG的作用，使视网膜轴突明显再生越过了包含CNS髓磷脂的损伤区。电子显微镜观察到神经横断处有大量再生轴突越过断端裂口。在神经残端用衰退性标记横断的视神经，未发现有被标记的视网膜神经元，与未被切断的神经几乎毫无区别。这些结果表明CNM是一种重要的髓磷脂源性神经再生抑制成分。除去MAG作用可显著促轴突生长越过CNS损伤区。视网膜小胶质细胞可能是通过吞噬鞘磷脂包括MAG来促进轴突生长。 2.1.2 分泌神经营养因子 大量研究证实补充神经营养因子能改善神经再生的微环境，使视网膜神经元细胞避免损伤或死亡，促进神经再生及功能恢复。体外研究揭示，小胶质细胞/巨噬细胞可分泌生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，神经营养因子-3(neurotropM 3，NT-3)、转移生长因子(transfroming growth factor，TGF)等。Batchelor等,17,在体内实验中发现，激活的小胶质细胞能表达BDNF和胶质细胞源性神经营养因子。体外研究,18,表明，巨噬细胞分泌的物质有促进纤维增生和血管再生功能，然而未激活的巨噬细胞上清液并没有这种功能。激活的巨噬细胞可分泌100多种蛋白质分子，其生物活性影响到细胞生长与死亡以及免疫炎症反应的每一个方面。其分泌血小板衍生生长因子(,,,,),表皮生长因子(,,,),和胰岛素样生长因子(，,,-，)等能促进视网膜色素上皮细胞(,,,)增生,20,。Chamak等,21,发现鼠脑损伤早期会出现凝血酶致敏蛋白(一种细胞外基质蛋白)的积聚。它是由脑巨噬细胞合成和分泌的。从胚胎鼠脑分离的巨噬细胞可促进培养的CNS神经元的神经轴突生长和再生，这种作用可被凝血酶致敏蛋白抗体所抑制。他们认为，在发育或在病理情况下，巨噬细胞有助于轴突的生长或再生。Lotan等,22,发现视神经损伤后TNF和集落刺激因子1能明显增加侵入视神经的巨噬细胞的数量，而且TNF-α可改变视神经黏附神经元的性质，增强培养的PCJ 2细胞在其上的黏附。而这种神经元的黏附与轴突的再生能力相关。这些结果提示。在CNS损伤部位增加激活的巨噬细胞小胶质细胞的数量可能有助于增强一些有利于生长的神经营养因子、细胞因子和细胞外基质(如层粘连蛋白、凝血酶致敏蛋白)的分泌，提供一个有益于促进轴突再生的环境。Lin等,23,通过体内体外实验均发现在大鼠视神经损伤处聚集的巨噬细胞能分泌编码EphB3的mRNA并表达可组成EphB的蛋白分子，而EphB分子能提高大鼠视神经的再生功能。 2.2 巨噬细胞抑制因子 一些研究已指出与身体内的其他组织相比 (包括周围神经)，中枢神经受损后，巨噬细胞的募集功能受限，表现为巨噬细胞的缺乏和活性的抑制。事实上，在中枢神经系统内存在一个抑制巨噬细胞募集和激活的因子，而这可能是中枢神经不能再生的一个因素,24~27,,我们称之为内在的巨噬细胞抑制因子,28,。在正常视神经，星形胶质细胞和少突胶质细胞均表达阿朴脂蛋白,，在视神经横断后1周星形胶质细胞的阿朴脂蛋白,表达减少，而且侵入的巨噬细胞很少，可能的原因就是因为存在这种可溶性巨噬细胞抑制因子,29,。 2.3 与雪旺细胞的相互作用 神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，是参与损伤神经再生和功能恢复的重要因素。如果能提高神经损伤后局部合成、分泌NGF的水平，必将有利于神经再生。