毛冬青药材的指纹图谱Я

毛冬青药材的指纹图谱Я ? ? 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (4): 16 1 毛冬青药材的指纹图谱 11,2*331余成霞, 柳文媛, 冯 锋, 谢 宁, 丁 黎 (1. 中国药科大学 药物教研室; 2. 药物质量与安全预警教育部重点实验室; 3. 天然药物化学教研室, 南京 210009) 摘要: 研究毛冬青药材的高效液相色谱指纹图谱, 为科学评价和有效控制其内在质量提供可靠。毛冬青 药材指纹图谱HPLC-UV分析条件如下: Lichrospher C (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) 色谱柱; 流动相为乙腈磷18 酸溶液梯度洗脱, 检测波长为210 nm。根据色谱峰的紫外吸收光谱特征, 可将毛冬青药材的指纹图谱分为2个 区域: 第一个区域的保留时间为5,35 min, 共9个主要色谱峰, 主要为木脂素类成分; 保留时间在35,80 min 的色谱峰为第2区, 共7个主要峰, 多为皂苷类类成分。所建立的液相色谱指纹图谱特征性和专属性强, 可作为 毛冬青药材内在质量控制的有效方法。 关键词: 毛冬青; 高效液相色谱; 指纹图谱 中图分类号: R917 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2009) 04-0888-06 Studies on Fingerprint of Radix Ilicis Pubescentis 11,2*331YU Cheng-Xia, LIU Wen-Yuan, XIE Ning, FENG Feng, DING Li (1. Department of Pharmaceutical Analysis; 2. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance, Ministry of Education; 3. Department of Natural Medicinal Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China) Abstract: To establish a high performance liquid chromatographic fingerprint for the quality control of Ra- dix Ilicis Pubescentis, a traditional Chinese medicine derived from the root of Ilex pubescens Hook. et Am. The fingerprint was established by HPLC-DAD technique. Experiments of chromatographic fingerprint analysis were carried out using a Lichrospher C (250 mm ， 4.6 mm, 5 µm) with a Hanbon Lichrospher C (50 mm ， 4.6 mm) 1818 guard column, the mobile phase consisted of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid in gradient elution mode. Chromatographic display wavelength was set at 210 nm. DAD acquisition wavelength range was set from 200 to 400 nm. The established HPLC fingerprint is highly specific, and can be used to evaluate the quality con- sistency of different Radix Ilicis Pubescentis herbs. Key words: Ilex pubescens Hook. et Am.; HPLC-DAD; Fingerprint [1]毛冬青 (Radix Ilicis Pubescentis) 为冬青科 探讨。 [1, 2](Aquifoliaceae) 冬青属植物毛冬青 (Ilex pubescens 关于毛冬青的化学成分, 目前报道有齐墩果 烷型和乌索烷型三萜酸及其苷类、黄酮类、木脂素类、Hook. et Am.) 的干燥根, 是我国南方常用中药, 已 酚酸类、脂肪酸和糖脂类等化合物, 其中三萜皂苷类有多种成方制剂收载于部颁, 如毛冬青胶囊 被认为是其主要活性成分。据报道从毛冬青提取得到 (WS3-B-1290-93)、毛冬青注射液 (WS3-B-3786-98) 18-去氢乌索酸, 经琥珀酰化合成了五环三萜类心血及复方毛冬青氯贝酸铝片 (WSI-XG-2002) 等, 主要 管新药毛冬青甲素 (ilexonin A, 简称 IA), 基础药理用于循环系统疾病, 有扩张血管及抗菌消炎作用, 对 研究显示:IA具有扩张冠状动脉和外周动脉, 加强心于冠心病、脉管炎和血栓性疾病的疗效确切, 尤其在 肌收缩力, 提高心输出量, 减慢心率和保护缺血性心抗血栓方面具有独特的作用机制, 值得深入研究和 ? ?2 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (4): 16 [3, 4] 肌的作用。 目前, 毛冬青的整体研究尚不深入, 由于缺乏合材料与方法 理、完善的质量控制方法, 使得市售毛冬青不但品种仪器 Agilent 1100 LC-DAD系统, 含在线真空混乱, 化学成分和药理作用差别较大。从而导致毛冬脱气机、高压四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、青制剂的质量难以进行有效控制, 例如毛冬青中不二级管阵列检测器 (DAD)。 含芦丁, 但大多数毛冬青制剂却以芦丁为指标成分试剂 乙腈 (色谱纯, 美国Merck公司); 甲醇、[5][6]测定总黄酮; 刘启德等以毛冬青甲素为外标, 对磷酸均为分析纯; 水为超纯水。 毛冬青根脂溶性部分中三萜类的含量进行测定, 但药品 毛冬青对照药材 (No. 1), 购自中国药品毛冬青中并未分离得到以毛冬青甲素为苷元的三萜生物制品检定所 (批号: 121140-200502)。毛冬青药材皂苷类成分, 因此上述方法均缺乏专属性。从而导致分别来自广西 (No. 2, 3, 8)、江西 (No. 4, 5)、广东 毛冬青制剂的质量难以进行有效控制, 例如毛冬青(No. 6, 9)、湖南 (No. 7) 和江苏 (No. 10), 见表1, 均中不含芦丁, 但大多数毛冬青制剂却以芦丁为指标经中国药科大学中药学院谢宁副教授鉴定为毛冬青 [5][6]成分测定总黄酮; 刘启德等以毛冬青甲素为外标, 药材。对照品acanthoside B, liriodendin, magnolenin C, ilexoside O, ilexsaponin B, ilexsaponin B, ilexsa- 对毛冬青根脂溶性部分中三萜类的含量进行测定。也21 [7]ponin A, ilexgenin A 均由中国药科大学天然药化教1有文献测定了毛冬青药材中neopubescensin含量, [7]研室制备, 纯度,98.0%, 其结构通过UV, IR, MS和也有文献测定了毛冬青药材中neopubescensin含量,[9, 13][8]NMR数据与文献数据对照进行确证, 结构见图1。以及采用HPLC法测定不同品种毛冬青色谱图, 但 未将药材中各组分实现有效分离, 亦未提供各色谱 方法与结果 峰的有关结构信息。 1 对照品溶液的制备 显然现有的方法很难全面反映毛冬青药材的内 分别精密称取上述 8种对照品适量, 加甲醇制在质量, 无法为药效物质基础研究提供依据。本文 ?1成木脂素类和皂苷类浓度分别约为20和200 ,g?mL 采用RP-HPLC梯度洗脱方式建立了毛冬青药材的 色谱指纹图谱, 采用与对照品进行色谱对照并结合 LC-DAD法鉴定了其主要特征峰, 对来自不同产地 的10种毛冬青药材的进行指纹图谱测定, 计算其与 对照药材指纹图谱的相似度, 对药材的质量进行评 价。该研究内容, 尚未见文献报道。 ? ? 赵广才等: 灌水对强筋小麦籽粒产量和蛋白质含量及其稳定性的影响 3 Figure 1 Chemical structures of the constituents identified in The peak numbering refers to theRadix Ilicis Pubescentis. chromato-grams shown in Figure 2. 的溶液, 经0.45 μm微孔滤膜滤过, 即得。注入液相色谱仪, 按“色谱条件”项所述条件操作, 记录80 min色谱图。2 供试品溶液的制备 取药材粉末 (过100目筛) 1.0 g , 精密称定, 精2 参照峰的选择 取药材供试品溶液, 按色谱条件进样分析, 得药密加入甲醇10 mL, 称定重量, 超声处理60 min, 放 冷, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤材的HPLC指纹图谱 (图2C)。在供试品图中选择峰过, 精密量取续滤液1 mL , 置5 mL 量瓶中, 加甲醇面积较大、保留时间适中且稳定的7号色谱峰作为参稀释至刻度, 摇匀, 经0.45 μm微孔滤膜滤过, 即得。照峰。 3 方法验证 3 色谱条件 在以下研究中, 均以各供试品色谱图中7号色谱色谱柱: Lichrospher C(250 mm × 4.6 mm, 5 18 峰保留时间和峰面积积分值为参照, 计算主要色谱µm); 保护柱: C (50 mm × 4.6 mm); 流动相:溶剂A 18 峰的相对保留时间和相对峰面积。