神经损伤后局部趋化的巨噬细胞能促进雪旺细胞分泌NGF，Heumann等,30,发现神经损伤后在体内试验中出现了NGF及NGFR-mRNA水平不同程度的增加，但在培养坐骨神经段则仅出现了NGFR-mRNA水平的增加，未出现NGF mttNA增加，但当在培养基中加入激活的巨噬细胞或应用巨噬细胞调理液进行培养时，NGFmRNA出现了类似于体内的增加合成，这提示NGF-mRNA在雪旺细胞内的表达增加是由巨噬细胞分泌的某种因子来进行调节的。Lindlaolm等,31,在培养基中加入白细胞介素-1(Interleukin- 1,IL-1)，得到了与加入激活巨噬细胞相同的结果，而巨噬细胞可以分泌IL-1，所以神经损伤后局部NGF的合成增加是由巨噬细胞分泌IL-1作用于雪旺细胞，从而引起NGF-mRNA增加合成并进行翻译而完成的。近年来研究发现，向培养雪旺细胞中加入转移生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF- β1)，结果NGF和NGFR-mRNA的水平均明显下降，并能激发雪旺细胞增生。巨噬细胞能合成和分泌TGF-β1，说明巨噬细胞除可对NGR-mRNA进行上调外，还可通过分泌TGF-β1对NcFmRNA进行下调，这进一步说明巨噬细胞对神经再生具有重要影响。 3 注射巨噬细胞以及巨噬细胞调理液 3.1 注射巨噬细胞 Schwartz,32~33,研究小组的一系列研究提示移植激活的自体巨噬细胞可有助于克服CNS再生障碍，促进轴突的再生，有利于脊髓功能的改善和视神经的再生。血管的形成和雪旺氏细胞的渗入也更明显，这使层粘连蛋白增高，为轴突再生提供了一个合适的基质。Lazarov等,34,通过实验证实在横断处植入活化的巨噬细胞可促进,,,轴突长入远端的视神经,他们切断视神经,但保留血供和神经鞘的完整，巨噬细胞在体外孵育时用坐骨神经碎片活化后以混悬液植入横断处，7~8周后4Di-10ASP逆行标记发现有轴突再生。Yuqin等,35,将雄性大鼠在视乳头处钳压2 mm,5 s后 制成视神经损伤模型。在其伤眼内损伤当日(A组)和3天后(B组)分别注射安慰剂PBS(n=4/每组)作为对照组，实验组在实验前7天(a组)和3天(b组)，损伤当日(c组)和损伤后3天(d组)，7天(e组)分别都注射酵母聚糖A(n=4/组)。提前7天注射酵母聚糖即可使局噬细胞水平大量增高并维持一至两个礼拜，而a组和b组未见能明显改善视神经再生水平，c组,d组平均能使受损侧神经生长4.7 mm，是a,b组的2倍，这提示并非巨噬细胞的数量决定了RGCs能否被刺激产生新的轴突和程度。d组是c组提高神经轴突再生水平的1.6倍(P=0.06),是B组的9倍(P<0.001)玻璃体内和视网膜内层表面可见ED-1阳性巨噬细胞。RGCs轴突和Somata的GAP-43表达明显上调，大量GAP-43阳性轴突越过受伤侧呈弧形沿视神经生长延长。E组未见损伤侧有轴突生长(与对照组比较，P,0.05)。体外实验,36,发现将切断后又重新连接的大鼠视神经浸浴在含有由坐骨神经孵育的巨噬细胞的溶液中,轴突能再生并通过断端。 3.2 巨噬细胞调理液(macrophage conditional medium，MCM) 将生后2~3天Swagae-Dawley大鼠视网膜组织经胰蛋白酶消化后进行培养，并设对照组。结果培养在鼠尾胶原上的视网膜神经细胞(retinal Neurol，RN)生长良好，且部分细胞伸出突起培养1、3、5天，MCM促RN存活率分别为40.7,、39.9,和51.2,。故认为MCM能明显促进培养RN的存活和生长，表明MCM中存在某些促进RN存活的营养物质,37,。 4 展望 一些动物实验在一定程度上说明了适度激活的小胶质细胞/巨噬细胞有利于CNS损伤后结构和功能的修复。调控小胶质细胞/巨噬细胞的功能将是未来应用小胶质细胞/巨噬细胞作为一种治疗视神经损伤手段的方向。 【