(乙腈) 与溶剂 B (0.1%磷酸溶液) 梯度洗脱, 梯度 洗脱程序为: 0,3 min , 溶剂A 0,5%; 3,5 min, 溶3.1 空白实验 按供试品溶液的制备方法制得空白剂A 5%,10%; 5,35 min, 溶剂A 10%,30%; 35,溶液, 精密吸取20 ,L, 注入液相色谱仪, 照上述色60 min, 溶剂A 30%,40%; 60,70 min, 溶剂A 谱条件测定, 结果见图2A。结果表明无杂质峰干扰, 40%,60%; 70,80 min , 溶剂A 60%,90%; 流保留时间位于0,3 min为溶剂峰。 ,1速:1.0 mL?min; 柱温:25 ?; 进样量:20 μL。检测波3.2 精密度实验 取同一批供试品溶液, 连续进样长:210 nm; DAD波长采集范围 200,400 nm; 以5次, 每次进样20 ,L, 记录色谱图, 计算各主要色谱ilexgenin A (冬青素A) 的色谱峰计算色谱柱理论塔峰相对峰面积的RSD在0.7%,1.9%之间, 相对保留板数为3 000。 时间的RSD在0.6%,1.5%之间, 结果表明仪器的精4 检测波长的选择 密度良好。 采用二极管阵列检测器对毛冬青指纹图谱的检3.3 重复性实验 取同一批供试品5份, 按“供试 品溶液的制备”方法制备并测定, 结果各主要色谱测波长进行选择, 对比了210, 245和320 nm情况下 峰相对峰面积的RSD在0.9%,1.7%之间, 相对保留的色谱峰。结果表明, 检测波长为210 nm时色谱图 时间的RSD在0.5%,1.5%之间, 结果表明方法重复所包含的信息量较大, 各色谱峰分离较好。 性良好。 5 提取条件的选择 3.4 稳定性实验 取同一批供试品溶液, 在0, 4, 12, 毛冬青药材的提取主要考察以下几个方面:提取 24, 48 h进样分析, 记录色谱图, 结果各主要色谱峰溶剂 (95%乙醇、甲醇、75%甲醇、和乙酸乙酯)、提 相对峰面积的RSD在1.0%,1.5%之间, 相对保留时取方式 (温浸、热回流、超声)、提取时间 (20, 40, 60, 间的RSD在0.5%,1.5%之间, 表明样品在48h内稳80 min)。最终采用本文提取条件，其操作简单快速， 定。 且提取完全。 4 样品测定 6 流动相的优化 取10批供试品, 按“供试品溶液的制备”项下毛冬青药材成分复杂, 其中五环三萜类具有末供试品制备方法制备并测定, 记录色谱图, 见图3。 端吸收, 故有机相采用乙腈, 因其主要成分结构中多5 指纹图谱相似度分析 具羟基或羧基, 故流动相添加磷酸, 色谱峰对称性良以药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度好。经过对流动相的组成、比例和洗脱方式等参数的评价系统2004A版”对所得的HPLC指纹图谱相似度考察和优化, 以本文所采用的检测条件和梯度洗脱计算, 以对照药材色谱图为参照谱, 将多个色谱图进程序能将毛冬青药材甲醇提取液中各成分在 80 min 行多点校正后进行比较。结果见表1。 之内洗脱, 且各组分均能得到良好的分离, 见图2C。 由表1结果可见, 除采自广西和江西的三批药材 (No. 2, No. 4, No. 8) 与对照药材有较好的相似性外 指纹图谱的建立 (相似度>0.95), 其余药材与对照药材的指纹图谱差1 指纹图谱的制备 异比较大(相似度,0.7,。因此在使用毛冬青药材时, 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 ,L, 可以优先考虑产自广西和江西的药材, 与对照药材 ? ?4 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (4): 16 5,35 min), 在DAD第I区共有9个主要色谱峰 (R差别较大的药材, 可否作为合格药材使用还需进一t 图上大多显示有明显的UV吸收峰, 最大吸收波长位步结合指纹图谱和药效学试验进行研究。 于245 nm和320 nm左右, 与文献报道毛冬青中木脂6 对照药材主要色谱峰的鉴定 素类成分的紫外吸收特征相符, 因此该区域的色谱取对照药材供试品溶液和混合对照品溶液, 按 峰应以木脂素类为主。其中t 19.90 min 的色谱峰与色谱条件进行HPLC分析, 得混合对照品和对照药材R 丁香脂素-4,4′-O-β-D-双葡萄苷对照品的保留时间相的HPLC色谱图 (图2B, 图2C)。根据各色谱峰保留 时间和紫外吸收光谱特征确定了对照药材指纹图中符; t 22.87 min的色谱峰与广玉兰赖宁苷C对照 R 各主要峰归属, 并利用二极管阵列检测器对上述峰品的保留时间一致; t 26.97 min的色谱峰与无梗 R 进行了峰纯度鉴定, 各已知成分的峰纯度均符合要五加苷B对照品的保留时间一致。故确定峰4为丁求。 香脂素-4,4′-O-β-D-双葡萄苷 (liriodendin), 峰6为 广玉兰赖宁苷C (magnolenin C), 峰7为无梗五加苷Table 1 Similarity (S) of different samples B (acanthoside B)。 Sample DS Source Collection Date 第II区 (R 35,80 min) 共有7个主要色谱峰, t 1 1 reference 2007 除了11号峰显示木脂素类成分的UV特征外, 其余 2 0.95 Guangxi 2006 色谱峰的DAD图均无明显的吸收峰, 因此推测此区 3 0.37 Guangxi 2006 域以皂苷类成分的色谱峰为主。t 38.77 min 的色谱R4 0.96 Jiangxi 2006 峰与冬青苷O对照品的保留时间相符; t 55.83 min R5 0.28 Jiangxi 2007 的色谱峰与毛冬青皂苷B对照品的保留时间一致; t 2R6 0.63 Guangzhou, Guangdong 2007 58.12 min的色谱峰与毛冬青皂苷A对照品的保留时17 0.64 Changsha, Hunan 2007 间一致; t61.43 min的色谱峰与毛冬青皂苷B对照R 18 0.96 Wuzhou, Guangxi 2007 品的保留时间相符; t 74.75 min的色谱峰与文献报R9 0.16 Zhuhai, Guangdong 2007 道冬青素A对照品的保留时间一致。故确定峰10为10 0.24 Nanjing, Jiangsu 2007 冬青苷O (ilexoside O), 峰12为毛冬青皂苷B 2 (ilexsaponin B), 峰13为毛冬青皂苷 A (ilexsaponin 21 A), 峰14为毛冬青皂苷 B (ilexsaponin B) 和峰16111 为冬青素A (ilexgenin A)。 Figure 3 The HPLC fingerprints of methanol extracts of 10 batches of Radix Ilicis Pubescentis from different places. 1: No.10 Figure 2 The chromatogram of blank solvent (A), references (B) sample; 2: No.3 sample; 3: No.7 sample; 4: No.9 sample; 5: No.5 and methanol extracts of No.1 sample (C)sample; 6: No.1 sample; 7: No.2 sample; 8: No.4 sample; 9: No.8 sample; 10: No.6 sample 由结果可知:依据主要色谱峰的DAD特征, 毛冬 青对照药药材的HPLC图谱可划分为 2个特征区域: ? ? 赵广才等: 灌水对强筋小麦籽粒产量和蛋白质含量及其稳定性的影响 5 理、充分地利用毛冬青资源提供科学依据。讨论 比较各批药材的指纹图谱可见, 不同地区的药References 材之间化学成分有较大的差异, 如, 虽然大部分药材 [1] Fen S, Zhang BK. Developments of nasal delivery formulation (No.1, 2, 4,9) 提取液中均以木脂素类为主要色谱[J]. China Pharm (中国药房), 2007, 18: 625627.峰, 皂苷类的峰面积较小。但在木脂素类的种类及含 量上有较大差异。而购自广西 (No.3) 和江苏南京 [2] Ding WM, Li M, Li GL. New developments of nasal delivery (No.10) 的药材中, 色谱峰的数目较少, 但皂苷类成system [J]. Chin J New Drugs (中国新药杂志), 2005, 14: 分色谱峰的的相对峰面积较高。另外, 来自于同一地413416. 区的药材, 质量也存在较大的差异, 如来自广西的三[3] Wang DX, Gao YL, Yun LH. Advances on brain-targeted 批药材中, 不仅No.2和No.8药材指纹图谱相似度高, nasal delivery system [J]. Chin J New Drugs (中国新药杂而且它们与对照药材指纹图谱也表现出较高的相似志), 2005, 14: 135140. [4] He W, Zeng FD. Effect of breviscapine on ischemic cerebro-性。但是, 来自广西的药材No.3在化学成分的种类 vascular disease and its clinical investigation [J]. Chin J Clin 及含量上与前两者有很大差异。这些差异的形成可能 Pharm (中国临床药理学杂志), 2002, 12, 18: 458461.与原产地、采收期及贮存等因素有关。 作为我国南方常用中药, 如何评价和控制其质[5] Pan LY, Che QM, He H. Study on pharmacokinetics of scu-量, 是一个亟待解决的问题。毛冬青药材中的化学成tellarin in rats [J]. Chin Pharm J (中国药学杂志), 2006, 41: 分种类较多, 除了木脂素和皂苷外, 也有黄酮及酚酸689692. 类衍生物的报道, 但其药效活性的物质基础尚无明 确结论, 故有必要对不同产地药材进行心血管方面 的活性测试, 结合指纹图谱进行综合评价, 从而为合